口服ECB药物制剂和药物组合物的制备方法 【发明领域】
本发明涉及含有抗真菌化合物的药物制剂或药物组合物的制备方法，特别是，将棘白菌素/糖类复合物掺入到口服制剂或组合物中以增强稳定性。
【发明背景】
药物的口服制剂可以通过扁囊剂、咀嚼片剂或常规片剂、胶囊剂或口服溶液和悬浮液等对病人给药。为特定药物开发的制剂要取决于多种因素。例如，本领域中众所周知：口服制剂应当足够稳定、具有可接受的外观并用普遍承认的安全赋形剂制备。
设计制剂时，稳定性是一个重要的考虑因素，尤其是对于口服应用。出于现实和商业的原因，人们希望足够的制剂稳定性能维持至少2年。因此，主要的制剂设计目标是优化在所选定的储存条件(例如室温)下的保存期和稳定性。
棘白菌素化合物的不稳定性使得它们特别难以制剂。迄今所检验的大多数制剂在室温下的保存期都小于1年。通常希望至少两年的保存期。因此，需要具有改善的热稳定性的含有棘白菌素化合物的口服制剂。
发明概述
申请人已发现，在特定生产阶段向棘白菌素制剂中掺入一种或多种糖类使热稳定性得到了显著改善。在本发明的一个实施方案中，提供了制备口服药物制剂的方法，它包括(i)将棘白菌素化合物或棘白菌素/糖类复合物与至少一种糖类在溶剂或溶剂混合物中混合形成药物溶液；(ii)将该溶液喷雾到一层流化颗粒状稀释剂或载体(例如颗粒状糖类)上；和(iii)除去过量的一种或多种溶剂。药物溶液可以任选地含有表面活性剂、矫味剂、着色剂和/或加工助剂。还提供了利用上述方法制备的口服颗粒状药物制剂，以及由其制备地药物诸如扁囊剂(sachet)和咀嚼片剂。
在本发明的另一个实施方案中，提供了制备口服药物制剂的方法，它包括下列步骤：(i)将棘白菌素化合物或棘白菌素/糖类复合物、至少一种糖类和可溶性成粒剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)在溶剂或溶剂混合物中混合形成药物溶液；(ii)将该溶液喷雾到一层流化非颗粒状稀释剂或载体(例如糖类粉末)上；和(iii)除去过量的一种或多种溶剂。药物溶液可以任选地含有表面活性剂、矫味剂、着色剂和/或加工助剂。还提供了利用上述方法制备的口服颗粒状药物制剂，以及由其制备的药物诸如扁囊剂和咀嚼片剂。
在本发明的又一个实施方案中，提供了治疗需要这种治疗的哺乳动物的抗真菌感染的方法，它包括对哺乳动物给药利用上述方法之一制备的口服制剂。
术语“棘白菌素”指的是具有下列通式结构的化合物：其中：R是烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、或其组合；R1、R2、R3、R6、R7和R10独立地为羟基或氢；R4是氢、甲基或-CH2C(O)NH2；R5和R11独立地为甲基或氢；
R8是-OH、-OPO3H2、-OPO3HCH3、-OPO2HCH3或-OSO3H；和
R9是-H、-OH或-OSO3H。
“棘白菌素B”或“ECB”指的是其中R1、R2、R3、R6、R7、R8和R10为羟基；R4、R5和R11为甲基；R9为氢的上述棘白菌素化合物。在天然产物中，R是亚油酰基(linoleoyl)。在特别有用的半合成化合物中，R具有刚性和柔性两种组分，例如其中R由下式表示的化合物：
除非另有说明，否则术语“烷基”指的是含有1至30个碳原子的通式为CnH2n+1的烃基。烷烃基可以是直链、支链、环状或多环的。烷烃基可以是取代或未取代的。类似地，烷氧基或链烷酸酯的烷基部分具有与上面相同的定义。
术语“链烯基”指的是含有至少一个碳-碳双键的无环烃。烯烃基可以是直链、支链、环状或多环的。烯烃基可以是取代或未取代的。
术语“炔基”指的是含有至少一个碳-碳三键的无环烃。炔基可以是直链或支链的。炔基可以是取代或未取代的。
术语“芳基”指的是具有单环(例如苯基)或稠环系统(例如萘、蒽、菲等)的芳香基。芳基可以是取代或未取代的。取代芳基包括一个芳族部分的链(例如：联苯、三联苯、苯基萘亚甲基等)。
术语“杂芳基”指的是在芳环系统中含有至少一个杂原子的芳香基(例如：吡咯、吡啶、吲哚、噻吩、呋喃、苯并呋喃、咪唑、嘧啶、嘌呤、苯并咪唑、喹啉等)。该芳香基可以由单环或稠环系统组成。杂芳基可以是取代或未取代的。
“棘白菌素/糖类复合物”指的是当棘白菌素在糖类的存在下从溶剂中结晶或重结晶时，在棘白菌素化合物和糖类间形成的结晶复合物。对棘白菌素/糖类复合物的更详细的描述可以见Larew等于1999年3月3日提交的题为“棘白菌素/糖类复合物”的申请，该申请引入本文作为参考。
“糖类”指的是由式Cn(H2O)n代表的多元醇的醛或酮衍生物(例如葡萄糖，C6(H2O)6；蔗糖，C12(H2O)11)。糖类包括具有相对小分子的化合物，诸如简单糖(例如单糖、二糖等)，以及大分子(聚合)物质，诸如淀粉、糖原和纤维素多糖。糖是具有普遍组成(CH2O)n的碳水化合物(糖类)及其简单衍生物。尽管简单的单体糖(葡萄糖)描述为多羟基醛或酮，例如HOCH2-(CHOH)4-CHO为己醛糖(例如葡萄糖)或者HOCH2-(CHOH)3-CO-CH2OH为2-酮糖(例如果糖)，但结构通常写成5(呋喃糖)或6(吡喃糖)元环的环醚，例如：
术语“颗粒状”稀释剂或载体指的是其中大约70％重量的物质具有大于150微米的粒径的物质。
术语“非颗粒状”或“粉末”稀释剂或载体指的是其中大约70％重量的物质具有小于150微米的粒径的物质。
术语“成粒剂”是指随着将该剂在一种或多种溶剂的存在下喷雾到稀释剂粉末的表面上而使稀释剂或载体结合到一起形成大的聚集体或颗粒的粘合剂。
详细描述
申请人已发现：口服棘白菌素制剂或组合物的稳定性可以通过将棘白菌素化合物以棘白菌素/糖类复合物形式掺入到药物组合物中或者通过原位形成棘白菌素/糖类复合物而得以增强。例如，棘白菌素/糖类复合物可以通过将棘白菌素化合物与糖类在合适的溶剂中混合得到药物溶液、然后将其喷雾到颗粒流化床上而原位形成。或者，棘白菌素/糖类药物溶液可以喷雾到非颗粒状(或粉末)稀释剂或载体的流化床上。优选地，将成粒剂在一种或多种溶剂的存在下加入到喷雾溶液中以使粉末结合在一起形成大的聚集体或颗粒。为了最有效地实现这一点，成粒剂应当可溶于药物溶液中所用的溶剂系统。对于丙酮/水溶剂系统来说，优选的成粒剂是聚乙烯吡咯烷酮(例如可从BASF公司购得的PovidoneTM)。
合适的糖类包括阿东糖醇、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、抗坏血酸、壳多糖、D-纤维素二糖(D-cellubiose)、2-脱氧-D-核糖、半乳糖醇、(S)-(+)-赤藓酮糖、果糖、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、肌醇、乳糖、乳果糖、来苏糖、麦芽糖醇、麦芽糖、麦芽三糖、甘露糖醇、甘露糖、松三糖、蜜二糖、微晶纤维素、异麦芽酮糖(palatinose)、季戊四醇、棉子糖、鼠李糖、核糖、山梨糖醇、山梨糖、淀粉、蔗糖、海藻糖、木糖醇、木糖及其水合物。合适的糖类还包括上列化合物的D和L对映体以及α和β端基异构体。优选的糖类是简单糖(例如单糖和二糖)。特别有用的糖包括L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、2-脱氧-D-核糖、(S)-(+)-赤藓酮糖、D-果糖、D-(+)-岩藻糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、β-D-葡萄糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-麦芽糖、麦芽三糖、松三糖、异麦芽酮糖、D-棉子糖、D-山梨糖醇、D-海藻糖、木糖醇、L-木糖及其水合物。当使用棘白菌素/糖类复合物时，加入的糖类可以与复合物中的糖类相同或不同。
合适的溶剂包括对于进行中的足以使棘白菌素和糖类物质溶解从而提供一个可用于流化床喷雾过程的介质的过程来说是惰性的任何一种溶剂或溶剂混合物(一般是质子溶剂或酮溶剂)。优选的用于药物喷雾溶液的溶剂系统是水和丙酮的混合物。尽管可以使用将能溶解棘白菌素或棘白菌素/糖类复合物和糖类的水和丙酮的任何百分比的混合物，但以体积计，丙酮的优选百分数为约50％至70％。
合适的颗粒状和非颗粒状(或粉末)物质包括上述糖类以及纤维素/淀粉物质，聚乙二醇4000、6000和8000(例如高熔点固体PEG系列；可从Union Carbide公司购得)，羟丙基甲基纤维素(HPMC；可从Shin-Etsu化学有限公司购得)，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(例如HP-50，HP-55，HP-55S；也可从Shin-Etsu化学有限公司购得)，和葡萄糖结合剂(dextrates)(例如：EmdexTM；可从EdwardMendell股份有限公司购得，和DextrinTM；可从Matheson Colleman&Bell购得)。优选的颗粒状或非颗粒状物质是糖类诸如果糖、葡萄糖、乳糖、乳果糖、麦芽糖醇、麦芽糖、麦芽三糖、甘露糖醇、甘露糖、微晶纤维素、HPMC、HPMC邻苯二甲酸酯、葡萄糖结合剂、糊精、山梨糖醇、山梨糖、淀粉和淀粉衍生物、蔗糖、海藻糖、木糖醇、木糖及其水合物。合适的糖类还包括D和L对映体以及α和β端基异构体。最优选的是低含水量的单糖和二糖，诸如甘露糖醇(例如MannogenTM 2080，可从SPI Polyols公司，New Castle，DE购得)、乳糖和麦芽糖。
将药物溶液在流化床造粒机/干燥器(例如Glatt GPCG-3，可从G1att Air Techniques，Inc.，Ramsey，New Jersey购得)中喷雾到流化颗粒或非颗粒状载体上。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但据信喷雾后的药物溶液随着干燥而在流化载体的表面上原位形成棘白菌素/糖类复合物。棘白菌素化合物通常以约5％至25％的重量百分比存在于最终的喷雾颗粒中，优选为从7％至20％，更优选从12％至16％。药物溶液中所用的糖类通常以从约5％至25％的重量百分比存在于最终的喷雾颗粒中，优选为从约7％至20％，更优选从约12％至16％。颗粒或非颗粒状载体通常以从约50％至90％的重量百分比存在于最终的喷雾颗粒中，优选为从约60％至80％，更优选从约65％至75％。
申请人已观察到，最终的喷雾颗粒显示出比开始的单独的大块(bulk)棘白菌素物质更好的热稳定性和增强的流动性。(参见实施例1)虽然制剂的主要赋形剂之一(即流化糖类-潜在的棘白菌素稳定剂)不是含有药物活性化合物的溶液的一部分，但喷雾颗粒仍显示出增强的稳定性。
评定流化床喷雾颗粒的相对热储存稳定性并与开始的大块(bulk)棘白菌素物质进行对比。对开始的大块棘白菌素物质和最终的喷雾颗粒进行HPLC分析，以测定降解产物的初始浓度，通常称之为％总相关物质(即％TRS)。然后将这两种样品在40℃下在分离的带有蜡乙烯铝箔(WVAF)盖封蜡的高密度聚乙烯(HDPE)瓶中储存1周和2周。在两个时间点通过HPLC测量％TRS的增量。表1显示了大块ECB化合物和利用上述流化床喷雾方法制备的ECB颗粒的试验过程间的％TRS变化。
表1 储存条件*开始的ECB大块化合物(％TRS)FB喷雾颗粒(％TRS) 起始 4.94％ 5.12％ 40℃下1周 +2.86％ +1.38％ 40℃下2周 +3.85％ +2.30％
*每个样品储存在用WVAF盖密闭的棕色不透明HDPE瓶中。
FB喷雾过程没有明显增加喷雾颗粒的％TRS。注意到下面这一点很重要：含有原位形成的棘白菌素/糖类复合物的FB喷雾颗粒在40℃下储存1周和2周后相对于开始的棘白菌素大块化合物显示出增强的储存稳定性(即较低的％TRS增量)。
表2显示了大块ECB化合物和利用上述流化床喷雾方法制备的ECB颗粒的第二试验过程间的％TRS变化。
表2 储存条件*开始的ECB大块化合物(％TRS) FB喷雾颗粒(％TRS) 起始 5.36％ 5.64％ 40℃下1周 +3.46％ +1.10％ 40℃下2周 +4.29％ +2.51％
*每个样品储存在用WVAF盖密闭的棕色不透明HDPE瓶中。
EB喷雾过程再一次没有明显增加喷雾颗粒的％TRS。含有原位形成的棘白菌素/糖类复合物的FB喷雾颗粒在40℃下储存1周和2周后相对于开始的棘白菌素大块化合物显示出增强的储存稳定性(即较低的％TRS增量)。除了观察到FB喷雾颗粒的稳定性增强以外，还观察到最终的FB喷雾颗粒的混合能力和流动性得到改善。
喷雾颗粒可以用于制备能对需要用所设计的产品进行治疗的病人口服给药的药物。例如，可以将喷雾颗粒包含在扁囊剂或胶囊剂中，或者压缩成片剂。最终的喷雾颗粒可以容易地直接填充到扁囊剂包装(sachet package)中，或者另一方面，可以容易地与附加的赋形剂混合后制成片剂、填充到胶囊或填充到药瓶中。
例如，喷雾颗粒在使用标准压片设备和技术压缩成片剂(可咀嚼的)之前可以与矫味剂、片剂崩解剂(例如羧甲基纤维素钠；可从FMC公司购得)、加工助剂(例如Syloid 63FP；可从Grace-Davison，Baltimore MD购得的二氧化硅)和片剂润滑剂诸如硬脂酸(可从Witco公司购得)或甘油二十二酸酯(可从Gattefosse公司购得)等于法混合。(参见，即：“口服固体剂型”，Remington药物科学，第90章，Mack出版公司，Pennsylvania，1985年。)
咀嚼片剂可以使用本领域技术人员熟知的标准方法加以生产。一般说来，咀嚼片剂含有以最终片剂的总重量计浓度在约0.1％至2.0％之间(优选在约0.2％至0.6重量％之间)的矫味剂(例如薄荷油、薄荷醇或冬青油等)，它们可以在对颗粒喷雾之前加入到棘白菌素/糖类药物溶液中。咀嚼片剂中通常还可加入甜味剂。但是，在本发明中，制剂中所用的糖类可以提供足够的甜味，使得不再需要另外的甜味剂。在制剂中使用甘露糖醇或麦芽糖作为载体也将为咀嚼片剂提供另外的甜味加上适当的“口感”/“凉爽感”和纹理。其他成分也可以通过与喷雾颗粒干法混合(例如转动箱或螺条混合机)而加入以形成最终的颗粒混合物。然后将该最终的颗粒混合物压缩成片剂。与常规片剂不同，在生产咀嚼片剂时通常使用较大的工具(例如枕形800号机床)。
除了已讨论过的那些物质以外，本发明的口服制剂或药物还可包括本领域技术人员熟知的其他载体、稀释剂和赋形剂，包括诸如蜡、水溶性和/或膨胀性聚合物、亲水或疏水物质、明胶、油、溶剂、水等物质。所用的特定载体、稀释剂或赋形剂将取决于活性成分的应用方式和目的。制剂还可包括润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、增香剂、着色剂、不透明剂、滑动剂、加工助剂及其组合。
用于本发明的环肽可以通过培养不同的微生物来制备。属于棘白菌素环肽族的合适的天然产物原料包括棘白菌素B、棘白菌素C、棘白菌素D、刺孢曲菌素Aγ、牟伦多菌素、孢子真菌素(Sporiofungin)A、肺炎菌素(Pneumocandin)A0、WF11899A和肺炎菌素B0。一般说来，环肽可以描绘为在氨基酸之一上带有酰化氨基的环六肽核。天然产环肽上的氨基一般用脂肪酸基酰化形成离开核的侧链。天然产酰基的实例包括亚油酰基(棘白菌素B、C和D)、棕榈酰(刺孢曲菌素Aγ和WF11899A)、硬脂酰、12-甲基肉豆蔻酰(牟伦多菌素)、10，12-二甲基肉豆蔻酰(孢子真菌素A和肺炎菌素A0)等等。
半合成衍生物可以通过将脂肪酸侧链从环肽核上除去而生成游离氨基(即：没有侧酰基-C(O)R)来制备。该游离胺然后用合适的酰基重新酰化。例如，棘白菌素B核用某些非天然产的侧链部分重新酰化而得到了许多抗真菌剂。参见，即：美国专利4,293,489(Debono)。本领域技术人员将领会到N-酰基侧链包括本领域中已知的各种各样的侧链部分。合适的侧链部分包括取代和未取代的烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基及其组合。优选该侧链含有直链的刚性区段和柔性的烷基区段，以最大化抗真菌效价。优选的酰基侧链的典型实例包括具有下列结构的R基：或
其中A、B、C和D独立地为氢、C1-C12烷基、C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷硫基、卤素、或-O-(CH2)m-[O-(CH2)n]p-O-(C1-C12烷基)或-O-(CH2)q-X-E；
m是2、3或4；n是2、3或4；p是0或1；q是2、3或4；
X是吡咯烷子基、哌啶子基或哌嗪子基；而E是氢、C1-C12烷基、C3-C12环烷基、苄基或C3-C12环烷基甲基。
如上所述，此处描述的环肽可以通过如本领域中所述将已知微生物发酵来制备。随后的脱酰作用一般使用脱酰酶通过本领域中所述的已知材料和方法酶促进行。
例如，结合在此作为参考的美国专利3,293,482(Abbott等人)描述了其中R4、R5和R11为甲基、R9为氢、R1、R2、R3、R6、R7、R8和R10各自为羟基的式I环肽的脱酰和制备。结合在此作为参考的美国专利4,299,763(Abbott等人)描述了其中R4、R5和R11为甲基、R2为羟基、R7和R9为氢、R1、R3、R6、R8和R10各自为羟基的式I环肽的脱酰和制备。结合在此作为参考的美国专利3,978,210(Mizuno等人)描述了刺孢曲菌素的制备。结合在此作为参考的美国专利4,304,716描述了其中R5为-CH2C(O)NH2、R11为甲基、R4和R9为氢、R1、R2、R3、R6、R7、R8和R10各自为羟基且带有取代基R的酰基为肉豆蔻酰的式I环肽的脱酰和制备。
其中R2和R7各自为氢的环肽可以通过让相应的化合物(其中R2和R7各自为羟基；鸟氨酸α氨基可以是游离氨基或酰化的)在-5℃到70℃之间的温度下在合适的溶剂中经受强酸和还原剂来制备。合适的强酸包括三氯乙酸、三氟乙酸或三氟化硼醚合物。优选的强酸是三氟乙酸。合适的还原剂包括氰基硼氢化钠或三乙基硅烷。优选的还原剂是三乙基硅烷。合适的溶剂包括二氯甲烷、氯仿或乙酸，优选二氯甲烷。强酸的存在量为约2至60mol/mol反应物，而还原剂的存在量为约2至60mol/mol反应物。酸还原过程选择性地除去缩醛胺(R2)和苄基(R7)的羟基。
鸟氨酸单元上的α-氨基的酰化可以用本领域技术人员熟知的各种方式来完成。例如，氨基可以通过与适当取代的酰卤反应而酰化，优选在酸清除剂诸如叔胺(例如三乙胺)的存在下进行。该反应一般在约-20℃至25℃之间的温度下进行。合适的反应溶剂包括极性质子惰性溶剂，诸如二噁烷或二甲基甲酰胺。溶剂选择不是决定性的，只要所用的溶剂对进行中的反应是惰性的且反应物能充分溶解以完成所需反应即可。
氨基还可以通过在偶联剂的存在下与适当取代的羧酸反应来酰化。合适的偶联剂包括二环己基碳化二亚胺(DCC)、N，N’-羰基二咪唑、双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BOP-Cl)、N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)、苯并三唑-1-基氧-三吡咯烷六氟磷酸鏻(PyBOP)以及类似物质。
或者，氨基还可以用羧酸的活性酯来酰化，诸如对酰基苯基、2，4，5-三氯苯基、羟基苯并三唑水合物(HOBTH2O)、五氟苯酚和N-羟基琥珀酰亚胺羧酸酯。优选的酰化基是2，4，5-三氯苯基和HOBT羧酸酯。该反应一般在约0℃至30℃的温度下在质子惰性溶剂中进行1-65小时。当该反应在约15℃至30℃的温度下进行时通常在约24至48小时后完成。合适的溶剂包括四氢呋喃和二甲基甲酰胺或其混合物。氨基通常以相对活性酯等摩尔比例存在或者有稍微过量的氨基。
R-COOH前体酸通过水解式R-CN的腈或式R-COO(C1-C4烷基)的酯来制备。腈和酯中间体可以使用本领域中的已知方法制备。例如，其中R为烷氧基芳基部分的腈和酯中间体可以使用下述方法A或方法B制备。
方法A
将1当量的烷基溴、烷基碘或对甲苯磺酸酯加入到存在于200-300ml乙腈(CH3CN)中的含有1当量碱诸如叔丁醇钾或碳酸钾(K2CO3)和1当量羟基芳基化合物的混合物中。该反应混合物回流6小时，然后真空浓缩得到残余物，将其溶于Et2O/2N NaOH混合物。将所产生的各层分离，有机层用硫酸镁(MgSO4)干燥，过滤并干燥得到烷氧基芳基产物。
方法B
将二乙基偶氮二羧酸酯(1当量)滴加到存在于200-300ml THF中的含有羟基芳基化合物(1当量)、烷基醇(1当量)和三苯基膦(1当量)的混合物中。17小时后，真空除去溶剂得到残余物，将其溶于Et2O。所得混合物用2N NaOH溶液洗涤、用MgSO4干燥、过滤并浓缩得到产物，然后将其从Et2O/戊烷混合物中结晶，或者如果该产物含有叔胺的话，形成盐酸盐并从甲醇(MeOH)/EtOAc混合物中结晶。其中R为炔基芳基的腈和酯中间体可以使用下述方法C制备。
方法C
将含有Et2O(2当量)、二氯化钯(0.05当量)、三苯基膦(0.1当量)、碘化亚铜(0.025当量)和炔烃(1当量)的混合物在氮气(N2)下加入到1当量的存在于CH3CN中的芳基溴化物、碘化物或三氟甲磺酸酯中(600ml/0.1mol芳基反应物)。将所得混合物回流17小时，然后真空除去溶剂得到残余物，其在300ml Et2O中混合成浆状后过滤。滤液用1N HCl溶液洗涤、用MgSO4干燥、过滤并干燥后得到产物。
其中R为三联苯部分的酯中间体可以使用下述方法D制备。
方法D
1.形成硼酸(boronic acid)反应物
将丁基锂(1.2当量)加入到1当量的存在于THF中的冷(-78℃)芳基卤中。15分钟后，加入三异丙基硼酸酯(2当量)。10分钟后，将该反应混合物加热至室温并通过加入水(H2O)使反应终止，接着加入1N HCl。将所产生的各层分离，有机层真空浓缩得到固体，其通过过滤收集并用己烷洗涤。
2.形成三联苯基酯
将四(三苯基膦)钯(0.03当量)加入到存在于N2-净化甲苯中的含有芳基二羟基甲硼烷(1当量)、K2CO3(1.5当量)和4-碘代苯甲酸甲酯(1当量)(或碘代苯甲酸的三氯苯基酯)的混合物中。将该反应混合物回流7小时，然后倾析除去K2CO3并真空干燥得到残余物。该残余物在CH3CN中研磨并过滤得到产物。上述芳基腈和酯可以使用下述方法E或方法F通过水解转化为相应的羧酸。
方法E
将芳基腈溶于乙醇(EtOH)和过量的50％NaOH溶液并回流2小时。将水加入该反应混合物中直到固体沉淀出来。该固体通过过滤收集，加入到二噁烷/6N HCl混合物中，并将所得混合物回流17小时。当该反应基本上完成后，羧酸产物通过加入H2O而结晶，然后通过过滤收集并真空干燥。
方法F
将过量的2N NaOH加入存在于MeOH中的芳基酯中，所得溶液回流5小时，然后通过加入过量HCl酸化。将水加入该反应混合物中直到固体(羧酸)沉淀。该羧酸通过过滤收集并真空干燥。
羧酸可以使用下面的方法G转化为相应的2，4，5-三氯苯基酯。该活性酯然后用于酰化氨基核。
方法G
将存在于CH2Cl2中的含有芳基羧酸(1当量)、2，4，5-三氯苯酚(1当量)和DCC(1当量)的混合物搅拌17小时，然后过滤。滤液浓缩得到残余物，将其溶于Et2O、过滤、然后加入戊烷直到结晶开始。该结晶通过过滤收集并真空干燥。
或者，羧酸可以通过使用下述方法H转化为相应的羟基苯并三唑酯而活化。
方法H
芳基羧酸(1当量)和稍微过量的N-甲磺酸酯取代的羟基苯并三唑(1.2当量)在N2下在稍微过量的碱诸如三乙胺(Et3N)(1.3当量)的存在下在DMF中发生反应。当反应完全时，混合物用甲苯稀释并用H2O洗涤。有机部分用H2O稀释，然后使用用于转移物质的叔丁基甲基醚(MTBE)过滤。所得固体用MTBE洗涤，然后真空干燥。
棘白菌素化合物可以是分离并使用其本身，或者可以是其药学上可接受的盐或水合物的形式。术语“药学上可接受的盐”是指从无机和有机酸衍生的无毒酸加成盐。合适的盐衍生物包括卤化物、硫氰酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、重亚硫酸盐、芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、膦酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦膦酸盐、链烷酸盐、环烷基链烷酸盐、芳基链烷酸盐、己二酸盐、藻酸盐、门冬氨酸盐、苯甲酸盐、延胡索酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、乳酸盐、马来酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、三氟乙酸盐，等等。
或者，棘白菌素化合物可以作为棘白菌素/糖类复合物分离。复合物使用标准结晶操作诸如一般是为了通过重结晶来纯化化合物而进行的那些操作来形成。将棘白菌素物质和糖类在抬高的温度(大约45-60℃，优选小于55℃)下溶于溶剂。该溶液然后缓慢地冷却直到结晶开始。可以加入晶种(诸如以前结晶的复合物或不溶性糖)来引发结晶。合适的糖类包括先前列出的可加入到药物喷雾溶液中的那些。优选的糖类包括L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、2-脱氧-D-核糖、(S)-(+)-赤藓酮糖、D-果糖、D-(+)-岩藻糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、β-D-葡萄糖、D-来苏糖、L-来苏糖、D-麦芽糖、麦芽三糖、松三糖、异麦芽酮糖、D-棉子糖、D-山梨糖醇、D-海藻糖、木糖醇、L-木糖及其水合物。合适的溶剂包括对于进行中反应来说是惰性的，足以使反应物溶解的任何一种溶剂或溶剂混合物，这些溶剂提供了一个完成所需的糖类和棘白菌素化合物间的复合作用的介质，诸如质子溶剂或酮溶剂包括甲醇、乙醇、苄醇，以及苄醇与诸如下列溶剂的混合物：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁醇、2-戊醇、2-甲基-1-丙醇、MEK、丙酮、乙酸乙酯、甲苯、乙腈、氟苯、二氯甲烷、硝基甲烷、或环酮诸如环戊酮和环己酮。优选的溶剂包括甲醇、乙醇、苄醇、以及苄醇与甲乙酮、乙酸乙酯和乙腈的混合物。对棘白菌素/糖类复合物和它们的制备的更详细的描述可以见Larew等于1999年3月3日提交的题为“棘白菌素/糖类复合物”的申请，该申请结合在此作为参考。
活性成分一般配制成药物剂型，以使药物的剂量容易控制并为病人提供雅致而又容易处理的产品。本文中所用的术语“单剂”或“单位剂量”指的是含有计算出可产生所需治疗作用的预定量活性成分的物理分散单元。当单剂口服给药时，一般将其制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末包装(扁囊剂)、糯米纸囊剂等形式。或者，单剂可以以能吸吮或吞咽的液体溶液的形式、或者以能吸入或喷雾的干燥或液体气溶胶的形式给药。
给药剂量可以根据病人的生理特点、病人症状的严重程度以及用于给药的方式等加以变化。对于给药病人的具体剂量通常通过主治医师的判断来确定。
棘白菌素和半合成棘白菌素化合物已表明能显示出抗真菌和抗寄生物活性，诸如抑制各种感染性真菌的生长，包括念珠菌(即：白色念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯氏念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌或葡萄牙念珠菌)；球拟酵母(即：光滑球拟酵母)；曲霉(即：烟曲霉)；组织胞浆菌(即：荚膜组织胞浆菌)；隐球菌(即：新型隐球菌)；芽生菌(即：皮炎芽生菌)；镰刀菌；毛癣菌，Pseudallescheriaboydii，粗球孢菌，申克氏孢子丝菌，等等。
这种类型的化合物还可抑制主要引起免疫抑制个体发生机会感染的某些生物体的生长，诸如抑制AIDS和其他无免疫应答病人体内卡氏肺囊虫(肺囊虫性肺炎(PCP)的病因生物)的生长。棘白菌素型化合物可抑制的其他原生动物包括疟原虫、利什曼原虫、锥虫、隐孢子虫、等孢子球虫、无孢子球虫(Cyclospora spp.)、毛滴虫、微孢子虫，等等。
所以，制成的制剂可以用于对抗全身性真菌感染或皮肤真菌感染。因此，本发明的制剂和方法可以用于制备用于此处描述的治疗应用的药物。例如，真菌活性(优选白色念珠菌或烟曲霉活性)或寄生物活性可以通过使利用本发明制备的药物制剂分别与真菌或寄生物接触而得以抑制。术语“接触”包括本发明化合物与寄生物或真菌结合或会合、或者表面碰触或相互接触。该术语不表明对过程的任何进一步限制，诸如利用抑制的机理。方法规定为包括通过化合物和它们的固有抗寄生物和抗真菌性能的作用来抑制寄生物和真菌的活性。
还提供了治疗真菌感染的方法，该方法包括对需要这种治疗的宿主给药有效量的利用本发明制备的药物制剂。优选的方法包括治疗白色念珠菌或烟曲霉感染。术语“有效量”是指能够抑制真菌活性的活性化合物的量。给药剂量将根据诸如象感染的性质和严重度、宿主的年龄和一般健康状况以及宿主对抗真菌剂的耐受性等因素进行变化。特定给药方案同样也可按照这些因素加以改变。药物可以每日单剂或一日多剂给药。给药可以持续约2-3天至约2-3周或更长时间。一般每日剂量(以单剂或多剂给药)含有从约0.01mg/kg至100mg/kg(体重)剂量水平的活性化合物。优选的每日剂量通常为约0.1mg/kg至60mg/kg，更优选为约2.5mg/kg至40mg/kg。
实施例
用于举例说明本发明制剂的棘白菌素化合物按照下列制备中所述加以制备。具体而言，以下顺序描述了具有下列结构的抗真菌化合物1(a)的制备：
本领域技术人员将理解，以下只是说明性的实施例，可用作抗真菌剂的其他半合成棘白菌素化合物可以使用类似方法或早先在说明书中提及的参考文献中描述的方法来合成。除非另有说明，否则在以下的制备中所用的材料从Aldrich化学公司(Milwaukee，Wisconsin)购得。
化合物的制备
制备4-溴-4’-戊氧基联苯1(a)：
将无水K2CO3(416g，3mol)加入4-溴-4’-羟基联苯(300g，1.2mol)、1-碘代戊烷(234ml，1.79mol)和2-丁酮(600ml)的混合物中。该反应混合物回流44小时，直到TLC(85∶15己烷/EtOAc)显示溴代醇已完全消耗。将该混合物冷却至约30℃，用CH2Cl2(600ml)稀释，然后过滤。滤液用H2O洗涤两次，用饱和NaCl水溶液洗涤两次，用无水Na2SO4干燥，过滤，然后减压干燥得到固体。该固体通过过滤分离，用总量为2L的冰冷的庚烷反复洗涤以除去所有碘代戊烷的痕迹，然后在高真空下干燥过夜。收率：340g(88％)白色粉末。
另一种方法制备4-溴-4’-戊氧基联苯1(a)：
将4-溴-4’-羟基联苯(12.5g，50.2mmol)加入NaOH(2.28g，97％纯度，55.2mmol)的去离子水溶液(150ml)中，接着加入1-碘代戊烷(11.9g，60.2mmol)和溴化四丁铵(0.82g，2.51mmol)。该混合物在90℃下搅拌3.75小时，直到固体溶解。然后，随着反应继续进行，所需产物开始沉淀出来。将该混合物缓慢冷却，然后过滤得到固体，其用去离子水洗涤，直到滤液的pH呈中性，然后在30℃下在真空烘箱中干燥16小时。收率：15.41g(96％)的5a。Rf0.5(97∶3己烷/EtOAc)。1H NMR.δ0.93(t，3H，J＝6.9Hz)；1.41(m，4H)；1.79(m，2H)；3.97(t，2H，J＝6.6Hz)；6.98(m，2H)；7.23(m，6H).13C NMR：δ14.03；22.43；28.22；28.98；68.12；114.91；120.71；127.93；128.27；131.77；132.24；139.82；159.03.MS(FAB+)：m/z 320.IR(CHCl3)：2960，2936，2874，1608，1518，1485，1475cm-1.对C17H19BrO的分析：计算值：C，63.96；H.6.00；Br，25.0；实测值：C，64.10；H.5.97；Br，25.28.
制备4-硼酸(boronic acid)-4’-戊氧基联苯2(a)：
在N2下，向化合物1(a)(100g，0.31mol)在叔丁基甲基醚(MTBE)(1L)中的冷(-20℃)混合物中缓慢滴加正丁基锂(150ml 2.5M己烷溶液，0.37mol)，同时保持内部温度在-19℃至-18℃之间。所得混合物在-17℃和-16℃之间搅拌3.5小时，产生淡黄绿色溶液。将该溶液冷却至-78℃并用100ml无水THF稀释，产生白色沉淀。然后，在氮气下在1.5小时内滴加三异丙基硼酸酯(145ml，0.62mol)在MTBE(200ml)中的冷(-78℃)溶液，同时保持反应温度在-78℃和-74℃之间。所得反应混合物在-78℃下搅拌1.5小时，然后使在1小时内升至-50℃，此时除去冷却浴，将该混合物搅拌过夜(16-21小时)，产生白色沉淀。该混合物用2M HCl(1000ml)用力振摇5分钟，然后将所产生的各层分离，有机层减压干燥得到残余物。该残余物用MTBE(100ml)稀释，接着用庚烷(800ml)稀释得到白色粉末，其通过吸滤分离并用庚烷(300ml)洗涤3次。
收率：88g(98％).Rf0.45(95∶5 CH2Cl2/MeOH).1H NMR：δ0.92(m，3H)；1.41(m，4H)；1.80(m，2H)；4.00(m，2H)；6.99(m，2H)；7.45-7.63(m，3H)；7.67(m，2H)；8.24(d，1H，J＝8.3Hz).13C NMR；14.01；22.26；28.03；28.77；39.61；39.89；40.17；40.45；67.82；114.77；125.32；127.83；132.93；134.84；141.88；158.71.MS(FD+)：m/z 284.IR(CHCl3)：2959，2952，2874，1606，1526，1500cm-1.制备化合物3(a)：
甲苯(174ml)和丙醇溶液(20ml)通过对溶液施加20-30秒真空后用N2清洗而脱气3次。2M Na2CO3溶液也进行脱气。将甲苯/丙醇溶液(97ml)加入4-碘代苯甲酸甲酯(14.12g，53.9mmol)和化合物2(a)(15.0g，52.8mmol)的混合物中，接着加入经过脱气的2M Na2CO3水溶液(29ml，58.0mmol)。所得混合物在正压N2下脱气2次，每次20-30秒，接着加入醋酸钯(II)(0.24g，1.1mmol)和三苯基膦(0.84g，3.2mmol)，然后再脱气两次。之后该反应混合物在N2下回流5小时，产生淡黄色混合物。将该混合物冷却至23℃使形成沉淀，其通过过滤收集，顺序用甲苯(123ml)、2∶1 MTBE/EtOAc(143ml)、去离子水(123ml)和2∶1 MTBE/EtOAc(42ml)洗涤，然后在35℃下在真空烘箱中干燥16小时。收率：18.7g(94％)。Rf0.48(苯)。1H NMR：δ0.93(t，3H，J＝6.80Hz)；1.42(m，4H)；1.81(m，2H)；3.95(s，3H)；4.00(t，2H，J＝6.48Hz)；6.97(d，2H，J＝8.52Hz)；7.55(d，2H，J＝8.52Hz)；7.66(m，6H)，8.10(d，2H，J＝8.20Hz).MS(FD+)：m/z 374.IR(KBr)：2938，1723cm-1.对C25H26O3的分析：
计算值：C，80.18；H.7.00；实测值：C，79.91；H.6.94.制备化合物4(a)：
化合物3(a)(80g，0.21mol)、5M KOH(160ml)和溴化十六烷基三甲铵(4.8g，0.013mol)在二甲苯(800ml)中的混合物回流3小时，然后冷却至10℃并过滤得到白色固体。该固体用H2O洗涤3次(每次500ml)以除去催化剂和大多数碱。所得物质用DME(500ml)处理。加入6M HCl(100ml)将该溶液的pH调节至pH。所得混合物回流30分钟，同时定期检查pH以确保其维持酸性，然后冷却并过滤。所得固体依次用MTBE(400ml)和水(4×400ml)洗涤，直到洗涤物用石蕊检验为中性。收率：76g(98％收率)。
1H NMR δ0.89(t，3H，J＝6.82Hz)，1.38(m，4H)，1.73(m，2H)，3.96(t，2H，J＝6.3Hz)，6.95(d，2H，J＝8.56Hz)，7.57(d，2H，J＝8.54Hz)，7.64-7.74(m，6H)，8.00(d，2H，J＝8.21Hz)，8.09(s，1H).MS(FD+)m/z 360.IR(KBr)：2958，2937，2872，1688cm-1.对C24H24O3的分析：计算值：C，79.97；H.6.71；实测值：C，80.50；H.6.77.
制备化合物4(a)的HOBT酯：
A.形成HOBT甲磺酸酯
向羟基苯并三唑水合物(200g，1.48mol)在无水CH2Cl2(1.5L)中的冷(0℃)混合物中缓慢加入无水Et3N(268ml，1.92mol)，同时保持温度在0-10℃，接着加入甲磺酰氯(126ml，1.63mol)，同时保持温度在0-5℃。所得混合物在0℃下搅拌3小时，并依次用冷水(2×1.2L)和盐水(1.2L)洗涤。将合并后的有机萃取液减压浓缩得到固体。该固体从CH2Cl2(100ml)和庚烷(1L)中重结晶。结晶通过吸滤收集并用总量为1L的庚烷反复洗涤，然后在高真空(0.5mmHg)下干燥过夜。收率：245g(78％)。Rf0.55(1∶1己烷/CH2Cl2)。1H NMR：δ3.58(s，3H)，7.46(t，1H，J＝7.60Hz)，7.60(d，1H，J＝8.28Hz)，7.65(d，1H，J＝8.56Hz)，7.68(d，1H，J＝8.20Hz)，8.05(d，1H，J＝8.41Hz).
B.形成HOBT酯
化合物4(a)(50g，0.14mol)和上述A部分中所述的物质(36g，0.17mol)在DMF(650ml)中的混合物在N2下滴加Et3N(25ml，0.18mol)进行处理。所得混合物在室温下搅拌4小时，直到根据TLC(95∶5CH2Cl2/MeOH)测定所有的酸都已消耗完。当所有的酸都消耗完时，一部分反应混合物(~3管药水)当用3ml 1∶1的CH2Cl2/THF稀释时产生澄清的均匀溶液。该反应混合物然后用甲苯(500ml)稀释，用水(500ml)洗涤。有机层(含有固体产物)用水(500ml)稀释并使用转移用的MTBE过滤。该固体用MTBE(2×400ml)冲洗并真空干燥得到白绿色片状粉末物质。注意：该物质可以溶于THF并过滤除去任何残余的金属污物。收率：61g(92％)。Rf0.68(1∶1 CH2Cl2/己烷)。1H NMR：δ0.93(t，3H，J＝7.0Hz)，1.42(m，4H)，，1.81(m，2H)，4.00(t，2H，J＝6.53Hz)，6.99(d，2H，J＝8.6Hz)，7.42-7.59(m，5H)，7.71(dd，4H，J＝13.91Hz，8.40Hz)，7.86(d，2H，J＝8.30Hz)，8.11(d，1H，J＝8.31Hz)，8.35(d，2H，J＝8.33Hz).13C NMR：δ14.03，22.44，28.18，28.94，40.10，40.37，68.11，108.45，110.11，114.95，118.71，120.48，123.04，124.94，124.99，127.00，127.23，127.51，127.73，128.06，128.82，128.86，131.35，132.30，137.15，141.43，143.54，147.85，159.15，162.73.MS(FD+)：m/z 477.IR(CHCl3)：2960，2936，2874，1783，1606cm-1.对C30H27N3O3的分析：计算值：C，75.45；H，5.70；N，8.80；实测值：C，75.69；H，5.58；N，8.92.
制备抗真菌化合物1(a)：
在整个过程中使用去离子水。化合物5(a)(11g，23mmol)和化合物6(a)的核(其中R为氢-HPLC检验纯度为92％，19.25g，22.2mmol)在无水DMF(275ml)中的混合物在N2下搅拌4小时(直到HPLC显示环肽原料已完全消耗)。该混合物通过硅藻土床过滤，滤液在35℃下减压浓缩得到可以搅动的糊状物。将该糊状物倒入MTBE(500ml)使细粉末沉淀，其通过真空过滤收集并干燥得到27g粗物质。该物质用乳钵和研棒碾碎成粉末，用甲苯(200ml)使其成浆状5分钟，吸滤(缓慢过滤)，用MTBE(100ml)冲洗，然后真空干燥得到黄色固体。收率：23g(HPLC显示纯度为95％，保留时间＝7.79分钟)。
或者，可以使用过量的环状核(1.1当量)进行转化。当根据HPLC显示，反应基本上完全时，将粗物质(10g粉末)分批加入到用力搅拌着的9∶1丙酮/水混合物(60ml)中。将硅藻土(2.5g，预先用9∶1丙酮/水混合物洗涤)加入到所得悬浮液中。搅拌2分钟后，该混合物通过硅藻土床(预先用9∶1丙酮/水洗涤)过滤，饼状物用9∶1丙酮/水(10ml)冲洗两次。将滤液倒入装有去离子水(200ml)的烧杯中，同时使该混合物轻微旋转导致沉淀形成。该沉淀通过吸滤收集，用H2O(4×25ml)冲洗，然后在室温下真空干燥。收率：6.81g(HPLC显示纯度为97％)。
该产物使用制备HPLC色谱法进一步纯化。Rf0.29(80∶20 CHCl3/MeOH).MS(FAB+)：C58H74N7O7的m/z，计算值：1140.5141；实测值：1140.5103.IR(KBr)：3365，2934，1632，1518cm-1.
制备与化合物1(a)的果糖复合物：
在夹套式反应锅中装入1当量化合物1(a)、8当量果糖和足够量的甲醇，以产生58mg/ml化合物1(a)。将该混合物加热至50-55℃直到溶解完全。将溶液冷却至45℃。在45℃下加入晶种后，经过播种的该溶液以-2度/小时的冷却速率冷却至25℃。该混合物经过2小时进一步冷却至0℃(冷却速率＝-12.5度/小时)，然后在0℃下搅拌12小时。产物通过真空过滤分离，用以重量/重量计含有1％果糖的冷甲醇洗涤，然后在30℃真空烘箱中干燥24小时。测定在装备有15cm×4.6mm、3.5微米粒径的ZorbaxTM SB-C18或XDB-C18分析柱的梯度HPLC系统上进行。
药物制剂
下列实施例阐述了利用本发明的方法制备的制剂。这些实施例不打算以任何方式限制本发明的范围并且不应作这样的解释。
化合物1(a)的用量通过计算出实验所需的理论效价(potency)并用该值除以化合物“原态(as-is)”HPLC效价来确定。
实施例1
实施例1阐述了使用流化床喷雾方法来原位形成棘白菌素/糖类复合物。
一边搅拌一边将523.70g果糖加入到760.0ml温热的纯净水中而制得溶液A。该溶液然后冷却至室温。
一边搅拌一边将2,850.0ml丙酮加入到冷却至20-25℃的950.0ml纯净水中而制得溶液B。边搅拌边将523.70g化合物1(a)缓慢加入到该丙酮/水溶液中。
边搅拌边将溶液A缓慢加入到溶液B中。然后将该澄清溶液喷雾到已加入到Glatt GPGG-3流化床颗粒装置(可从Glatt AirTechniques公司；Ramsey，NJ购得)的干燥器筒体中的颗粒状甘露糖醇2080(可从SPI Polyols，New Castle，DE购得)的流化床上。该装置的起始入口温度设定为30℃，然后在完成喷雾后升高至45℃，以除去过量溶剂。干燥后，摇动袋子并将内容物转移到塑料衬里的容器中。
该过程得到了3,332.7g(90.9％收率)具有精细纹理的自由流动的颗粒状物质。卡尔·费歇尔分析＝＜1％水分。堆密度：0.67g/ml，该物质轻敲300次后的振实密度(tap density)＝0.79g/ml。该喷雾颗粒的相对稳定性测定为对照(即大块化合物1(a))比测试物质(即喷雾颗粒)的主要降解产物的相对比例。降解产物利用高效液相色谱法(HPLC)测定，并记录为总相关物质百分数(％TRS)。喷雾颗粒在密闭的高密度聚乙烯不透明棕色瓶中在40℃下储存1周后，该喷雾颗粒显示出比大块化合物1(a)(7.80％TRS)更低的％TRS(6.50％TRS)，由此表明喷雾颗粒的热稳定性增强了。
在40℃下储存2周后，喷雾颗粒继续显示出比大块化合物1(a)更低的％TRS(喷雾颗粒为7.42％TRS，而化合物1(a)为8.79％TRS)。