植物转化方法 本发明提供一种以农杆菌介导转化植物尤其是转化单子叶植物的方法。
本发明涉及植物转化，尤其是谷类的转化，具体地说，涉及根癌农杆菌或其它农杆菌(在此都称为“农杆菌”)的用途。至今，只能用直接转化法来生成转基因谷类植物。为此，最普遍认可的是粒子枪轰击法。最近，有报道称，某些谷类可用农杆菌进行基因改造(Hiei等，植物分子生物学(1997)35：205-218)；Ishida等，自然生物技术(1996)14：745-750；Cheng等，植物生理学(1997)115：971-980；Tingay等，植物杂志11：1369-1376(1997))。
文献中报道的转化率对不同的谷类变化很大。典型的如高度依赖于基因型的玉米系统，其转化率很低。对于稻米的转化率据报道也较低，对小麦的转化率尤其低。在以上系统中，都是将农杆菌体外用于正在去分化或已经去分化的分离组织。
如上所述，已经有了对用于稻米(Hiei，1997)，玉米(Ishida，1996)，小麦(Cheng，1997)和大麦(Tingay，1997)的农杆菌转化系统的报道。这些方法的一项共同特征是从供体植株分离获得外植体(以未成熟的胚或胚形成性愈伤组织为佳)，并用农杆菌体外接种。
Hess及其同事(植物科学72：233-244，1990)曾尝试将农杆菌接种到小麦的小穗来转化小麦。其目的是通过花粉的转化来传递基因，然后通过正常授粉获得转化的种子。其中没有或没有提及从接种后的小穗分离出组织然后在培养基中筛选并再生。
另有报道通过苗端接种进行玉米和稻米的农杆菌转化(Gould J(1991)植物生理学95：426-434；Park SH(1996)植物分子生物学32：1135-1158)。同样，其目的仍是通过转化繁殖细胞获得转化的种子。这种再生途径不同于本发明方法：实际上，此类方法的一项特殊目地是避开所有经历组织去分化和偶然性再生的植物再生方法。
美国专利5,177,010和5,187,073(Goldman等)描述了一种转化玉米和禾本科的方法，包括造成新出籽苗创伤，用农杆菌接种。同样，该方法的目的是转化籽苗中的繁殖细胞，从而在天然植株中形成繁殖器官，并由此回收转化的花粉。
另一种方法是试用农杆菌转染法来转化谷类。美国专利5,569,597(Grimsley等)描述了一种用农杆菌将病毒DNA导入植株的方法。将玉米斑纹病毒的DNA插入农杆菌的T-DNA，然后用此携带病毒DNA的农杆菌接种玉米的籽苗，如果出现疾病症状，则表明病毒在植物细胞内繁殖。因此，农杆菌在此作为将病毒DNA引入植物的载体，病毒可由此引起系统性感染。然而，没有证据表明农杆菌转染能获得病毒DNA进入植物基因组的植物转化。该专利的转化仍以分生组织为目标，以获得转化的繁殖细胞为目的。
在本发明的新方法中，靶组织在其天然植株环境中被接种以农杆菌并共培养。如此，靶组织仍可按照正常的生理和时序途径发育。然后，从其正常环境中分离出靶组织，由去分化和再生途径形成转基因植物。所示转基因植物以能育的为佳。
本发明中，“处于其天然植株环境”包括靶组织能够按照基本正常的生理和时序途径发育的所有情形。这些情形包括靶组织处于体内，靶组织仍在植株之内、之上或与之相连(例如，靶组织是半裂分蘖上种子内的胚)，或靶组织仍处于与其在植株上时相同的细胞环境中(例如，靶组织是分离的种子或其部分中的胚)。其它例子包括仍在叶鞘内或至少仍与植株相连的未成熟花序，或仍在未开花蕾中的未成熟花药。
去分化指细胞簇，例如愈伤组织表现出无序生长。
除靶组织处于与其在植株上时相当的环境之外，农杆菌也处于更似其天然环境的环境中。因此，农杆菌转化靶组织的效率很可能高于现有技术在培养皿中所进行的。
以上两因素的结果之一是将所需转基因导入靶组织的转化率更高，因此生成转基因植物的转化率也更高。
大多数转化方法中的基本步骤之一是造成靶组织创伤。就农杆菌而言，这可能出于两个理由：暴露出对转化产生应答并能够再生的细胞，(尤其对禾本植物来说)和诱导农杆菌传递其T-DNA。一种已公开的用于小麦的无创伤方法仍用到一种润湿剂(Silwet或普卢兰尼克酸)或真空抽滤(WO97/48814)。所有以上方法都不可避免地有组织损伤，并因而降低再生能力。
在本发明的优选实施方式中，靶组织内表现的创伤被保持在最低水平，或完全没有一虽然可能用到润湿剂，但这并不是必须的。在传递过程中可能出现组织的潜表损伤，但即使此时，作为农杆菌作用目标的大部分可再生细胞仍是完好的，其再生能力不受影响。
根据本发明，农杆菌接种最好能用合适的传递工具(例如Hamilton注射器等)将农杆菌悬浮液施于靶组织。
根据本发明，形成了一个涉及对靶组织感染的，用农杆菌转化植物(以谷类为佳)的系统。已证明，该系统效率高，而且重复性好。
靶组织可以是任何组织，这些组织然后可使之处于组织培养期并再生成植株。根据本发明，特别适合的靶组织包括胚、花序、子房、叶基或花药。这些胚、花序、子房或花药最好是未成熟的。
在另一优选实施方式中，当靶组织是胚时，接种的目标区域是紧密接触的两层细胞之间的界面，即胚乳的发育盾片表面和连接性淀粉薄壁组织。将农杆菌向该界面传递时必须尽可能避免损伤靶组织，使其再生能力不受影响。根据本领域目前所知，如此高效且具有再现性的技术是不可预见的。
在本发明的转化方法中，靶组织用农杆菌接种，并与之共培养。然后，通过靶组织的去分化和再生形成转基因植物。因此，在接种和共培养后，应使靶组织去分化。然后可按照本领域已知的标准方法，由该去分化组织获得植株。在接种和共培养后，宜将靶组织转移到一个更适于去分化和再生的环境中。因此，靶组织的去分化至少部分(继接种和培养之后)在体外进行的。植株再生也以体外进行为宜。
本发明方法出人意料的特征之一在于由同一分离的外植体常能产生多转化结果。现有技术中(Gheng等，1997)，来自同一外植体的所有植株通常被认为是同一特定结果的克隆。在本发明方法中，这一假设不成立，一个外植体常会产生数种植株，根据Southern印迹分析，各自具有不同的整合方式。对此，一种解释(但不应将此理解成对本发明的限定)可能是因为大多数可再生细胞在接种农杆菌之前没有创伤。能够继续发育的细胞内发生T-DNA转移的几率更高。
通常被认为是关键的谷类转化特征之一是在接种和/或共培养培养基中加入Agrobacterium vir诱导剂进行农杆菌诱导(Hiei等，1997，Cheng等，1997)。此类诱导剂包括乙酰丁香酮，香草醛，阿魏酸，儿茶酚和丁香酸。本发明展示的是在谷类中不需要诱导剂的成功农杆菌转化。具体地说，不用诱导剂而获得了农杆菌转化小麦的成功，证明诱导剂并非有效T-DNA传递所必需。当本发明的靶组织是未成熟胚而提供其天然植物环境的是未成熟种子时，本发明认为农杆菌似乎被未成熟胚细胞充分地自然诱导。对此，一种可能的解释(不应将此理解成对本发明的限定)是：是靶组织附件或周围形成“天然植物环境”的细胞引起了农杆菌诱导。将胚从其天然植株环境中分离出来使得靶组织无法获得有助于农杆菌诱导的物质。
本发明能够将所需转基因或异源核酸导入植物组织，并能够获得能育转基因植物。这对于生成转基因单子叶植物来说特别有用，因为已知方法难以用于单子叶植物，而且转化率低。合适的单子叶植物包括芦笋，洋葱，油椰，山药，香蕉，尤其是各种禾本科植物，特别是谷类(即果实被用作人类食物的禾本科植物)，例如小麦，大麦，玉米，稻米，黑麦，高粱和粟。
本发明方法也可用于双子叶植物，尤其是已有或可形成组织培养系统，包括愈伤组织期的那些。合适的双子叶植物包括葡萄，豌豆，胡椒，大豆，向日葵，甜菜和葫芦，以及橡胶、松树和桉树等树木。
本发明的异源核酸指一般不存在于农杆菌T-DNA或待转化植株中的核酸。在此，异源核酸一词包括所有可通过基因工程导入植物的化学合成及生物衍生的基因，包括但不限于非植物基因，改造基因，合成基因，部分基因，以及各种植物的基因。所示异源基因最好含有某种蛋白质或多肽的编码区或感兴趣的反义分子，并在其两侧含义促进其在所得单子叶植物中表达的调控序列。
构建可成功转化植物的异源核酸的方法是本领域所公知的，这些方法也可用于产生本发明的异源核酸。本发明参考的Weising等(1988)(遗传学年报22：241)描述了合适的组件，包括启动子、聚腺苷酸化序列、选择标记基因、报道基因、增强子、内含子等，并提供了以上组件合适的组合。Sambrook等(1989)(分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor，NY)提供了合适的构建方法。
通常，含异源基因的质粒较小，即小于30kb，为的是尽可能降低对物理、化学或酶降解的易感性，这种易感性会随基因增大而提高。
本发明适用的转基因或异源核酸包括所有可提供或改善所得转基因植物有利特征的核酸。例如，所示核酸可能编码蛋白质或反义RNA转录产物，为的是提高食用价值、产量、抗虫性、抗病性等。代表性核酸包括，例如，增加赖氨酸的细菌跳跃A基因；抗虫害的Bt-内毒素基因或蛋白酶抑制剂；提供抗病性的溶胞肽基因，抗草甘膦(glyphosate)除草剂的细菌或植物EPSPS(美国专利4,940,835，5,188,642，4,971,908，5,145,783，5,312,910，5,633,435，5,627,061，5,310,667，WO97/04103)；抗HPPD-抑制剂除草剂的细菌或植物HPPD(WO96/38567，WO98/02562)，抗真菌的抗草胺膦(glufosiante)、几丁质酶或内切葡聚糖1，3-葡糖苷酶的bar或pat基因。而且，可将核酸导入作为产生突变株的基因工具，和/或协助对植物基因节段的鉴定、标记或分离。
适用于改善品质的基因例如：淀粉生物合成基因或降解基因，如淀粉合成酶、淀粉分支酶(如小麦的SEBI，SEBII，SSSI和DBEI，参见WO99/14314)，和稻米储存蛋白基因，如麦谷蛋白亚基(参见WO97/25419)，麦醇溶蛋白，大麦醇溶蛋白的基因。人造雄性不育基因(参见EP-A-0344029)和PR-葡聚糖酶(WO92/11379)在合适启动子的调控下也可用于产生杂交种子。还可以导入基因用于在植物内生成药学活性化合物，或提高植物的营养价值(生物制药和功能性食品)。
其它例子可参见前述Weising的论文。
含有待导入植物的异源核酸的质粒一般含选择标记或报道基因或两者都有，以便于鉴定和选择被转化的细胞。也可以由另一载体携带选择标记，并用共转化方法。选择标记和报道基因的两侧都可以是用于实现植物内表达的合适调控序列。有用的选择标记是本领域所熟知的，例如抗生素或除草剂抗性基因。具体例子可参见前述Weising的论文。优选选择标记之一是提供磺酰胺抗性的sul基因(EP-B-0369637)。其它已知选择标记包括大肠杆菌的潮霉素B磷酸转移酶(hpt)编码序列，转座子Tn5(AphII)的氨基葡糖苷磷酸转移酶，它编码对卡那霉素、新霉素和G418的抗性，以及编码对草甘膦、双丙氨酰膦(bialaphos)、氨基蝶啉、咪唑啉酮、磺酰脲、溴苯腈(bromoxynil)、dalapon等抗性的基因。提供除草剂抗性的基因也具有生成转化植物的商业用途。
编码易于分析的标记蛋白质的报道基因是本领域所熟知的。通常，报道基因是受体生物或组织没有或不表达的基因，它所编码蛋白质的表达可表现为表型变化或酶活性等易于测得的特性。此类基因的例子参见前述Weising的论文。优选的包括大肠杆菌Tn9的氯霉素乙酰转移酶(cat)基因，大肠杆菌uidA基因座的β-gluronidase(gus)基因，维多利亚多管水母(Aequoria victoria)的绿荧光蛋白(GEP)基因，和photinus pyralis的萤光素酶(luc)基因。
有用的调控序列包括能在特定植物细胞内表达的各种组成型、诱导型、组织或器官特异性、或发育节段特异性启动子。合适的此类启动子参见前文Weising等的论文。以下是一系列本发明适用的启动子：根癌农杆菌T-DNA的调控序列，包括甘露氨酸合成酶，胭脂氨酸合成酶，和章鱼氨酸合成酶的调控序列；玉米醇脱氢酶启动子；光诱导启动子，例如多种物种的核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因和主要叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；组蛋白启动子(EP507 698)，肌动蛋白启动子；玉米遍在蛋白1启动子(Christensen等(1996)转基因研究5：213)；烟草花叶病毒的35S和19S启动子；发育调节启动子，例如玉米的蜡质(waxy)、玉米醇溶蛋白或铜启动子；以及其它诱导型或组成型合成或其它天然启动子，包括表现为器官特异性表达或在植物特定发育节段表达的启动子，如美国专利5,635,618所述的α-微管蛋白启动子。
所述核酸还可以含有内含子、增强子、聚腺苷酸化序列等元件。这些元件必需与基因构建物的其余组分相容。这些基因可能是基因功能所必需或非必需的，但它们可以通过影响mRNA的转录、稳定性等来改善基因的表达或功能。核酸可根据需要包含这些元件，以优化转化基因在植物内的表现。例如，可将玉米AdhIS第一内含子置于启动子和某特定异源核酸之间。已知，该内含子含于基因构建物中时常能提高某种蛋白质在玉米细胞内的表达(Callis等(1987)基因发展1：1183)。其它合适的内含子包括玉米的shrunken-I基因(Maas等(1991)植物分子生物学16：199)；蓖麻豆过氧化氢酶(cat-1)基因第一内含子(Ohta等(1990)，植物细胞生理学31：805)；ST-LSI的马铃薯过氧化氢酶第二内含子(Vancanneyt等(1990)，分子基因遗传学220：245)；烟草黄萎病毒DSV内含子(Morris等(1992)病毒学187：633；稻米肌动蛋白-1(act-1)内含子(McElroy等(1990)植物细胞2：163)；和丙糖磷酸异构酶(TPI)内含子1(Snowden等(1996)植物分子生物学31：689)。然而，没有内含子常常也能获得令人满意的选择标记的充分表达(Battraw等(1990)植物分子生物学15：527)。
含异源基因的质粒还可以含有编码转运肽的序列，用于将异源基因所编码的蛋白质运到植物细胞的叶绿体内。此类转运肽是本领域所熟知的，包括单转运肽和至少两种转运肽的编码序列重组而成的多转运肽。优选的转运肽是美国专利5,635,618所述的优化转运肽，它在转录方向上含有一段第一DNA序列，编码第一叶绿体转运肽，第二DNA序列，编码自然进入叶绿体的某种成熟蛋白的N末端区，和第三DNA序列，编码第二叶绿体转运肽。
为了确定特定的异源核酸与受体植物细胞组合是否适合本发明，质粒内可包含一个报道基因。然后，可以在异源核酸导入受体细胞后某合适的时刻进行该报道基因的表达试验。较好的此类试验使用本发明参考的Jefferson等(1987)EMBOJ6：3901所述的β-gus基因。
本发明用途之一是生产含有一个以上感兴趣的转基因的能育转基因植物。此类植物的种子或其它繁殖材料可用于制备转基因植物的后代(包括子代)，这些后代含有一个或多个原方法引入的转基因。这些植物后代(包括子代)和种子等繁殖材料都属于本发明范围内。
本发明的另一项内容提供了农杆菌在转化方法中的用途，包括在靶组织处于其天然植物环境中用农杆菌接种靶组织并共培养，然后由靶组织生成去分化组织。
去分化组织可再生成转基因植物。然而，本发明这项内容也适合直接使用去分化组织(组织本身，或由其再生而成的非完整植株)。这样的使用包括：将去分化组织保存一段时间以备后用；和回收有用的植物产品，例如由细胞培养物回收植物次级代谢产物。本发明第一项内容的优点同样存在于第二方面的内容。
根据本发明第一和第二方面的内容，转化的去分化组织可用于再生。可以用它再生成例如愈伤组织、完整植株、能育完整植株、茎、种子或其它繁殖材料。
本发明第三项内容提供农杆菌在转化方法中的用途，包括在靶组织处于其天然植物环境中是用农杆菌接种靶组织并共培养，然后由靶组织经去分化和可选的再生，形成转基因植物材料。
根据本发明第三项内容所得的转基因植物材料可以是愈伤组织、完整植株(以能育为佳)、根或茎、种子等其它繁殖器官。
第一和第二项内容的优点都适用于第三项内容。
本发明第四项内容提供用本发明第一或第二项内容获得的转化植物组织。这样的转化植物组织包括愈伤组织，完整植株(以能育为佳)，根或茎，种子或其它繁殖器官。所述植物最好是能育植物。
有许多原因可解释为何本发明是成功的，以及为何当靶组织处于其天然植物环境中时更容易被农杆菌转化。以下是本发明之所以成功的可能原因，但并不想以此对本发明构成任何限定：
1.当靶细胞处于其天然植物环境中时，其分裂速度可能比在组织培养物中时快。
2.取消分离后处理(即接种并共培养)提高了愈伤组织形成能力，以及再生能力。
3.与农杆菌接触的发育中靶组织的细胞不同(与现有技术相比)，尤其是表皮下、更能再生的细胞。
4.没有创伤(大多数其它转化方法的前体条件)使得转化细胞几乎都能够继续发育。
5.将接种和共培养步骤合并降低了通常由这两个步骤施加于靶组织的压力。
6.在农杆菌存在下，种子的天然环境比分离后的组织培养环境更适合正常细胞的发育。
7.与曾经暴露于空气中的相比，处于任何靶组织内的表面细胞都更软，因而对农杆菌的屏障较少。
本发明的转化方法可按照以下“一般”方法来描述。更详细的方法参见实施例。
以下就(种子内)胚的接种来描述一般方法。本领域熟练技术人员知道，所述一般方法也适用于其它靶组织。构建物的制备和向农杆菌的传递
选用各种已知方法，例如三亲本杂交，电穿孔，将含有合适基因和选择标记和/或报道基因的双元(Binary)，超级双元(Superbinary)，pGreen或共整合载体转移到农杆菌中。所用的可以是各种标准的、通常已脱毒的根癌农杆菌或毛根农杆菌菌株，包括但不限于：
LBA4404(Hoekma等，自然(1983)303：179-180)；
EHA101(Hood等，细菌学杂志(1986)168：1291-1301)；
脱毒C58，例如pMP90(Koncz和Schell，M.G.G.(1986)204，383-396；
含pTOK233的LBA4404(Hiei等，植物杂志(1994)6：271-282)。制备实验用的农杆菌
农杆菌在加有合适选择性抗生素的培养液中或培养基上25-30℃培养2-3天。然后，收集菌体，重悬于TSIM1(MS培养基含100mg/l肌醇，10g/l葡萄糖，50mg/l MES缓冲液pH5.5)或另一种可能另含乙酰丁香酮的类似培养基中。培养基中还可以加有润湿剂，例如普卢兰尼克酸F68，也可以使用其它农杆菌诱导剂，例如章鱼氨酸或其它植物次级代谢产物。植物材料的制备
本方法的起始材料是某种单子叶植物(通常为禾本科)花开后一段时间的花序。接种和共培养的所有节段都在花序仍在完整植株上是进行。然而，出于简便和防范扩散的考虑，宜将带有花序的部分从植株上分离。但是，即使带有花序的部分与植株分离，花序仍处于其天然植物环境中。
例如，收集暖房或Conviron(环境控制室)中开花后8-16天的小麦或其它谷类的分蘖。然后暴露出未成熟的种子，但必须让其仍连在植株上。例如，在小麦中，小心地去除各小穗的颖片和头两朵花的外稃，暴露出未成熟的种子。通常只暴露各小穗中的这两粒种子。对花序全长进行该过程。未成熟种子的接种
用合适的传递工具，例如Hamilton注射器，将农杆菌悬浮液在大致盾片位置即胚乳界面接种到未成熟种子中。接种的细菌悬浮液体积一般为1μl，但可根据例如种子的大小等而改变。
然后可将例如分蘖放入水或营养液，最好包以塑料袋以防种子脱水，放入培养箱中2-5天(以2-3天为佳)。培养温度根据谷类品种而定，通常为20-25℃。胚的分离与培养
接种后，取出未成熟种子，表面消毒。分离出未成熟的胚，置于合适的愈伤培养基(例如Weeks等，植物生理学102：1077-1084，1993；Vasil等，生物技术11：1553-1558，1993；Ishiba等，1996)上。然后，按照合适的组织培养方法，进行胚的转移，可按需要包括选择步骤，最后得到转基因植物，最好是能育转基因植物。
以下将结合非限定性实施例对本发明进行描述。
与实施例相关的附图是：
图1显示pSCVsulugi的克隆策略。
图2显示pSCVsulugi的质粒图谱。
图3显示未成熟胚内的GUS瞬时表达，此图为体内接种并共培养后4天的组织化学染色结果，图中显示出蓝色斑点和“虚线(dash)”。
图4显示表达GUS的愈伤组织区域，此图为体内接种并共培养后1个月的组织化学染色结果，图中显示出大片的深蓝色染区。
图5显示图4中的局部放大：显示了一个深蓝色、轮廓清晰的愈伤组织，它具有再生能力。
图6显示pSB11Sulugi的质粒图谱。
图7显示pSCV1.2GI的质粒图谱。
图8显示大豆未成熟子叶中的GUS瞬时表达。实施例1：用种子接种法转化小麦-转化愈伤组织的瞬时表达和产生构建物的制备
为转化构建以下构建物(图1)：将pAHC25(Christensen等，植物分子生物学(1992)18：675-689)的4175bp HindIII片段引入经HindIII酶切的pIC19H(Marsh等，基因(1984)32：481-485)，得到质粒pAAA。以pUC-Top10-GUS INT(Weinmann等，植物杂志(1994)5：559-569)的BamHI，SstI GUS内含子片段替换pAAA中的BamHI，SstI GUS片段，得到pBBB。将pWP258(WO98/49316)中含SulR的XhoI，XbaI片段引入SalI，XbaI切的pSCV1(Firek等，植物分子生物学(1993)22：129-142)中，得到pEEE。将pBBB中的pUbi-GUSint片段克隆到HindIII切的pEEE中，得到pSCVSSulugi(图2)。
用电穿孔法，将该构建物引入含pEHA101(Hood等，细菌学杂志(1986)168：1291-1301)的脱毒(disarmed)超毒根癌农杆菌EHA101中，然后在含50mg/l卡那霉素和70mg/l庆大霉素培养基上选择。实验用农杆菌的制备
将农杆菌培养在含20mg/l硫酸卡那霉素的固化YEP培养基上27℃培养2天。然后收集菌体，重悬于含400μM乙酰丁香酮的TSIM1(MS培养基含100mg/l肌醇，10g/l葡萄糖，50mg/l MES缓冲液pH5.5)，培养至650nm光密度达2.4。植物材料的制备
收集暖房培养(日/夜温度22/15℃，补充光照达日照16小时/天)，开花后14天(胚长1mm)的NB1小麦(Nickerson Seeds Ltd.，Rothwell，Lincs的一种春小麦)分蘖，长50cm。除去旗叶(flag leaf)外的所有叶子，清洁旗叶以去除真菌孢子污染。小心地除去小穗的颖片和头两朵花的外稃，暴露出未成熟的种子。只暴露各小穗中的这两粒种子。对花序全长进行该过程。然后，给处理过的区域喷以70％IMS，作为简单的表面消毒。分蘖接种
用10ml的Hamilton注射器，将1μl农杆菌悬浮液在大致盾片位置即胚乳界面接种到未成熟种子中。然后将分蘖放入水中，包以塑料袋，防止种子脱水，放入光培养箱中23℃，3天，每日光照16小时，45μEm-2s-1PAR。胚的分离与培养
共培养3天后，分离出接受了接种的未成熟种子，表面消毒(70％中30秒，20％Domestos中20分钟，然后在无菌蒸馏水中彻底洗涤)。无菌分离出未成熟的胚，置于加有150mg/l Timentin的W3培养基(参见WO98/49316)(W3T)上，盾片在最上面(每盘20个胚)。培养物在25℃接受光照(16小时/日，80μEm-2s-1PAR)。
W3T上培养3天后，取50个胚加入X-gluc溶液(Jefferson，植物分子生物学报道(1987)5：386-405)，37℃培养16小时，评价GUS的表达。分离后5天，评价剩余胚上胚轴的发育，在需要改善愈伤组织形成的地方去除胚轴。分离后8天，再取31个胚，如前所述进行染色。
剩余的55个胚留在W3T培养基上维持4周，期间，在分离后第2周转移到新鲜培养基上。
胚分离出后1个月，评价剩余的由胚形成的愈伤组织的胚形成能力，并染色评价GUS表达。结果接种后4天的组织化学染色
部分分离的胚显示有接种造成的针刺损伤。这对组织化学法分析的GUS表达结果几乎没有影响。
胚内GUS表达表现为3种形式：
1.如文献所述的标准蓝色GUS斑，见图3；
2.数个GUS表达水平相当的相连细胞构成的小虚线，见图3；
3.盾片和胚轴上大块的深蓝色染区，起先是斑或虚线，迅速侵入组织的大面积区域，因此无法定量。
将1.和2.的结果相结合，得出每个胚6个斑点的平均值，范围是0-64个斑点。
接种仅含pEHA101而没有载体质粒的EHA101的菌株产生的对照胚(30)没有形成任何X-gluc蓝色染区。含SCVsulugi的EHA101也没有被染色。接种后14天的组织化学染色
这些胚的染色结果与4天后的略有不同。染色结果通常为小斑点，有时是小的染区。每个胚上斑点/区的平均数为3，范围为0-25个。染色最多的胚，其盾片组织上一般较少见的蓝色“区”也较多。愈伤组织的发育
生长4周后，接种胚形成的愈伤组织与非接种胚形成的对照愈伤组织非常相似。农杆菌的存在似乎没有显著降低接种胚形成愈伤组织的胚形成能力。接种后1个月的组织化学染色
剩余55个未成熟胚形成的愈伤组织经x-gluc染色，其中16个显示有GUS表达，表现为染成深蓝色的细胞。其中6个愈伤组织中可观察到相当大的深蓝色染区，直径达1mm，而且表现为轮廓清晰的区域，见图4。有3个蓝色染区显示为三维结构，即细胞从愈伤组织表面突起(见图5)，检测发现它们位于胚形成性愈伤组织内，具有良好的再生能力。
在该试验中回收到3种具有良好再生能力的稳定整合，说明本发明方法具有较高的转化率。实施例2：用种子接种法转化小麦-转化和转基因植物的再生
如实施例1所述，但接种并分离了187个胚，并对它们进行了选择。转化愈伤组织的选择
在W3T上培养12天后，将胚形成性愈伤组织转移到含2mg/l Asulam和150mg/l Timentin的W3培养基(W32AT)上。愈伤组织在此培养基上再维持2周，然后将各愈伤组织分割成2mm的碎片，重新接种在W32AT上。
再培养2周后，评价所有组织的胚形成性愈伤组织发育：经4周的选择后表现出持续发育的愈伤组织全部转移到再生培养基(含40g/l麦芽糖和150mg/lTimentin的RMT-MS，pH5.8，以6g/l琼脂糖固化，Sigma I型)上。在此培养基上，4周内再生出茎，然后转移到含150mg/l Timentin的MS30培养基上，进行茎的延长和生根。结果
用一种或多种以下方法测定转化：
a)至少在根和叶上进行GUS组织化学染色(Jefferson，1987)；
b)sul基因的PCR分析。用Stacey和Isaac所述的微制备法(分子生物学方法，Vol.28：放射性探针进行核酸分析的方法，9-15，Humana Press Inc.，Totawa，NJ(1994))自1-2cm2新鲜叶材料中抽提基因组DNA，进行PCR分析。用以下引物通过PCR反应扩增380bp的Sul片段：5′TTGTGCGGTTCTTCGAGGCG 3′和5′TGCGCTTCGCAGATCTCCAG 3′。反应条件如下：“热启动”(94℃，3分钟)，然后是30轮(变性(95℃，30s)，退火(60℃，30s)，延伸(73℃，2分钟))，然后是1轮73℃，5分钟，然后24℃保温。
c)Southern分析
从冷冻干燥的粉碎组织进行完全DNA抽提(9ml)(Stacey和Isaac，1994)进行Southern分析。将DNA样品调节为0.2mg/ml，用限制酶HindIII，EcoRI和KpnI消化。按照Stacey和Isaac(1994)所述进行限制酶消化，凝胶电泳和真空点样。按照McCreery和Helentjaris所述的方法(分子生物学方法，Vol.28：放射性探针进行核酸分析的方法，9-15，Humana Press Inc.，Totawa，NJ(1994))用PCR合成洋地黄毒苷标记的Sul和GUS探针。按照McCreery和Helentjaris所述的方法(同上)进行探针与Southern印迹的杂交，并通过化学发光法进行检测。
d)T1代的分离分析
对籽苗进行组织化学染色分析。
再生得到2株代表2种转化结果的(转化率1.1％)植株，组织化学染色显示其叶和根都表现出强GUS表达。Southern分析和对子代的基因分离评价证实为稳定转化。
在另一实验中，116个胚接受接种，再生得到4个GUS阳性转基因品系。
所得的转化率(1.1和3.4％)与组合运用其它载体及菌株所得的相当(见实施例5)。实施例3：用种子接种法转化玉米-瞬时表达，转基因愈伤组织的产生，和转化植株的再生构建物的制备
参见实施例1。实验用农杆菌的制备
农杆菌在加有适当抗生素的YEP固化培养基上27℃培养2天。然后收集菌体，重悬于含100-400μM乙酰丁香酮的TSIM1(MS培养基含100mg/l肌醇，10g/l葡萄糖，50mg/l MES缓冲液pH5.5)，至650nm光密度2.0-2.4。植物材料的制备
切取玉米A188(暖房培养，20-35℃，16小时日照)的一部分，该部分至少包括开花后6-14天时玉米棒上和棒下的茎节，并留有至少一片叶子。小心地拉去玉米棒的外壳叶，暴露出未成熟的种子，去除所有穗丝。
用利器每隔两纵向行小心地去除一行种子，对整个切下部分轻轻喷以70％乙醇。玉米棒的接种
如实施例1所述进行接种。然后将植物切下部分置于水中，将外壳叶放回棒上以防种子脱水，为此也可以包以塑料袋。然后将该材料在光培养箱中23-25℃放置2-5天。胚的分离与培养
按Ishida等1997所述进行。在继接种2天后取出胚进行瞬时表达分析，其余胚则进行选择以再生成为稳定转化的玉米植株。实施例4：种子接种后，没有乙酰丁香酮条件下，未成熟小麦胚中的瞬时表达构建物的制备
参见实施例1。实验用农杆菌的制备
如实施例1所述，但接种培养基中不含乙酰丁香酮，而且使用低浓度农杆菌(650nm OD为2.1)。植物材料的制备
参见实施例1。胚的分离与培养
如实施例1所述进行分离。W3T上培养2天后，用X-gluc组织化学分析对77个胚进行GUS表达评价。结果
盾片上表面和下表面都可看到蓝色的斑点/虚线，许多情况下，斑点似乎进入了盾片结构的内部，即位于上下表皮之间。少数胚没有任何GUS表达的迹象。每胚的斑点数为0-252，平均值为25.4。其它实施方式
应该知道，虽然以上结合具体描述了本发明，但以上只是为了说明本发明而不是限定本发明的范围。从后文，可以发现本发明范围内的其它内容、优点和修改。实施例5：用种子接种法稳定转化小麦制备构建物，并将其引入农杆菌LBA4404
将pWP258(见实施例1)内含SulR的XhoI，XbaI片段引入XhoI，XbaI切的pSB11(Komari等，植物杂志(1996)10：165-174)，形成pFFFII。将pBBB(见实施例1)的HindIII pUbi-GUSint片段克隆到HindIII切的pFFFII中，得到pSB11Sulugi(见图6)。
用电穿孔法将该构建物引入根癌农杆菌LBA4404(pSB1)(Komari等，1996)，然后在50mg/l链霉素上选择，得到超级双元载体重组pSB11Sulugi。接种菌的制备
如实施例1所述培养农杆菌，重悬，但接种培养基中乙酰丁香酮的浓度是变化的(0-400μM)。种子接种
用实施例1中的方法，进行50-300个胚的实验，参见表1。分离胚的组织培养
参见实施例2。结果
参见表1。
表1数据反映成功的实验-排除了没有获得植株的实验。用一种或多种以下方法测定转化：
a)至少对根和叶进行的GUS组织化学染色(Jefferson，1987)；
b)Sul基因的PCR分析；
c)Southern分析；
d)T1代的分离分析转化率
成功实验的转化率为0.5-5.8％，平均值为1.5％。接种培养基中加或不加诱导剂乙酰丁香酮，实验都获得了转化植株。数个品系中都证实GUS基因传递给了T1代，参见表1。
本发明所得的转化率相当于或超过了所有已公开的小麦转化率(Vasil等，生物技术(1992)，10：667-674，Weeks等，植物生理学(1993)，102：1077-1084，Nehra等，植物杂志(1994)，5：285-297，Becker等，植物杂志(1994)，5：299-307，Zhou等，植物细胞报道(1995)，15：159-163，Cheng等(1997))。整合方式
转化品系的基因整合方式包括具有Mendelian遗传方式的单插入，至具有7份T-DNA拷贝的多拷贝品系。实施例6：用种子接种法转化玉米-瞬时表达和转化植株的再生构建物的制备
按照实施例1所述。或者用Ishida等(1997)所述的LBA4404(pSB131)。实验用农杆菌的制备
农杆菌在加有适当抗生素的YEP固化培养基上27℃培养2天。然后收集菌体，重悬于含100-400μM乙酰丁香酮和0-0.5％普卢兰尼克酸F68的TSIM1(MS培养基含100mg/l肌醇，10g/l葡萄糖，50mg/l MES缓冲液，pH5.5)，至650nm光密度2.0-2.4。植物材料的制备
切取玉米A188或Hi II(暖房种植，20-35℃，16小时日照)的一部分，该部分需至少包括开花后6-14天玉米棒上和棒下的茎节，并留有至少一片旗叶。小心地拉掉外壳叶，暴露出未成熟种子，去除所有穗丝。在棒上轻轻喷以70％乙醇进行消毒。玉米棒的接种
如实施例1所述进行接种。然后将植物部分放在水中，重新包以外壳叶和保鲜膜，以防种子脱水。然后将材料在光培养箱中22-25℃放置2-5天。胚的分离与培养
共培养后，玉米棒在20％Domestos溶液中消毒20分钟。然后无菌地分离出胚，用加有250mg/l Cefotaxime的Lsinf(Ishida等，1997)洗涤2次，转移到愈伤组织诱导培养基LSD(Ishida，1997)上，25℃无光培养2-10天。
继接种后2天，取出胚进行瞬时表达分析，其余的如Ishida等(1997)所述进行选择，用于再生成稳定转化的玉米植株。结果
如表2所示，对玉米种子内的胚进行接种，所用两个品种植株都实现了T-DNA转移和GUS基因表达。虽然在共培养后只有3-10％未成熟胚表达GUS，但再生得到了phosphinothricin抗性株，且该株表达GUS。因为通过选择进行稳定转化的胚数量较少，可以认为转化率是较高的。该实验还表明，虽然T-DNA转移低于传统的完全体外系统(Ishida等，1997)，在其天然种子环境中进行的胚接种主要针对再生能力较高的细胞。
以上结果还显示，该方法可用于其它单子叶植物，转化步骤没有种依赖性。实施例7：通过将农杆菌接种到子叶柄的根部产生转基因蔓菁
将分离自pCaMVNEO(Fromm等，自然(1996)，319：791-793)的P35S-nptII-tNOS HindIII片段插入pSCV1(Firek等，植物分子生物学(1993)22：129-142)形成pSCV1.2。将p35S-gus-内含子-聚ACaMVHindIII片段(Vancanneyt等，M.G.G.(1990)，220：245-250)插入pSCV1.2的SmaI位点，形成pSCV1.2GI(图7)。
将该构建物引入根癌农杆菌C58pMP90(Koncz和Schell，1986)。籽苗的制备
用15％Domestos对蔓菁caRV31的种子进行20分钟的表面消毒，然后用无菌水彻底洗涤，去除真菌和细菌病原。然后将种子(110)放在Beatson罐中的出芽培养基(含20g/l蔗糖的MS培养基)上(每罐10颗种子)，25℃，16小时光照，培养3天。由此产生的籽苗所处的阶段是：已经出现子叶和与之相连的叶柄，但尚未完全展开。农杆菌的制备
将C58pMP90 SCV1.2GI接种到10ml含适当抗生素的mg/L选择培养基中，在旋转振荡器上28℃培养24小时。然后将此培养物2000rpm离心20分钟，弃去上清液。将菌体沉淀重悬于MS30液体(含30g/l蔗糖的MS培养基)，直至OD650nm约2.0(2.175)。农杆菌接种
用10μl Hamilton注射器将细菌悬浮液(0.5-1.0μl)注射到子叶柄根部。然后将籽苗转移至20℃培养2天。愈伤组织诱导和植株再生
切取籽苗的子叶，根据Moloney等(植物细胞报道(1989)8：238-242)所述进行培养。以这种方式培养，Barssica子叶柄的切面在一段短时间内由曝露的维管束组织发育形成愈伤组织，然后，在8天培养期内，由此愈伤组织形成茎分生组织(Ono等，植物细胞报道(1994)14：13-17)。结果
根据GUS基因表达的x-gluc染色和NptII基因的PCR分析，由切下的200个子叶柄再生得到6个转化茎，相当于3.0％转化率。另一品系的PCR分析显示含有所述基因，但x-gluc染色则没有测得GUS活性。对5个表达GUS的转化品系的T1代进行x-gluc染色分析，显示GUS基因向下一代的传递结果为：
T1代植株的GUS活性
品系 阳性 阴性 比例
1 10 10 1∶1
2 9 0 9∶0
3 21 0 21∶0
4 19 0 19∶0
5 14 1 14∶1
讨论
当子叶柄的根部仍与籽苗相连时将农杆菌接种到其中，这与已知转化系统截然不同，已知转化系统中，首先切取叶柄，然后进行农杆菌接种。虽然在操作上有一定的物理困难，但小规模实施已经证明，该方法效率突出。凭数年的经验，用标准的已知方法和同种的蔓菁，一般可获得5-10％转化率。用本发明新方法，第二次就获得3.0％的转化率(第一次实验由80个外植体获得一个转化茎，转化率为1.25％)是出人意料的。这进一步证明，本发明基因传递方法适用于存在愈伤组织期的任何单子叶或双子叶组织培养系统。实施例8：用种子接种法转化大豆-瞬时表达构建物的制备
用含有CaMV35S启动子驱动下的GUS内含子的超级双元载体pVec035(B.Pelissier提供，Aventis Crop Science，Lyon，Fr)转化根癌农杆菌LBA4404。实验用农杆菌的制备
将农杆菌接种到含有合适抗生素的YEP固化培养基上27℃培养2天。然后收集菌体重悬于含0-400μM乙酰丁香酮的TSIM1(含100mg/l肌醇，10g/l葡萄糖，50mg/L MES缓冲液，pH5.5)，至650nm光密度为0.5-2.0。植物材料的制备
Glycine max cv Jack大豆植株种植在暖房中，23-25℃，补足光照至每天14小时。大豆种子接种
当胚长到3-7mm时，给未成熟种子接种。如实施例1所述将0.5-1μl农杆菌悬浮液注射到两子叶之间，通过荚，沿径向到达胚。植株然后在23-25℃培养2-5天。胚的分离与培养
共培养后，取出未成熟种子，用20％Domestos溶液消毒20分钟。然后将胚无菌地转移到加有350mg/l Cefotaxime的愈伤组织诱导培养基MSI(MS培养基加维生素B5，含60g/l蔗糖和40mg/l 2，4-D，加3g/l Phytagel固化，调节至pH7)上，在光照条件下27℃培养。2-10天后，对胚进行组织化学GUS染色，以评估T-DNA转移率。结果
如表3所示，对处于种子和荚内的未成熟胚接种实现了T-DNA转移和GUS表达。GUS阳性斑或区域在未成熟胚内分布广泛，且不限定于损伤部位(图8)。与SAAT转化大豆子叶法(Santarem等，植物细胞报道(1998)，17：752-759)不同，本发明方法提供了更简便的转化方法，不受伤的靶细胞具有更高的再生能力。实施例9：用种子接种法转化向日葵-瞬时表达构建物的制备
C58C1(pGV2260)(Simpson等，植物分子生物学(1986)6：403-416)(pBin19)(Bevan，核酸研究(1984)12：8711-8121)。
C58pMP90(pSCV1.2GI)(见实施例7)实验用农杆菌的制备
将农杆菌接种到含有合适抗生素的YEP固化培养基上27℃培养2天。然后收集菌体重悬于含0-400μM乙酰丁香酮的TSIM1(含100mg/l肌醇，10g/l葡萄糖，50mg/L MES缓冲液，pH5.5)，至650nm光密度为2.0-2.4。植物材料的制备
Helianthus annuus cv HA300B向日葵植株种植在暖房中，15-25℃，补足光照至每天14小时。向日葵种子接种
当开花后10-25天，给未成熟种子接种。如实施例1所述将1μl农杆菌悬浮液通过珠孔注射到两子叶之间。头状花序然后22-25℃培养2-5天。胚的分离与培养
共培养后，取出未成熟种子，用20％Domestos溶液消毒20分钟。然后将胚无菌地转移到的愈伤组织诱导培养基MSI(MS培养基加30g/l蔗糖，加Agar-agar10g/l固化，pH5.7，并加入0.5mg/l NAA，0.5g/l BAP和500mg/l Cefotaxime)上，21-24℃，16小时日照，30μEm-2s-1 PAR。2-10天后，对胚进行组织化学GUS染色，以评估T-DNA转移率。结果
如表4所示，对处于种子内的向日葵未成熟胚接种，所用的植株都实现了T-DNA转移和GUS表达(5.9-65.4％)。GUS阳性主要位于子叶上，但下胚轴上也发生转化。仅对2个实验评估了用种子接种法转化向日葵未成熟胚的能力。出人意料的是，但该方法已被证明十分有效，尽管关键的似乎是未成熟胚的发育。