一种促进组织血管化的基因－壳聚糖纳米粒复合体.pdf

摘要
申请专利号：	CN03148393.3	申请日：	2003.07.02
公开号：	CN1565650A	公开日：	2005.01.19
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回\|\|\|实质审查的生效\|\|\|公开
IPC分类号：	A61L31/12; A61L31/16; C12N5/08; C12N15/79; C12N15/12	主分类号：	A61L31/12; A61L31/16; C12N5/08; C12N15/79; C12N15/12
申请人：	中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所;
发明人：	王常勇; 齐子荣; 郭希民; 段翠密; 赵云山
地址：	100850北京市海淀区太平路27号
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内容摘要

本发明涉及一种促进组织血管化的基因－壳聚糖纳米粒复合体，属于组织工程领域。本发明用pcDNA3.1－hVEGF基因－壳聚糖纳米粒复合体负荷上I型胶原，接种心肌细胞，体外培养后移植到有损伤的心肌组织中，经体内缓释后转染周围的心肌细胞，实现靶向性基因表达。表达产物hVEGF能促进血管组织的新生。因纳米粒体积小，比表面积大，基因携带量高，对心肌血管生长促进作用更为明显。

权利要求书

1一种促进组织血管化的基因-壳聚糖纳米粒复合体，其特征是将携带人血管内皮细胞生长
因子(hVEGF)基因的真核表达载体与壳聚糖纳米粒复合，采用凝聚法制造壳聚糖纳米粒
-pcDNA_3.1-hVEGF基因复合体，该复合体加入构建的组织工程化组织中，可显著提高组织的
血管化水平。
2权利要求1所述的hVEGF基因，其特征是编码区基因，含起始密码子和终止密码子。
3权利要求1所述的hVEGF基因，其功能是能促进血管内皮细胞增生，形成新生血管。
4权利要求1中所述的壳聚糖纳米粒-pcDNA_3.1-hVEGF基因复合体，其特征是平均粒径在
70-160nm之间，粒径较小，比表面积大，单位体积的粒数较多。因而在体内基因表达量
也会增多，为本发明的特点。
5权利要求1所述的壳聚糖纳米粒-pcDNA_3.1-hVEGF基因复合体，其特征是在体内质粒从复合
体中缓慢释放，转染周围细胞，产生hVEGF，促进血管增生，可以应用于心肌等大块软组
织的组织工程，也可以应用于其他涉及需要改善局部血供的治疗，以提高组织的血管化程
度。
6权利要求1中所述的壳聚糖纳米粒-pcDNA_3.1-hVEGF基因复合体加入构建的组织工程化组
织，其方法是在支架上接种心肌细胞。在心肌细胞悬液中加入一定浓度的
pcDNA3.1-hVEGF-壳聚糖纳米粒，再与I型胶原支架材料混合使其终浓度为2×10⁶
/ml左右。混合液加入环型槽中，60分钟后加入培养液(DMEM，含10％马血清)。心肌细
胞与胶原的混合液即可在环型槽中形成环型的心肌细胞-胶原条带。形成的环状心肌细胞-
胶原条带在环形槽中培养7天后植入体内。
7要求1中所述的提高组织的血管化水平，其特征是通过组织工程化组织内的基因-壳聚糖
纳米粒复合体缓慢释放pcDNA3.1-hVEGF质粒，转染周围的细胞，转染细胞表达hVEGF
基因，后者作用于血管内皮细胞，促使其长入到组织工程化组织内。

说明书

一种促进组织血管化的基因-壳聚糖纳米粒复合体

技术领域

本发明涉及一种促进组织血管化的基因-壳聚糖纳米粒复合体，属于组织工程领域。

背景技术

纳米材料由于其结构的特殊性，表现出许多不同于传统材料的物理、化学性能，它作为
一个基本构成单元，呈三维立体排列。目前，在医学领域中，纳米材料已经得到成功的应用。
最引人注目的是作为药物载体、基因载体或制作人体生物医学材料，如人工肾脏、人工关节
等。在纳米材料研究中，目前的热点是纳米粒基因转移载体和药物纳米载体技术。这种技术
是以纳米粒作为基因转移的载体，将DNA和RNA等基因分子包裹在纳米粒之中或吸附在其
表面，同时颗粒表面藕联特异性的靶向分子，如特异性配体、单克隆抗体等，通过靶向分子
与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性基因表
达。纳米粒作为基因载体具有一些显著的特点；纳米粒能包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免
遭核酸酶的降解；比表面积大，具有生物亲和性，易于在其表面藕联特异性的靶向分子，在
循环系统中的循环时间较普通颗粒明显延长，在一定时间内不会象普通颗粒那样迅速地被吞
噬细胞清除；让核苷酸缓慢释放，有效地延长作用时间；并维持有效的产物浓度，提高转染
效率和转染产物的利用度；代谢产物少，副作用小，无免疫排斥反应等。但在纳米粒作为载
体的研究中，多数将纳米粒作为药物的载体。然而，将壳聚糖纳米粒-pcDNA_3.1-hVEGF重组
基因再负荷上I型胶原构成组织工程支架，接种上心肌细胞，体外培养后，移植到体内，在
体内继续培养促进心肌血管化却未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种能促进组织血管化的基因-壳聚糖纳米粒复合体，其中所提的
组织可以是心肌组织，其特征是以壳聚糖纳米粒为载体与重组质粒基因(pcDNA3.1-hVEGF)
构建成复合体，后用I型胶原作为三维支架、接种心肌细胞、体外培养，体内植入，异位诱
导心肌组织血管生长等过程，包括：

1)重组质粒基因构建：用限制性内切酶可将BamHI和KpnI区域切开，然后用T4DNA
连接酶与同样经过BamHI和KpnI双酶切处理的外源基因连接，使其置于人巨细胞病毒CMV
启动子控制下，这样就构建成外源基因的真核表达载体。载体采用T7和SP6引物双向测序，
证实无误后，在大肠杆菌DH5α中扩增，提取质粒。

2)制备基因-壳聚糖纳米粒：将质粒载体溶于75mM的硫酸钠溶液中，与一定浓度的
pH5.5壳聚糖溶液分别置于55℃水浴恒温20分钟。分别取200ul在旋涡混合器上迅速混合
30秒，即得基因-壳聚糖纳米粒复合体。

3)组织工程化心肌的构建：在新分离的新生大鼠(1-2天)心肌细胞悬液中加入一定浓
度的pcDNA3.1-hVEGF-壳聚糖纳米粒，再与I型胶原支架材料混合使其终浓度为2×10⁶
/ml左右。混合液加入环型槽中，60分钟后加入培养液(DMEM，含10％马血清)。心肌细胞
与胶原的混合液即可在环型槽中形成环型的心肌细胞-胶原条带。形成的环状心肌细胞-胶原
条带在环形槽中培养7天。然后植入体内。

4)结果检测：脱颈处死动物，取植入组织作病理切片，在光学显微镜下观察心肌组织血
管生长状况，从中看出，实验组动物的心肌组织血管生长旺盛，血运丰富、心肌生长活跃，
心肌组织增厚等生长趋势，而只植入未载基因的壳聚糖纳米粒的对照动物其心肌血管生长一
般化，两者呈明显对比。

有益效果：

本发明的是壳聚糖纳米粒粒径在70-160nm之间，比表面积大，携带的重组质粒基因数量
多，体内停留时间长，转染细胞基因表达量高，能够显著提高构建组织内部的血管化水平，有
助于再造心肌组织的成活和功能发挥。

具体实施方式

实施例1重组pcDNA3.1-hVEGF质粒的构建

质粒pcDNA3.1是一种真核表达载体，该质粒构建有人巨细胞病毒启动子，可以对插入
的外源基因进行表述调控。该质粒自身载有hVEGF的基因编码序列，在自身表达调控元件的
作用下可以表达产生hVEGF。质粒多克隆位点上有17个酶切位点。用限制性内切酶可将
BamHI和KpnI区域切开，然后用T4DNA连接酶与同样经过BamHI和KpnI双酶切处理的外
源基因连接，使其置于人巨细胞病毒CMV启动子控制下，这样就构建成外源基因的真核表
达载体(见附图)。

实施例2基因-壳聚糖纳米粒复合体的构建

采用凝聚法制备，全部操作均在无菌条件下进行。先配制0.03％壳聚糖(Sigma)溶液，
用1N HCl调成pH5.5，用0.22um滤膜过滤除菌，用75μM硫酸钠(分析纯，北京化工厂)
溶液(用0.22um滤膜过滤除菌)溶解pcDNA3.1-hVEGF重组质粒，使其终浓度为200ug/ml。
从中取200ul0.03％壳聚糖溶液和200ul内含重组质粒pcDNA3.1-hVEGF的75mM Na₂SO₄液
分别置于55℃水恒温20分钟。准确吸取200ul Na₂SO₄溶液加到壳聚糖溶液中，迅速在旋涡
混合器上混合30秒，制成基因-壳聚糖纳米粒复合体混悬液。

实施例3组织工程化心肌的构建

制备I型胶原支架：取体重250克左右大鼠一只，从尾根部切断鼠尾，置75％酒精中浸
泡30分钟；无菌条件下将鼠尾切成1.5cm的小段，剔除皮毛，抽出尾腱置平皿，浸入150ml
醋酸溶液(0.01-0.25M)中，10磅10分钟高压灭菌后，置4℃冰箱，48小时后移入灭菌离心
管中，以4000转/分离心30分钟，吸取上清液分装小瓶，-20℃冰箱保存备用

构建组织工程化心肌：以I型胶原作为支架，接种上大鼠乳鼠(1-2天)的心肌细胞。
其心肌细胞的制备法是取乳鼠的心肌组织，切碎研磨均匀成细胞悬液，过滤除去未分散的组
织凝块，制成完全均匀的心肌细胞混悬液，其制备全过程均在无菌条件下进行。在心肌细胞
悬液中加入一定浓度的pcDNA3.1-hVEGF-壳聚糖纳米粒，再与I型胶原支架材料混合使其
终浓度为2×10⁶/ml左右。混合液加入环型槽中，60分钟后加入培养液(DMEM，含10％
马血清)。心肌细胞与胶原的混合液即可在环型槽中形成环型的心肌细胞-胶原条带。形成的
环状心肌细胞-胶原条带在环形槽中培养7天。

实施例4体内植入

选用150-250g雄性、健康大鼠，1.5％戊巴比妥钠腹腔注射0.4ml全身麻醉，开腹部，暴
露腹膜，将构建的组织工程化心肌植入腹膜内，并以未复合壳聚糖纳米粒-pcDNA_3.1-hVEGF
基因复合体的组织工程化心肌作为对照。

结果：体内培养14天后处死动物，取心肌组织制成切片染色，观察心肌组织的血管生长
趋势。实验组动物心肌组织内可见，心肌组织内血管生长旺盛，在一视野内大小血管生长数
十个、血运丰富，心肌组织增生活跃，组织增厚，而对照组在一个视野内心肌血管生长和组
织增生状况一般，两者呈明显对比。

附图说明

附图重组pcDNA3.1-hVEGF质粒