肝癌组织特异性粘附肽、体内外结合筛选方法及其用途 技术领域
本发明涉及一种肿瘤导向治疗中的导向肽、该导向肽的筛选方法，以及该导向肽的应用，尤其是涉及一种能特异性结合肝癌组织/细胞的粘附肽、该粘附肽的筛选方法以及该粘附肽的应用，属于分子药理学技术领域。
技术背景
肝癌作为一种最常见的恶性肿瘤对人类健康造成了极大的威胁，据估计，全世界每年死于肝癌的患者达125万。目前用于肝癌治疗的方法主要有手术疗法、放射疗法和化学疗法等，但这些方法对人体的健康组织和器官都存在不同程度副作用。
导向治疗技术为肿瘤的治疗开辟了广阔的前景。肿瘤导向治疗是指应用针对肿瘤特异性或相关抗原的单克隆抗体与杀伤肿瘤细胞的活性物质如：化疗药物、毒素、放射性核素等相偶联，将活性物质选择性地运送到肿瘤部位，定向杀伤肿瘤细胞的方法。肿瘤导向治疗作为近年来兴起的第四种肿瘤疗法即生物治疗法中的重要组成部分而受到了人们很大地重视。
关于利用噬菌体肽库技术对肿瘤组织特异性粘附肽的筛选，1996年Pasqualinii和Ruoslahti首先在Nature上报道了该方法，并且利用该方法筛选出了特异结合脑和肾的噬菌体结合肽。1997年他们成功筛选到一条对恶性黑素瘤和乳腺癌组织上的αv整合素特异性亲和的包含RGD的短肽，其与肿瘤细胞结合的特异性较与脑和肾正常组织结合高20倍以上；到目前为止，人们已发现多条特异性亲和人肿瘤血管的短肽，如RGD_4C，CNGRC，GSL，SMSIARL，CPGPEGAGC等，前述的两条短肽已在动物身上进行了抗肿瘤活性测定，抗癌效果良好。
在导向治疗中非常关键的在于如何筛选得到具有很强特异性的导向肽，目前噬菌体肽库技术是一种比较有效的筛选方法。噬菌体肽库技术自20世纪90年代诞生以来给探索生物大分子间相互作用的结合位点、寻找高亲和力生物活性的配体分子以及给药物筛选、新型诊断试剂和疫苗等领域的研究带来了革命，其最大优点就是无需知道蛋白质的任何性质，就可筛选到特异性的结合肽，因而方法方便快速有效。目前用噬菌体肽库技术筛选导向肽分为体内筛选和体外筛选两种。体内筛选法尤其在筛选组织或肿瘤组织特异性结合肽时有其明显的优越性：其一，噬菌体肽库进入机体的血液系统，在血液循环过程中可以去除大量与靶组织无关的噬菌体肽，经过多次重复操作后可以得到所需的组织或肿瘤特异性结合肽，其原理是不同的组织都有其特异细胞膜标志，如淋巴细胞的归巢、肿瘤细胞定向转移等；其二，在体内筛选到的是自然状态下的组织或肿瘤特异性结合肽，这在诊断和导向治疗中更有使用价值；其三，用体内筛选法经常能筛选到与肿瘤新生血管特异性结合的多肽，而肿瘤新生血管壁上存在着正常血管所没有或很少有的粘附分子，这些分子与肿瘤抗原相比其异质性和调变要少得多，也无需克服肿瘤的生物屏障，因此作为导向治疗的“弹头”有更多的优越性。但体内筛选法明显的缺陷在于在筛选和鉴定方面都比体外筛选法来得麻烦和困难，因此大多数报道还是采用细胞的体外筛选法。但是体外筛选虽然筛选和鉴定都较体内筛选简单，其缺点也是很明显的，因为体外培养的细胞所处的环境与体内差异较大，因此无法准确判断筛选出的导向肽的特异性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能特异性结合肝癌组织/细胞粘附肽；本发明的另一目的在于提供该肝癌组织/细胞粘附肽的体内外结合筛选方法；本发明的目的还在于提供该肝癌组织/细胞粘附肽的用途。
本发明提供的肝癌组织/细胞粘附肽，其多肽序列为：
序列一：NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH
序列二：NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH
为得到上述肝癌组织/细胞粘附肽，本发明采取体内外结合的筛选方法，具体包括以下步骤：
第一步：将正常肝细胞株加入噬菌体肽库中，回收不与正常肝细胞结合的噬菌体肽，进行扩增；
第二步：将回收的不与正常肝细胞结合的噬菌体肽注射到荷瘤鼠体内，这些噬菌体经过血液循环后含有肝癌组织特异性肽的噬菌体会吸附到癌细胞或被癌细胞内吞，从肝癌组织回收噬菌体肽，感染大肠杆菌K91Kan感受态细胞，然后将该噬菌体扩增后纯化；
第三步：将第二步经过扩增和纯化的噬菌体注射到新的荷瘤鼠体内，重复第二步，从肝癌组织回收得到更多与肝癌组织结合特异性强、亲和力高的噬菌体多肽。
第四步：筛选得到的噬菌体单克隆化，用细胞ELISA方法对单克隆的噬菌体进行鉴定，以正常肝细胞作为阴性对照，选择结合系数大的克隆为与肿瘤细胞结合特异性好的阳性克隆。
在第四步中克隆的特异性结合系数是指噬菌体肽与肿瘤细胞结合得OD490值除以同样条件下与正常细胞结合的OD490的百分比。
本发明还可以在第三步结束后，再进行一到两次和第三步一样的体内筛选过程，以回收得到更多与肝癌组织结合特异性强、亲和力高的噬菌体多肽。
筛选结束后为进一步证明筛选得到的粘附肽的导向效果，可以用免疫荧光等方法来验证，证明筛选得到的阳性克隆的多肽能有效地导向肝癌组织。同时再将得到的阳性克隆的噬菌体纯化后回输到荷瘤裸鼠体内，用免疫组化的方法来测定其组织分布特异性，验证其导向效果。并对阳性克隆进行了序列分析，从而可以得到该多肽的序列。
本发明还提供序列一：NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH和序列二：NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH的肝癌组织/细胞特异性粘附肽在制备肝癌的导向药物中的应用。
本发明提供的肝癌组织/细胞粘附肽导向效果好，组织分布特异性强，是一个很好的肝癌导向治疗中的粘附肽，具有较广阔的应用前景。
本发明提供的体内外结合的肝癌组织特异性粘附肽的筛选方法比体内筛选方法和体外筛选方法都具有明显的优势：因为其中经过体内筛选的步骤，所以筛选出的粘附肽与体内环境更相吻合，从而克服了单纯体外筛选的缺点；另外由于在筛选的后期采用的是体外筛选的方法，所以克服了体内筛选时鉴定困难的缺点，鉴定起来比较简单。最后通过回输荷瘤鼠体内进一步鉴定粘附肽的结合特异性，弥补了体外筛选的缺陷，所以可以明显看出本发明克服了单纯体内和单纯体外筛选方法的缺陷，而同时兼有了两者的优点。
具体实施方式
在说明具体实施方式前，先对本发明要用到的材料和试剂以及试剂的配置进行简单的说明：
试验材料与试剂
(一)试剂
1.噬菌体随机15-肽文库(多样性为108)、K91Kan由美国密苏里大学G.P.Smith教授惠赠，因为G.P.Smith教授长期以来一直无偿提供这两种试剂，这在业内是众所诸知的，所以任何人都可以在需要的时候得到这两种试剂。
2.人肝脏细胞株L-02、人肝癌细胞株BEL-7402：购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库
3.兔抗噬菌体M13抗血清、辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体：购自瑞典Pharmacia公司。
4.辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-羊抗兔IgG)、异硫氰酸荧光黄(FITC)标记的山羊抗兔IgG、碘化丙锭(PI)、邻苯二胺(OPD)、二氨基联苯胺(DAB)等购自美国SIGMA公司
5.硝酸纤维薄膜(NC膜)(美国进口分装)
6.酵母提取物Yeast Extract、蛋白胨Bacto-Tyrptone购自英国OXOID公司
7.RPMI-1640干粉剂、新生小牛血清购自美国GIBCO公司
8.二甲基亚砜购自德国SERVA公司
9.胰蛋白酶由Difco进口分装
(二)试剂的配制
培养基：
1、噬菌体扩增培养基
(1)大肠杆菌K91Kan液体培养基(LB培养基)
蛋白胨(Bacto-Tyrptone)10g/L、酵母粉(Yeast Extract) 5g/LNaCl 10g/L、加入适量的dH2O充分溶解后，用1N的NaOH将pH值调到7.0-7.5之间，最后用dH2O定容至1L，分装后高压灭菌。
(2)LB固体培养基：上述分装好的液体培养基加入1.5％的琼脂糖后再进行高压灭菌即可
(3)高营养液体培养基(terrific broth，TB)
a、K-PBS(0.17M KH2PO4-0.72M K2HPO4)：KH2PO4(anhydrous) 2.31g；K2HPO4(anhydrous)12.54g；dH2O加至100ml，高压灭菌。
b、TB培养基：蛋白胨(Bacto-Tryptone)12g；酵母粉(Yeast Extract)24g；甘油(Glycerol)4ml；dH2O加至900ml，高压灭菌。
使用前a∶b以1∶9混匀
(4)选择培养基：将高压灭菌后的LB固体培养基加热完全溶解，待到冷却至50℃左右时加入所需的抗生素，小心摇动三角烧瓶充分混匀，注意掌握时间在培养基凝固之前浇制平板。保存条件：含有抗生素的LB固体培养基应保存在4℃，卡那霉素的有效期为7天，四环素的为5天
2、细胞培养基：1640培养基
(1)RPMI1640培养基：
a、基本培养基：800ml的三蒸水中加入RPMI-1640干粉剂溶解，加入2gNaHCO3，溶解后定容至1000ml。5％NaHCO3调节pH至7.0，0.22um过滤除菌，-20℃保存。
b、培养基：基本培养基90％；56℃灭活30min的新生小牛血清10％；双抗100IU/ml，用时配制，4℃备用。
(2)D-hank’s母液(10×)：NaCl 10g、KCl 0.4g、KH2PO4 0.06g、Na2HPO4 0.12g、ddH2O 100ml，配好后，用5％NaHCO3调pH至7.0左右，高压灭菌，4℃保存。(3)胰蛋白酶消化液：称250mg胰蛋白酶(1∶250，Difco进口分装)粉末于烧杯中，先用加入D-Hanks液至100ml，搅拌均匀，置室温4hr或4℃过夜，经常振摇使其完全溶解；用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，分装每只1ml，-20℃保存，临用前解冻。
(4)双抗：高温高压灭菌D-Hanks液，用5ml无菌D-Hanks溶解80万单位的青霉素钠，吸取5ml；另用5ml无菌D-Hanks溶解100万单位的硫酸链霉素，吸取4ml，补充无菌D-Hanks至80ml，-20℃保存。
(5)细胞冻存液：基本培养基70％、小牛血清20％、二甲基亚砜(DMSO)10％；抗生素的配制：
1、卡那霉素储备液的配制：卡那霉素(kanamycin)1000×：用ddH2O溶解100mg/ml，-20℃保存
2、四环素储备液的配制：四环素(tetracycline)1000×：用50％甘油溶解40mg/ml，-20℃避光保存
PEG-NaCl：PEG8000，100g；NaCl，116.9g；dH2O，475ml；于1L的烧杯中搅拌溶解(可以加热至65℃)，高压灭菌，终体积应为600ml，4℃避光保存洗板液
1、pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)10×：NaCl 80g、KH2PO4 2g、Na2HPO4·12H2O29g、KCL 2g，dH2O定容至1000ml
2、洗板液a：pH7.4 PBS 0.05％，Tween 20(PBST05)；
Tween 20 0.5ml
1×PBS加至 1000ml
3、洗板液b：pH7.4 PBS 0.5％，Tween 20(PBST05)
Tween 20 5ml
1×PBS加至 1000ml
封阻液：PBST05-3％BSA，同时也是酶标抗体的稀释液
TBS：1M Tris-HCl pH7.5，5ml；NaCl，0.9g；dH2O加至100ml，高压灭菌OPD(邻苯二胺)底物显色液：
1、OPD底物缓冲液(PCS)：柠檬酸4.66g、Na2HPO4·12H2O，18.4g；dH2O加至1000ml，于4℃保存
2、OPD底物显色液：PCS9ml、30％过氧化氢10ul、OPD4mg
酶终止液：2M H2SO4
DAB底物显色液：10mM Tris-HCl pH7.5，9ml；30％过氧化氢10ul；DAB6mg；30％NiCl，100ul
筛选前期的准备工作：
1.肝癌细胞及正常肝细胞的体外培养
肝癌细胞BEL-7402；正常肝细胞L-02均购于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的细胞库。细胞在含1％双抗、10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基中，以37℃，5％CO2传代培养。传代时采用0.25％胰蛋白酶消化，于-70℃冰箱中冷冻保存。
2.荷瘤裸鼠动物模型的建立及饲养
与中科院实验动物中心合作完成肝癌细胞株BEL-7402荷瘤裸鼠动物模型的建立。方法是采用2周龄裸鼠，腋下注射200μl约106个肿瘤细胞BEL-7402。4-6周后选用肿瘤直径达到1cm左右的荷瘤裸鼠进行体内筛选或体内鉴定。
本发明的噬菌体的扩增及效价测定采用如下方法
在含有卡那霉素(100μg/ml)的LB中过夜培养(37℃ 270rpm)大肠杆菌K91Kan，次日1：10转入10ml TB培养基中继续震荡培养2小时45分钟37℃震荡(100rpm)培养10--15分钟，即为感受态细胞。
将待扩增噬菌体加入到感受态细胞中，37℃震荡(100rpm)培养15分钟，将培养物转入100ml LB-0.02Tet(0.02％四环素)中37℃震荡(270rpm)培养30分钟，加入100ul四环素(20mg/ml)继续培养24小时。
培养物于4℃8000rpm离心15分钟，取上清夜加入15％PEG-NaCl充分混合并置于4℃下沉淀过夜；沉淀过夜后溶液于4℃ 10000rpm离心20min，弃上清，加入TBS 1ml充分溶解，4℃ 10000rpm离心10min除去剩余的菌体，将上清夜转入到另一干净的小离心管中，加入200μl PEG-NaCl后充分混合，4℃沉淀1小时，4℃ 10000rpm离心后200μl TBS溶液溶解，60℃水浴中恒温20min。加入0.7％二甲基亚砜与0.02％叠氮化钠-70℃保存。
噬菌体效价测定
取大肠杆菌K91Kan感受态细胞10ul于15-ml指管中并与10ul一定稀释度(10-x)的噬菌体溶液混合，室温保持10分钟；加入1ml LB-0.02Tet液体培养基，37℃震荡(270rpm)培养30分钟；取100ul培养液涂平板(Kan100-Tet40 LB固体培养基平板)，37℃培养过夜；对培养皿中的菌落进行记数(y)，效价＝y×10x×103TU/ml，(其中10x代表稀释度。y代表平板上蓝斑数目)
下面结合实施例详细说明具体的筛选步骤：
1、噬菌体体外反向吸收
正常肝细胞与噬菌体15肽库共同37℃孵育1小时，离心，取上清，扩增、纯化噬菌体，用于下一步荷瘤裸鼠体内筛选。
2、噬菌体随机肽库的活体筛选
挑选肿瘤直径1cm见方的荷瘤裸鼠用乙醚麻醉后，将1010的噬菌体肽库静脉注射入荷瘤裸鼠体内，这些噬菌体经过血液循环后，含肝癌细胞特异性肽的噬菌体将会吸附与肝癌细胞上或被癌细胞内吞，5分钟后先用10ml的DMEM、后用100ml生理盐水对小鼠进行心脏灌流，尽量洗去血液，以便以后组织切片的观察，减少背景。取出小鼠的主要器官和一部分肿瘤组织，浸入3％的甲醛中，以备组织切片用。剩下的肿瘤组织用PBS洗三次，研磨后，感染大肠杆菌，37℃230rpm振荡1小时，取100ul测效价。其余的继续摇24小时。
3、扩增纯化后噬菌体进入第二轮筛选，重复步骤2。
4、噬菌体的单克隆化
将第三次筛选得到的噬菌体感染大肠杆菌K91Kan所形成的单菌落投入已放有1ml LB-Kan100-Tet40液体培养基的15ml-指管中，37℃震荡(×270rpm)培养24小时；离心除去菌体，取上清液，测效价后保存并测序。
5、用细胞ELISA方法对得到的单克隆化的噬菌体进行鉴定筛选
把体外培养的BEL-7402人肝癌细胞和L-02人正常肝细胞分别消化下来，记数后制成相同浓度的细胞悬液。分别加入96孔细胞培养板，使培养板上下各两个孔分别对应相同浓度的肝癌细胞和正常肝细胞。
(1)细胞板每孔加100ul细胞悬浊液，37℃细胞培养箱中过夜，使细胞贴壁。
(2)固定：每孔加入100ul 3％多聚甲醛固定，1hr后用PBST-05、PBST-5分别洗板3次，
(3)封阻：每孔加封阻液(PBST05-3％BSA)100ul，37℃封阻1hr，同上洗板
(4)每孔加噬菌体单克隆100ul，并留一孔不加噬菌体作空白对照。在37℃温育1hr，同上洗板
(5)每孔加噬菌体M13抗血清100ul，37℃度温育2hr，洗板
(6)每孔加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG100ul，37℃温育1hr。洗板
(7)每孔加OPD底物显色液，振荡显色
(8)每孔加酶终止液(2M H2SO4)，
(9)终止显色
(10)细胞板离心，将每孔中的上清显色液以在细胞板上同样位置转移到酶标板中，酶标仪490nm波长读数。
按下列公式计算每个克隆的特异结合系数：
每个孔的OD值读数均为为某噬菌体单克隆在肝癌细胞孔中或在正常肝细胞孔中的读数的均值
6、免疫组织化学鉴定：
(1)取出浸在3％多聚甲醛中的样品，自然干燥后，切片，然后将切片贴到玻片上，晾干，丙酮固定5min，PBST洗3次，每次3min。
(2)1％过氧化氢甲醇混合液室温浸泡30min，PBST洗3次，每次5min。
(3)5％脱脂奶粉室温封阻20min，加入按1∶1000稀释的噬菌体M13抗血清，37℃湿盒中温育1hr，PBST洗3次，每次5min。
(4)加入1∶300稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃湿盒中温育1hr，PBST洗3次，每次5min，
(5)DAB进行显色反应(约12min)，用流水终止反应
(6)苏木青复染核约3min，自来水冲洗，加饱和碳酸锂分色，用酒精逐级脱水，二甲苯3min透明，最后用中性树脂封片观察。
7、荧光免疫细胞鉴定：
(1)把体外培养的BEL-7402人肝癌细胞和L-02人正常肝细胞分别用胰酶消化，把两种细胞制成相同浓度的悬液，分装于小离心管
(2)每管加1ml 3％多聚甲醛固定30min，用PBST洗3次
(3)每管加1ml PBST05-3％BSA，37℃封阻1hr，加入PBST洗3次
(4)加入噬菌体，37℃温育1hr。用PBST洗3次
(5)加噬菌体M13抗血清37℃温育2hr。用PBST洗3次
(6)每孔加FITC标记的羊抗兔IgG和PI，振荡，冰育15min。
(7)取一滴缓冲甘油溶液滴片，荧光显微镜镜检，拍照。
8、体内鉴定
取噬菌体肽扩增测得效价为1.26×1011。通过荷瘤裸鼠的尾静脉注射回输到裸鼠体内，经5分钟的体内循环后，对裸鼠进行心脏灌流，随后取其心、脑、肝及肝癌组织进行组织冰冻切片，行免疫组织化学观察。
通过两轮的体内筛选得到目标噬菌体。将目标噬菌体单克隆化后随机挑取144个单克隆进行扩增、纯化，并调整每个噬菌体克隆为相同的浓度(1010左右)。对每个单克隆化的噬菌体肽分别进行细胞ELISA的免疫荧光鉴定、体内鉴定，挑选结合特异性好的噬菌体进行测序，测序前将噬菌体单克隆化扩增，离心取上清液500μl，加入200μl PEG/NaCL，反复颠倒至混匀，室温静置10分钟，10000rpm离心去上清，然后低速离心，去除剩余上清。加100μl Iodide缓冲液将沉淀溶解，再加250μl无水乙醇室温孵育10分钟，这样可以使单链的噬菌体DNA沉淀而溶解噬菌体蛋白，10000rpm离心去上清，用70％乙醇清洗沉淀，真空干燥，加30μl TE缓冲液溶解沉淀。样品送华大基因上海鼎安生物科技有限公司测序，结果经GENG RUNNER、CLONE MANNAGER等软件翻译、分析。对它们DNA测序发现两种多肽序列：
序列一：NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH
序列二：NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH