重组腺相关病毒介导血红素氧化酶-1(HO-1)的基因表达预防慢性移植排斥 本发明属于生物技术发明领域。具体涉及携带有血红素氧化酶-1基因(HemeOxygenase-1，HO-1)的重组腺相关病毒(rAAV/HO-1)的产生、应用重组腺相关病毒载体(recombinant Adeno Associated Virus，rAAV)介导血红素氧化酶-1的基因表达、以及将其用于器官移植后预防慢性移植排斥等用途。
【发明背景】
慢性移植排斥是指在器官移植后的数月至数年内出现的进行性的移植物功能恶化。慢性移植排斥是影响器官移植长期治疗效果的主要问题1。尽管应用新型免疫抑制药物和治疗方法，慢性移植排斥的发生率仍然没有明显减少。虽然慢性移植排斥的确切的分子和细胞机制尚不明确，普遍的观点认为免疫和非免疫因素共同导致血管炎、移植物损伤和继发炎症反应等病生理过程2，3。移植物血管内的细胞增生和导致移植物间质纤维化的组织重构是导致移植物功能完全丧失地根本原因。
已有的研究结果显示，在功能保存良好的移植物中，HO-1基因的表达增高，提示其可能在移植物的保护中具有重要作用。HO是一种重要的氧化物酶，控制血红素的代谢4。目前发现HO的三种同功酶。HO-1是HO的一种同功酶，与其他同功酶不同，HO-1在多种组织中可以被诱导表达。许多与应激相关的刺激因素都可以诱导HO-1的表达。HO-1的细胞保护作用可能由它的产物：一氧化碳、胆绿素和铁离子等介导的5。其中，研究最多的是一氧化碳，它有明显的抗炎症作用6，7。在动物实验中，向器官移植物内导入HO-1基因可以保护移植物免受缺血-再灌注损伤和急性排斥反应8-11。在抗CD4单克隆抗体移植慢性移植排斥的动物模型中，移植后早期导入HO-1基因可以减轻抗体相关的慢性动脉粥样硬化。但是目前还不知道HO-1基因的表达是否能提高移植后早期存活率和抑制慢性移植排斥。最后，HO-1基因能否导质同种异体器官移植物的长期存活还没有得到证实。在我们进行本项发明研究之前，无人知道长期表达HO-1基因对慢性移植排斥会有什么影响。
在本研究中，我们应用重组腺相关病毒介导HO-1基因在移植物中表达，观察何时表达的HO-1基因可以抑制早期抑制排斥，何时表达的HO-1基因可以抑制抑制物动脉粥样硬化，以及HO-1基因是否能使移植物的长期存活。更重要的是，我们应用的动物模型中治疗组的唯一处理是导入HO-1基因，以便观察HO-1基因本身的效果。这种方法具有临床器官移植中应用的前景。
重组腺相关病毒载体做为基因转移和基因表达载体，具有能介导目的基因长期表达的特性。同时，rAAV可以感染分裂细胞和非分裂细胞，是最令人感兴趣的基因转移系统。与其他的病毒载体相比，rAAV的最大优势在于，其转移的基因可以长期表达，而且对细胞没有明显的毒性18，19。在本研究中，我们首次证明，rAAV是向器官移植物中导入保护基因以预防急性和慢性移植排斥的非常有效的载体。稳定表达的HO-1基因，可以抑制导致移植物动脉粥样硬化和间质纤维化的炎症反应、细胞损伤和组织重塑。
以往的研究表明，过表达HO-1基因可以保护移植物免受缺血-再灌注损伤和急性排斥反应的攻击8-11。但这些研究未能阐明HO-1基因在何时表达才能取得这样的效果。另外，研究发现导入HO-1基因具有阻止动脉粥样硬化发展的作用12。但这些实验中都同时给予了抗CD-4抗体或输入供者血液加抗CD-40抗体，这些都严重的干扰了对HO-1作用的观察，而且HO-1基因只在移植前后短期表达，并没有阐明在移植后何时提高HO-1活性可以阻止动脉粥样硬化。
在本研究中，我们尝试使用一种由临床应用前景的动物模型，同时，我们考察单独应用HO-1基因能否或的移植物的长期存活。本研究结果显示单独应用HO-1基因表达只能获得50～60％的存活率，而只加用5天低剂量CsA可以使长期存活率提高至90％。
本发明及其研究中，系采用吴小兵等研制的重组腺相关病毒载体生产系统及工艺(专利申请号：99119039.4，99123723.4)进行rAAV/HO-1的生产。
本发明内容
在本发明及其研究中，我们通过重组腺相关病毒将抗氧化基因--血红素氧化酶-1(HO-1)导入器官移植物中，通过重组腺相关病毒载体的作用使血红素氧化酶-1在器官移植物内长期表达。通过本实验研究，我们希望知道长期表达HO-1基因对慢性移植排斥会有什么影响。在本研究中，我们应用重组腺相关病毒介导HO-1基因在移植物中长期表达，观察其对慢性排斥反应的影响。结果发现rAAV介导的HO-1基因的表达可以使移植物长期存活，可以预防移植物的动脉粥样硬化和间质纤维化。HO-1基因的长期稳定表达不但是移植物长期存活的先决条件，而且可以防止移植物的动脉粥样硬化和间质纤维化。rAAV/HO-1对移植物的长期保护作用与显著下调移植物内的前炎症因子、生长因子和组织蛋白酶抑制剂，以及上调丝氨酸蛋白酶的的表达有关。我们的研究结果预示了rAAV/HO-1将成为临床器官移植中抑制慢性移植排斥的一种新的治疗方法。
应用rAAV载体有许多优势。在我们的模型中，rAAV介导的HO-1基因在移植物的血管内皮细胞和心肌细胞内都有表达(图1)。可由受者外周血中一氧化碳结合的血红蛋白的稳定存在(证明有CO产生)表明移植物中HO-1的活性稳定升高。(图3)。而阻断HO+1的活性使我们能够了解何时表达HO-1基因对于阻止急性和慢性移植排斥反应是必要的。在移植后早期阻断rAAV/HO-1处理的移植物的HO-1基因活性会明显降低移植物的存活率。这提示在移植后早期(在本研究中为移植后10～30天)增加HO-1基因的活性对于防止急性排斥反应是十分重要的。HO-1基因的表达明显减少了移植物中巨噬细胞、T细胞的浸润，并显著降低受者血清中的抗供者抗体的滴度。虽然目前还不明确这种作用的机制，但结果显示HO-1表达能同时调节导致移植排斥的细胞免疫和体液免疫反应。至于HO-1和它的代谢产物(一氧化碳、胆绿素和铁离子)通过抑制内皮细胞活化和下调前炎症细胞因子和趋化因子的转录能在多大程度上降低免疫反应的强度还需要进一步的研究。但实验结果显示，通过保护基因(抗炎症基因)的表达来降低移植物内的炎症反应，可以调节受者体内的免疫反应。HO-1基因和它的产物一氧化碳和胆绿素/胆红素，都可以通过激活MAPK-p38激酶途径和抑制巨噬细胞产生前炎症因子来发挥抗凋亡和抗炎症的作用6，7，20。另外，HO-1和一氧化碳还是白介素10发挥抗炎作用的重要中介物质21。
在本研究中，我们提供了直接的证据表明，在整个实验过程中，也就是移植后的100天提高HO-1的活性对于改善移植物的功能是十分必要的。早期(移植后0-30天)表达的HO-1基因显然对于移植物的存活是重要的。然而，早期的表达似乎对于阻止动脉粥样硬化的发展的作用不明显。在尽管早期(前30天)抑制了HO-1基因，但仍然长期存活的3个移植物中，动脉粥样硬化的程度和显著性并不比全程(移植后0～100天)表达HO-1基因的移植物差。因此，移植后早期增加HO-1的活性对于阻止动脉粥样硬化并非必要，而其在后70天(移植后31～100天)的表达则足以抑制动脉粥样硬化的发展。这一点在所有得到的实验结果中得到证实，包括移植物血管的细胞增生和间质纤维化(组织损伤和慢性炎症反应的结果)。
此外，在移植后期(移植后31-100天)增加HO的活性与在移植后早期增加其活性对于预防移植物血管内的细胞增生和间质纤维化(组织损伤和慢性炎症反应的结果)是同样重要的。实验结果表明在血管内皮细胞内转基因表达HO-1可以通过上调p21表达来抑制细胞增生和血管纤维化。
在本研究中，我们证明在冷冻保存移植器官时灌注rAAV/HO-1可以降低移植物动脉粥样硬化的严重程度和α-平滑肌激动蛋白在移植物血管中的沉积，从而有效预防血管内细胞增生的发生(图2)。虽然确切的机制还不清楚，但是Western印记分析显示在所有rAAV/HO-1处理的移植物中p53上调表达，在部分rAAV/HO-1处理的移植物中p21的上调表达(结果未显示)可能在其抑制导致血管狭窄的细胞增生的过程中具有重要作用。最近的研究发现，抑制细胞增生与p21的上调有关22。另外，HO-1基因的表达可以增加血管平滑肌细胞的凋亡，这也是抑制血管内细胞增生的一个机制23-25。
而且，实验还证明，移植物中的TGF-β1的过表达可能与慢性移植排斥有关26-28，过量的TGF-B1会导致纤维成分在细胞外基质沉积16。HO-1基因可以减少巨噬细胞在移植物中的浸润，因此也就下调其分泌的TGF-B1的水平，所以rAAV/HO-1处理的移植物中这些生长因子的表达减少，这也是HO-1的抗炎作用之一。另外，我们证明，HO-1不但可以下调移植物内TGF-B1的表达，而且可以影响TGF-B1的信号传导通路。HO-1可以通过降低Smad2和Smad3的mRNA水平来下调TGF-B1的表达。我们因此推测HO-1可以通过减少Smad2/4蛋白的核定位来下调Smad依赖的PAI-1的表达。这一结果与最近发表的CO可以通过下调HO-1缺乏鼠的PA1-1的机制来防止肺缺血-再灌注损伤的研究结果相吻合29。rAAV/HO-1处理组的这些基因表达的动态变化与移植物中细胞外基质沉积的关系说明HO-1可以抑制TGF-B1在促进细胞外基质成分沉积中的不良作用
总之，在我们的实验中，长期稳定表达HO-1基因可以预防急性和慢性移植排斥反应。移植后早期和后期，由rAAV介导的HO-1基因在移植物内的转基因高表达对于移植物的存活和改善移植物的动脉粥样硬化和间质纤维化是十分重要的。在移植器官保存过程中，应用rAAV介到保护基因的转基因表达是一种新的预防移植物内免疫反应和慢性组织重塑的治疗手段。
具体的实验过程和实验方法如下：
大鼠HO-1基因的克隆、载体质粒pSNAV1/HO-1的构建
大鼠HO-1基因从大鼠脾脏RNA经RT-PCR的方法获得，并克隆于pGEM-T(Promega)质粒中30。关键载体pSNAV1由质粒pSV2neo和pAV53构建而成。在pAV53质粒中构建人CMW启动子控制的基因表达框，成为载体pSNAV13，14。GFP或大鼠HO-1基因被克隆于pSNAV1载体的多克隆位点，从而构建成pSNAV1/GFP和pSNAV1/HO-1。如附图6示意。
rAAV/HO-1病毒载体的生产
采用吴小兵等发明的rAAV病毒的生产方法(专利申请号：99119039.4，99123723.4)进行rAAV/HO-1病毒载体的生产。用脂质体(lipofectamine)将重组质粒载体pSNAV1/HO-1转染BHK-21(购白ATCC)，并用新霉素对细胞进行加压。成功转染了重组质粒载体pSNAV1/H-O-1的细胞由于其带有新霉素抗性基因而被选择出，此细胞是能够产生rAAV/HO-1的生产细胞。将此生产细胞传代扩大培养并建立细胞库后得到大量细胞。细胞内潜伏的pSNAV1/HO-1的病毒基因组通过感染能够提供AAV2病毒的rep和cap基因的重组单纯疱疹病毒rHSV-rc/ΔUL2而被拯救，从而包装并产生大量的含有HO-1基因及其基因表达盒的rAAV，即为rAAV/HO-1。按照吴小兵等发明的rAAV病毒的快速纯化方法(专利申请号：99123723.4)进行rAAV/HO-1的分离和纯化。rAAV/GFP和rAAV/HO-1载体的滴度(抗DNase I颗粒)通过以地高辛标记的CMV片断为探针的斑点杂交来测定。而rAAV/GFP的感染滴度通过流氏细胞仪检测。
动物模型的建立
LEW(RT1l)和F344(RT1/vl)大鼠从德国汉挪威医学院动物研究所购得，在香港大学动物中心饲养。所有的实验过程均依照学院的指南进行，并经活体动物教学与研究委员会批准。以体重200～250克的LEW和F344大鼠分别为供者或受者进行心脏的异体移植。同系移植中，LEW大鼠作为受体。简述如下：在HTK溶液(Koehler Chemie，Germany)原位灌注共体心脏移植物后，将1×1012vg剂量的rAAV/GFP或rAAV/HO-1通过冠状动脉灌注到移植物中。移植前，移植物被保存在冷HTK溶液中6小时，移植方法如文献所述31。移植物的功能通过每天触诊来监测，而心室收缩的完全停止提示移植排斥，并经病理检查来明确。
化学药品
环孢霉素A(CsA，Novartis制药厂，瑞士)，移植后0～4天肌肉注射，剂量2.5mg/kg/天。HO-1抑制剂，zinc protoprophyrin IX(ZnPPIX，Calbiochem-Novabiochem，德国)腹腔内注射，剂量见实验方案。
实验方案
实验动物分组如下：1)对照组，不作处理；2)载体对照组，只给予rAAV/GFP；3)rAAV/HO-1处理组；4)CsA处理组，2.5mg/kg/天，移植后0～4天肌肉注射；5)rAAV/HO-1+CsA(2.5mg/kg/天，移植后0～4天肌肉注射)处理组；6)rAAV/HO-1+CsA(2.5mg/kg/天移植后0～4天肌肉注射)+ZnPPIX(2mg/kg/天，移植后0～30天腹腔内注射)处理组；7)rAAV/HO-1+CsA(2.5mg/kg/天移植后0～4天肌肉注射)+ZnPPIX(2mg/kg/天，移植后31～60天腹腔内注射)处理组。
病理、免疫组化和Western印记分析
长期存活的移植物在移植后100天被取出，速冻保存于-70℃。病理切片经HE、Verheoff苏木精和马松氏三种染色来观察移植物的组织学情况、纤维成分和血管的弹性蛋白的沉积情况。Verheoff苏木精染色后，移植物中中级动脉的细胞增生水平分级如下：0级(无增生)，0.5级(轻微增生)，1级(5～25％)，2级(25～50％)，3级(＞50％)14。马松氏染色后组织截面的纤维化的面积由计算机软件(Meta Morph imaging system，Universal ImagingCorporation，PA)算出。所有的检测都采用双盲的方法，动脉增生分级检测中每个移植物至少检测50个血管，在每组3-5个移植物的纤维化面积的检测中每个移植物至少检测20个视野。采用辣根过氧化物酶显色系统的免疫组化方法来检测移植物中细胞浸润的情况。应用小鼠抗大鼠CD3，巨噬细胞(ED1)和HO-1(OSA-111)的单克隆抗体(BD公司，Serotec andStressgene)来检测移植物中单核细胞浸润的情况和HO-1表达的情况。HO-1蛋白的表达水平用标准的Westen印记的方法测得。
测量HO的酶活性
HO-1的活性可以通过它的两个终产物---一氧化碳和胆红素来检测。一氧化碳的量可以通过紫外分光光度计检测外周血中一氧化碳结合的血红蛋白的含量来评价32。移植物中胆红素的含量的测定如文献所述21，简言之，冰冻移植物标本在预冷的蔗糖和Tris-HCl缓冲液中制成匀浆。离心后得到微粒体沉淀，重悬于MgCl2-磷酸钾缓冲液中。然后将标本与含有大鼠肝细胞质、血晶质、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和NADPH(Sigma-Aldrich公司)的反应混合物在37℃共孵育60分钟。与重氮surfanilic酸反应后生成偶氮胆红素，其含量可由分光光度计测得。移植物中胆红素的水平由其在移植物/受者原有心脏中的含量的比值得出。
抗供者的抗体
移植后100天收集动物模型的血清，通过流氏细胞仪来检测其中各种特异性抗同种抗原的同种异型抗体。首先制备供者胸腺细胞的悬液，并于加热灭活的受者血清共孵育。生物素标记的抗大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgM的单克隆抗体(BD公司)用来检测各种特异性抗同种抗原的同种异型抗体。每种抗体的水平由测量管中的平均荧光强度测得，并由样本/正常大鼠的比值计算出。
基因表达谱的检测
经rAAV/HO-1处理和未经rAAV/HO-1处理的移植物的基因表达谱由cDNA芯片测出。方法简述如下：首先提取整个移植物的总RNA(Qiagen)，要求纯度较高，反转录成cDNA并在其中掺入Cy3和Cy5。标记的探针预先混合并与玻璃芯片(Clontech)上的DNA序列进行杂交。检测芯片上的信号数据，并以Quantarray软件分析。所有的数据都与芯片上的9种看家基因比较，进行标准化。RNA酶保护实验按照厂商(RiboQuant，BD公司)提供的说明书进行，简述如下：每份样本取20ug RNA与互补的[32P]UTP标记的ribo探针杂交，经RNA酶消化后，上样于聚丙烯酰胺变性凝胶，与探针互补的RNA可以被保护，而不被RNA酶消化，并可经X-ray片曝光后检测到。应用半定量RT-PCR的方法来检测PAI-1、PAI-2、uPA和tPA在移植后100天的移植物中的表达水平。
统计分析：
存活率数值通过Mann-Whitney U检验，其余的实验数据经t检验，P＜0.05者认为有统计学意义。
实施例
以下实施例对本发明作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。
实施例1
腺相关病毒载体介导HO-1基因的稳定表达
复制缺陷的腺相关病毒载体是由基因表达框替代2型腺相关病毒基因组(除145bp的ITR)而构建成的(图1a)。大鼠HO-1或GFP由人CMV启动子控制表达。应用大鼠心脏移植模型，首先，我们考察了在大鼠移植心脏低温保存时经冠状动脉灌注基因表达载体(1*1012vg)并进行同种移植后的外源基因表达情况和活性，GFP基因在移植后7天即可在血管周围区域表达(图1b)。免疫组化分析证实移植后7天在血管内皮细胞也可检测到HO-1基因的表达(图1c)。然而，转基因表达的GFP和HO-1只有在移植后30天才可以在心肌细胞内检测到(图1d和e)。Western印记结果显示移植物内HO-1蛋白含量的持续增加(图1f)。然后，我们通过HO-1酶的两个终产物---一氧化碳和胆绿素(在胆绿素还原酶的作用下迅速还原为胆红素)来检测HO-1的活性。一氧化碳可以通过外周血中一氧化碳结合的血红蛋白的含量来检测，其含量在移植后14天迅速增加(6.51±0.70％，n＝5)，并持续达3个月(图1g)。而GFP对照组则检测不到一氧化碳结合血红蛋白。在移植后的100天，rAAV/HO-1处理的移植物中胆红素的含量(1.32±0.09，n＝5，p＝0.0014)也明显高于rAAV/GFp处理的移植物(0.94±0.05，n＝5)(图1h)。
实施例2
稳定表达的HO-1基因可以使移植物长期存活
为了探讨rAAV介导的HO-1基因表对于大鼠同种器官移植模型的作用，我们将LEW大鼠的心脏移植给F344大鼠。在没有治疗干预的情况下，LEW大鼠的心脏平均在移植后21天(平均存活时间，MST)被排斥(n＝7，图2a)。向心脏移植物中灌注rAAV/HO-1可以避免急性排斥的发生，并使7只动物中有4只的移植物长期存活(MST＞100天，n＝7，p＜0.05)，而所有灌注rAAV/GFP的移植物和未作处理的对照组一样被急性排斥掉(MST＝20天，n＝6)。另外短期给予受者CsA(2.5mg/kg/天，移植后0～4天)可以明显的提高rAAV/HO-1处理的移植物的长期存活率，9只动物中的8只的移植物长期存活，(n＝9)，而10只单纯给予CsA的动物的移植物中只有5只长期存活率(n＝10，p＜0.05，图2b)。
为了考察rAAV/HO-1的长期治疗效果，在移植后100天，我们检测了移植物和受体动物免疫反应的多种指标。更重要的是，rAAV/HO-1处理组的血清中抗供者的IgG1，IgG2b和IgM抗体明显降低(与CsA处理组相比，p＜0.01，图2c)。另外，在移植后100天检测，发现rAAV/HO-1处理组的移植物中单核细胞(T细胞核巨噬细胞)浸润的情况与CsA处理组相比明显减轻(结果未显示)。为了考察血管损伤的情况，在移植后100天，我们将移植物的血管切片进行Verheoff氏苏木精染色以显示弹性蛋白。在CsA处理组，所有移植物的中级动脉的内可见大量的细胞增生和严重的管腔狭窄(血管损伤级别＝2.46±0.24，n＝5，图2d)，而rAAV/HO-1处理组的移植物血管中没有或只见轻度的细胞增生(血管损伤级别＝0.91±0.08，n＝5，p＜0.001，图2e)。同时，rAAV/HO-1处理组的α平滑肌肌动蛋白在移植物小动脉中的沉积也明显减轻，这提示rAAV/HO-1减轻移植物血管中的细胞增生是通过抑制平滑肌细胞的增殖来实现的(图2f和g)。
实施例3
HO-1基因在移植物存活中的作用
为了进一步探讨rAAV介导的HO-1基因长期表达在移植后早期和晚期的作用，我们在移植后早期(0～30天)或后期(30～100天)在动物模型的腹腔内注射protophorphyrin锌IX(ZnPPIX，一种HO抑制剂)。HO阻断的效果可以由受者外周血中一氧化碳结合血红蛋白的含量来控制。给予受者ZnPPIX 2mg/kg/天可以明显抑制HO的活性，表现为一氧化碳结合血红蛋白的含量持续降低，与未处理组相同。停用ZnPPIX后，HO的活性恢复，表现为一氧化碳结合血红蛋白的含量可升至和rAAV/HO-1处理组的水平相当(图3a，b，c)。
然后，我们检测了rAAV/HO-1加CsA处理组中，HO-1基因在移植后不同时间表达对于移植物存活的重要性。在rAAV/HO-1处理组，如果同时在移植后0～30天给予ZnPPIX或缩短抑制物的存活期限(图3d)。但是如果在移植后31～100天给予ZnPPIX则不会影响移植物的存活期(图3e)。然而，在移植后期增加HO的活性可以明显改善移植物的动脉粥样硬化的严重程度和病变血管的数量(血管病变的分级＝1.37±0.19，n＝3，p＜0.001，图3f)；但在移植后早期增加HO-1的活性，而在移植后晚期(31～100天)阻断HO-1的活性却不能明显改善动脉粥样硬化的严重程度(血管病变的分级＝2.19±0.09，n＝3，p＝0.07，图3g)
实施例4
HO-1的表达减少移植物中的间质纤维化程度
为了考察长期表达的HO-1基因的保护心肌细胞免受移植损伤和间质纤维化的作用，我们通过病理和免疫细胞组化来估计移植物的纤维化程度。在移植后100天，环孢霉素A(CsA)处理的动物模型中，移植物中可见大量的纤维化和心肌细胞的坏死，而rAAV/HO-1处理的移植物中绝大多数的心肌细胞的结构得以完好保存(图4a)。马松氏纤维染色可见rAAV/HO-1处理可以明显减少移植物中纤维化的面积(19.0±7.44％和43.6±9.37％，n＝5，p＜0.01，图4b)。另外，移植后100天，经rAAV/HO-1处理可以减少移植物中纤链蛋白和纤维组织的主要成分之一------I型胶原的沉积。
实施例5
rAAV/HO-1处理的移植物的基因表达谱
为了了解rAAV/HO-1对移植物的基因表达的影响，我们通过cDNA表达芯片分析了移植后100天CsA和CsA加rAAV/HO-1处理组的移植物组织标本的基因表达谱。结果显示，rAAV介导的HO-1基因的过表达下调了前炎症因子(如：肿瘤坏死因子α)和MIP、MMIF等趋化因子的表达(倍数log2＜-1，见表1)。TGF-B1，血小板衍生生长因子，纤维生长因子2和胰岛素样生长因子在rAAV/HO-1处理的移植物中的表达也是下降的。另外，IFN-γ、IL-2和IL-2受体α链的mRNA的转录在rAAV/HO-1处理的移植物中的表达也是下降的，而对IL-4和IL-10的影响不大(结果未显示)。以上结果在RNA保护实验或RT-PCR中也得到了证实(结果未显示)。
实施例6
调节TGF-β的信号传导途径
过量的TGF-B1会导致调节细胞外籍质形成的多种蛋白质的表达失调。rAAV介导的HO-1基因的长期表达使移植后100天的移植物内TGF-B1的mRNA的表达量下降(图5a)。为了进一步了解HO-1在TGF-B1信号传导途径中的调节作用，我们检测了TGF-B1的信号传导通路中最主要的中介-----Smad蛋白家族(human analogue of the mothers againstdecapentaplegic protein)的mRNA的水平。在移植后100天检测，rAAV介导的HO-1基因的过表达可以明显下调移植物内Smad2和Smad3的mRNA的水平，而抑制TGF-B1信号传导的Smad6的水平未受影响(图5b)。另外，cDNA芯片(见表)和半定量RT-PCR的结果都显示，rAAV/HO-1处理组在移植后100天，纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)和PAI-2的mRNA水平都降低(图5c)，而同时尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)和组织纤溶酶原激活物(tPA)的mRNA水平上调。
对各图例的文字说明：
Figure 1.The expression patterns of rAAV mediated gene transfer.
α.Gene expression cassette of adeno-associated viral vector；ITR，the 145-basepair terminalrepeats；hCMV，human cytomegalovirus promoter；GFP，green fluorescent protein；rHO-1，ratheme oxygenase-1.b.Expression of GFP in the perivascular area of heart graft on post-transplantday 7.1×1012 vector genomes of rAAV/GFP were administered through the coronary artery ofgraft during cold preservation.Syngeneic heart transplantation was performed in LEW rats(original 400×).d.Expression of HO-1 was detected in endothelial cells of the vessel of graft onday 7 after administration of AAV/HO-1(original 400×).d & e.Expression of GFP(d)and HO-1(e)in the cardiomyocytes were detected on day 30(original 200×).f.Representative picture ofHO-1 protein in the grafts(western blot analysis).g.Activity of HO was determined bymeasurement of carbon monoxide production presented as carboxyhemoglobin in the peripheralblood of recipient animals.The level of carboxyhemoglobin increased in animals bearingAAV/HO-1 treated grafts on day 14 and persisted in a stable level for 3 months.g.The intragraftlevel of bilirubin.The bilirubin level of AAV/HO-1 treated grafts significantly increased to 1.32±0.09(sample/naive heart，n＝5，mean±sd)，P＝0.0014 versus rAAV/GFP treated graft(0.94±0.05，n＝5).
Figure 2.The effects of AAV/HO-1 gene transfer in LEW to F344 heart transplantationmodel.a.57.1％ of AAV/HO-1 treated grafts survived over 100 days in the absence of anytherapeutic intervention(MST：＞100 days，AAV/HO-1，n＝7，solid line)，P＜0.05 versus“None”control group(MST：21 days，n＝7，long dashed line)and AAV/GFP group(MST：20 days，n＝6，short dashed line).b.In the presence of short-course CsA(2.5mg/kg，days 0-4)，88.9％ofAAV/HO-1 treated grafts survived over than 100 days(MST：100 days，n＝9，solid line)，P＜0.05versus CsA only group，50％ of grafts survived longer than 100 days(MST：＞76.5，n＝10，dashedline).c.The serum level of anti-donor antibodies on day 100 was detected by flow cytometricanalysis.The data were demonstrated as ratio of sample/naive rat serum(MCF，mean channelfluorescence)；IgGl，IgG2b，IgM were significantly reduced in AAV/HO-1 group，n＝5，P＜0.05.d&e.Verhoeff’s haematoxylin staining of elastin(black)，CsA(d)，CsA+AAV/HO-1(e)；theseverity of intimal proliferation of the median arteries of grafts was showed.These arerepresentative pictures of more than 50 median arteries from continuous sections of 5 grafts pereach group.f & g.Immunofluorescence staining of α smooth muscle cell actin(green)in thegrafts of CsA(f)or CsA+AAV/FHO-1(g)groups.These are representative pictures，whichshowed the increase of deposition of α smooth muscle cell actin in median arteries(f).Figure 3.The functional relevance of long-term expression of HO-1 mediated byAAV/HO-1.α-c.The efficiency of HO-1 inhibitor(ZnPPIX)on the inhibition of HO enzymeactivity was detected by measurement of the level of carboxyhemoglobin in the peripheral bloodof recipient rats.The level of carboxyhemoglobin in the rats of CsA group and CsA+AAV/HO-1groups(a)；ZnPPIX was given to the rats of CsA+AAV/HO-1 group from daysl-30(b)or days31-100(c).Data are shown as mean±SD from 5 rats per time point.d & e.the graft survivalrate of CsA group(n＝6，dashed line)and CsA+AAV/HO-1 group(n＝6，solid line)afteradministration of ZnPPIx from days 0-30(d)or days 31-100(e).f & g.The comparison of theintimal proliferation of median arteries of grafts treated with AAV/HO-1 and inhibition of HOenzyme activity at days 0-30 (f) or days 31-100(g)after elastin staining by Verhoeffshaematoxylin.h.Grading of graft arteriosclerosis by measuring the intimal proliferation of medianarteries of grafts from different groups.Data were showed as Mean±S.E.M.*P＜0.001，**P＝0.07 versus CsA group.
Figure 4.HO-1 prevents the development of interstitial fibrosis of the grafts on day 100.a.Haematoxylin and eosin staining(original 100×)and Masson’s trichrome staining(original 200×)of sections from grafts of CsA and CsA+AAV/HO-1 groups on day 100.b.The measurement offibrotic areas of sections from grafts of CsA and CsA+AAV/HO-1 groups.The data are shown asMean±SD from＞20 sections/grafts and 3 grafts/group.*P＜0.001 versus CsA group.c.Theimmunofluorescence staining of Collagen I and fibronectin in the grafts on day 100(FITC，original200×).
Figure 5.Under-expression of TGF-β1 and PAI-1 mRNA in the rAAV/HO-1 trested graftson day 100.a & b.Representative pictures of mRNA expression level of TGF-β1(a)and Smadprotein family(b)in the grafts on day 100 by RNase protection assay.c.The mRNA 1evel ofPAI-1，PAI-2，tPA and uPA was detected by semi-quantitative RT-PCR.The data are therepresentative of 5 grafts/group.
Table.The gene expression profiling of rAAV/HO-1 treated grafts on day 100.The data shown was selected from cDNA microarray data under the classification of growthfactors，cytokines and chemokines，protease inhibitor，and serine protease.The fold changes ofgenes were normalized with house-keeping genes and were considered as significance when thenumber was greater orlower than 1(log 2).
表1.
Gene No. Genes Fold(log2)
Proinflammatory cytokines and chemokines
R689 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor -1.91
RG434 Macrophage inflammatory protein 2 beta -1.79
R534 Macrophage inflammatory protein 3 alpha -1.62
R579 Tumor necrosis factor alpha -1.62
R696 Macrophage inflammatory protein 1alpha -1.08
R500 Macrophage migration inhibitory factor -1.05
Transforming growth factor superfamily
RG538 Bone morphogenetic protein 4 -2.51
RG243 Bone morphogenetic protein 3 -2.16
RG342 Transfbrming growth factor beta1 -1.84
R412 Transforming growth factor beta3 -1.47
RG539 Bone morphogenetic protein 2 -1.18
Other growth factors
RG045 Fibroblast growth factor 5 -1.76
R128 Fibroblast growth factor 10 -1.63
R649 Insulin-like growth factor 1B -1.59
R191 Platelet-derived growth factor A -1.29
R291 Glioma-de rived vascular endothelial cell growth factor -1.26
RG149 Fibroblast growth factor 2 -1.23
R251 Insulin-like growth factor 2 -1.13
Protease inhibitors
RG358 Calpastatin -2.78
RG526 Plasminogen activator inhibitor 2A -2.55
R156 Plasma protease inhibitor-alphal -2.32
R456 Tissue inhibitor of metallproteinase 3 -1.45
R272 Plasminogen activator inhibitor1 -1.04
Serine proteases
R575 Urokinase-type plasminogen activator 3.08
RG058 Dipeptidyl peptidase 4 2.30
R271 Tissue-type plasminogen activator 1.24
R349 Dipeptidyl peptidase 6 1.13
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对各图例及附表文字说明的中文解释：
图1.由rAAV介导的外源基因的表达情况。
α.腺相关病毒载体的基因表达框；ITR，145bp的末端重复序列；hCMV，人巨细胞病毒启动子；GFP，绿色荧光蛋白；rHO-1，大鼠血红素加氧酶。b.移植后7天GFP基因在移植物中的血管周围区域表达。1*1012vg基因表达载体在大鼠移植心脏低温保存时经冠状动脉灌注。同系LEW大鼠心脏移植(400×)。c.移植后7天在血管内皮细胞检测到HO-1基因的表达(400×)。d.和e.在移植后30天在心肌细胞内检测到转基因表达的GFP(d)和HO-1(e)。f.移植物内HO-1蛋白含量(Western印记)g.以一氧化碳的产量(由外周血中一氧化碳结合的血红蛋白的含量来显示)来检测HO-1的活性，一氧化碳结合的血红蛋白含量在rAAV/HO-1处理组移植后14天增加，并持续3个月。h.移植物中胆红素的含量。rAAV/HO-1处理的移植物中胆红素的含量(1.32±0.09，n＝5，p＝0.0014)明显高于rAAV/GFP处理的移植物(0.94±0.05，n＝5)。
图2.rAAV/HO-1基因表对于大鼠同种器官移植模型的作用
a.rAAV/HO-1处理组中，在没有其他治疗干预的情况下，57.1％的移植物长期存活(MST＞100天，rAAV/HO-1处理组，n＝7，实线)与未处理对照组(MST：21天，n＝7，长虚线)和rAAV/GFP组(MST：20天，n＝6，短虚线)比较，p＜0.05。b.合用rAAV/HO-1处理使短期给予CsA(2.5mg/kg/天，移植后0～4天)的受者的移植物的长期存活率(MST＞100天，n＝9，实线)由单纯给予CsA组(MST＞76.5天，n＝10，虚线)的50％提高至88.9％，p＜0.05。c.流式细胞仪检测移植后100天受者血清中抗供者抗体水平。以样本/空白对照组检测值(MCF，平均通道荧光强度)的比值表示，rAAV/HO-1处理组的IgG1，IgG2b和IgM抗体与CsA处理组相比明显降低，(n＝5，p＜0.01)d.和e.Verheoff氏苏木精染色显示弹性蛋白(黑色)CsA处理组(d.)fAAV/HO-1加CsA处理组(e.)移植物中级动脉内细胞增生的严重程度。图中所示为50个中级动脉(每组取5个移植物)的连续切片的由代表性的结果。f.和g.移植物中α平滑肌肌动蛋白(绿色)的荧光染色，CsA处理组(f.)rAAV/HO-1加CsA处理组(g.)；所示为代表性照片，显示移植物小动脉中α平滑肌肌动蛋白的沉积增加(f.)。
图3.rAAV介导的HO-1基因长期表达的作用
a-c.HO抑制剂(ZnPPIX)阻断HO-1活性的效果可以由受者外周血中一氧化碳结合血红蛋白的含量检测到。CsA处理组和rAAV/HO-1加CsA处理组的一氧化碳结合血红蛋白的含量(a)；rAAV/HO-1加CsA处理组分别在移植后1～30天(b)和移植后31～100天(c)给予ZnPPIX的一氧化碳结合血红蛋白含量。每个时间点的数值为5只大鼠检测值的平均值±标准差。d.和e.CsA处理组(n＝6，虚线)和rAAV/HO-1加CsA处理组(n＝6，实线)分别在移植后1～30天(d)和移植后31～100天(e)给予ZnPPIX的移植物存活率。f.和g.Verheoff氏苏木精弹性蛋白染色后比较rAAV/HO-1处理组分别在移植后1～30天(f)和移植后31～100天(g)给予ZnPPIX后，移植物中级动脉内细胞增生的严重程度。h.依据各组移植物中级动脉内细胞增生的程度进行血管病变的分级。数据显示为平均值±SEM。*CsA处理组比较，p＜0.001，**CsA处理组比较，p＝0.07。
图4.HO-1在移植后100天显示其能够阻止移植物内间质纤维化的发生。a.移植后100天，CsA处理组和rAAV/HO-1加CsA处理组的移植物组织切片：苏木精和伊红染色(100×)，马松氏三染色(200×)。b.CsA处理组和rAAV/HO-1加CsA处理组的移植物组织切片中纤维化面积。结果显示为每组3个移植物，每个移植物20个切片的测量结果的平均值±标准差。*p＜0.001与CsA处理组比较。c.移植后100天移植物中I型胶原和纤粘连蛋白的免疫荧光染色(FITC，200×)。
图5.在移植后100天，rAAV/HO-1处理组的移植物内TGF-β和PAI-1的mRNA表达量下降。
a和b.在移植后100天，RNA酶保护实验显示的TGF-β(a)和Smad家族蛋白的mRNA表达水平。c.半定量PCR检测移植物(每组5个)中PAI-1、PAI-2、tPA、uPA的mRNA水平
图6是质粒pSNAV1-HO-1的图谱。
表 移植后100天，rAAV/HO-1处理组的移植物内的基因表达谱。
选择检测生长因子、细胞因子、趋化因子、蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶的cDNA基因芯片。以看家基因将检测数值进行标准化，当基因的变化的倍数大于或低于1(log2)时认为基因表达水平有差异。
表1.
基因号 基因名称 倍数(log2)
前炎性细胞因子和趋化因子(Proinflammatory cytokines and chemokines)
R689 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(G-MCSF) -1.91
RG434 巨噬细胞炎性蛋白-2β(MIP-2β) -1.79
R534 巨噬细胞炎性蛋白-3α(MIP-3α) -1.62
R579 肿瘤坏死因子-α(TNF-α) -1.62
R696 巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α) -1.08
R500 巨噬细胞移植抑制因子(MMIF) -1.05
转化生长因子超家族(Transforming growth factor superfamily)
RG538 骨形成蛋白-4(BMP-4) -2.51
RG243 骨形成蛋白-3(BMP-3) -2.16
RG342 转化生长因子β1(TGF-β1) -1.84
R412 转化生长因子β3(TGF-β3) -1.47
RG539 骨形成蛋白-2(BMP-2) -1.18
其它的生长因子
RG045 纤维原细胞生长因子-5(FGF-5) -1.76
R128 纤维原细胞生长因子-10(FGF-10) -1.63
R649 胰岛素样生长因子-1B(I-LGF-1B) -1.59
R191 血小板来源的生长因子-A(P-DGF-A) -1.29
R291 神经胶质瘤来源的血管内皮细胞生长因子(G-DVECGF) -1.26
RG149 纤维原细胞生长因子-2(FGF-2) -1.23
R251 胰岛素样生长因子-2(I-LGF-2) -1.13
蛋白酶抑制剂(Protease inhibitors)
RG358 钙蛋白酶抑制蛋白 -2.78
RG526 血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂-2A(PAI-2A) -2.55
R156 血浆蛋白酶抑制剂α1 -2.32
R456 组织金属蛋白酶抑制剂-3(TIMP-3) -1.45
R272 血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1) -1.04
丝氨酸蛋白酶(Serine proteases)
R575 尿激酶型纤溶酶激活物(uPA) 3.08
RG058 二肽酰肽酶4 2.30
R271 组织型纤溶酶激活物(tPA) 1.24
R349 二肽酰肽酶6 1.13