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1、10申请公布号CN104162165A43申请公布日20141126CN104162165A21申请号201410338871422申请日20140716201310449770X20130927CNA61K47/42200601A61K49/00200601A61P35/0020060171申请人深圳先进技术研究院地址518055广东省深圳市南山区西丽大学城学苑大道1068号72发明人蔡林涛胡德红盛宗海74专利代理机构广州三环专利代理有限公司44202代理人郝传鑫熊永强54发明名称一种包含淋巴示踪剂的多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用57摘要本发明提供一种包含淋巴示踪剂的多聚体白蛋白纳米球。
2、及其制备方法和应用，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物为造影剂；所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为101000NM。该多聚体白蛋白纳米球是一种安全、稳定的生物相容性纳米载体，可以包载药物或者造影剂等目标投递物，且其储存稳定性高，有利于长时间有效、稳定地释放目标投递物；此外，该多聚体白蛋白纳米球的粒径小，且尺寸均一，分散性好；本发明还提供了该多聚体白蛋白纳米球的制备方法及应用。66本国优先权数据51INTCL权利要求书2页说明书21页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专。
3、利申请权利要求书2页说明书21页附图4页10申请公布号CN104162165ACN104162165A1/2页21一种多聚体白蛋白纳米球，其特征在于，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物为造影剂；所述造影剂包括2,7双1,3二氢1,1二甲基34磺丁基1,3,5庚三烯单钠盐和淋巴示踪剂；所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为101000NM。2如权利要求1所述的一种多聚体白蛋白纳米球，其特征在于，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和。
4、血红蛋白中的至少一种。3如权利要求1所述的一种多聚体白蛋白纳米球，其特征在于，所述淋巴示踪剂为3,7双二甲氨基吩噻嗪5翁氯化物、6,63,3二甲基1,1二苯基4,4二基双偶氮基双4氨基5羟基1,3萘二磺酸四钠盐、24二乙氨基苯4二乙氨基环己烷2,5二烯甲烷苯基1,4二磺酸盐、4,4双二乙氨基三苯脱水甲醇2,4二磺酸单钠中的至少一种。4一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1制备体积质量浓度为001300MG/ML的含巯基和/或二硫键的白蛋白水溶液，并调节所述白蛋白水溶液的PH值为712；其中，所述白蛋白水溶液为含有目标投递物的白蛋白混合液；所述目标投递物为造影剂；所述造影剂。
5、包括2,7双1,3二氢1,1二甲基34磺丁基1,3,5庚三烯单钠盐和淋巴示踪剂；2向步骤1所得的所述PH值为712的白蛋白混合液中加入带巯基的还原剂得反应液，然后在060下轻轻摇动反应00512小时，在所述反应液中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的105000倍；3将步骤2反应后的溶液在060的条件下进行超声，所述超声的功率范围为1100KW，同时在搅拌的条件下在所述进行超声的溶液中以0011000ML/S的速度加入有机溶剂得到微乳溶液，所述微乳溶液在060的条件下反应5240MIN后，静置分层，然后去除有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液，其中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤。
6、2反应后的溶液的1100倍；4将步骤3所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在060以及PH值为712的条件下进行透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；5将步骤4所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，其中，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；所述目标投递物为造影剂；所述造影剂包括2,7双1,3二氢1,1二甲基34磺丁基1,3,5庚三烯单钠盐和淋巴示踪剂；权利要求书CN104162165A2/2页3所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为101000NM。5如权利要求4所述的一种多。
7、聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。6如权利要求4所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述目标投递物的质量为所述白蛋白质量的0000205倍。7如权利要求4所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述淋巴示踪剂为3,7双二甲氨基吩噻嗪5翁氯化物、6,63,3二甲基1,1二苯基4,4二基双偶氮基双4氨基5羟基1,3萘二磺酸四钠盐、24二乙氨基苯4二乙氨基环己烷2,5二烯甲烷苯基1,4二磺酸盐、4,4双二乙氨基三苯脱水甲醇2。
8、,4二磺酸单钠中的至少一种。8如权利要求4所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述带巯基的还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇。9如权利要求4所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一种。10如权利要求4所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，所述步骤5中，所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理的方式为冷冻干燥、喷雾干燥或减压蒸馏。11如权利要求1所述的多聚体白蛋白纳米球或如权利要求4所述的一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法在制备预防、治疗或诊断癌症的药物中的应用，。
9、所述预防、治疗或诊断癌症的药物为多模成像用的纳米探针。权利要求书CN104162165A1/21页4一种包含淋巴示踪剂的多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用0001本申请要求于2013年9月27日提交中国专利局的申请号为201310449770X，其发明名称为“一种多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用”的中国专利申请的优先权，其部分内容通过引用结合在本申请中。技术领域0002本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用。背景技术0003纳米技术的兴起使得基于高分子纳米微粒的药物输送得到了广泛的关注，白蛋白具有可生物降解、无毒、无抗原性等诸多特点，被认为是一个理想。
10、的药物载体。而通常单个白蛋白质分子的尺寸在几个纳米以内，不适合直接用于载药，超声乳化法和去溶剂法可制得粒径小于1M的白蛋白纳米球，可用于运载药物，但由于白蛋白分子的水溶性高，该类方法制得的白蛋白纳米球载体的释药性能不易于控制，如何使白蛋白纳米颗粒在水中有良好的稳定性，且在稀释条件下不溶解是目前制备技术上的难点。0004戊二醛等交联剂常被用来稳定得到的纳米球，但戊二醛会非选择性的结合白蛋白表面的氨基位点，在生物体内会释放出醛类残基，对生物体有着显著毒副作用。因此，有必要提供一种制备安全、稳定性高的白蛋白纳米球的方法。0005另一方面，高特异性、高敏感性的肿瘤成像技术和成像探针对癌症诊断具有重要意。
11、义。近年来，近红外荧光成像得到发展，目前，吲哚青绿作为近红外荧光显影剂，已经在肿瘤、胃癌和结肠癌的临床治疗中得到应用。但是近红外荧光成像得到的是平面二维图像。图像不具有深度，无法得到深度信息，由于动物脏器堆积在一起，无法确切判定荧光信号的来源。0006光声层析成像是近年来发展起来的一种无损3D成像方法，它结合了纯光学成像的高对比度和纯超声成像的高穿透深度特性，可以提供高分辨率和高对比度的组织成像。0007荧光和光声成像虽然具有很好的效果，但是难以实现直接观察肿瘤的要求，给手术操作带来极大的不便。肿癌裸眼可视影像技术，对于实现外科医生在正常光线下，不需要借助额外的仪器，肉眼区分肿瘤组织与正常组织。
12、，手术中准确切除肿瘤，具有十分重要的意义。因此，单一的成像方式都不足以充分地获取肿瘤的信息，联合使用多种分子成像技术可实现彼此优势互补，能够为明确诊断提供更加精确而全面的信息。0008目前，国际上已经出现了各种商品化的多模态分子影像设备，然而相应分子影像探针的发展却远远落后于影像设备的发展。目前还未有多模成像用的多聚体白蛋白纳米球的报道。0009因此，有必要提供一种多模成像用的多聚体白蛋白纳米球以及制备方法。说明书CN104162165A2/21页5发明内容0010为解决上述问题，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球，该多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫。
13、键相互连接，在稀释条件下有较高的稳定性；此外，该多聚体白蛋白纳米球的粒径为101000NM，且其尺寸均一，分散性好，是运载药物或造影剂等目标投递物的良好载体，有利于在患者体内长时间有效、安全、稳定地释放投递物；本发明还提供了一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法和应用。0011第一方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为101000NM。0012优选地，所述含巯基或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。0013优选地。
14、，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为101000NM。0014优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为20100NM。0015优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为100200NM。0016优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为200500NM。0017优选地，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为6001000NM。0018优选地，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物。0019如本文所述的，所述多聚体白蛋白纳米球中包载目标投递物指纳米球中的白蛋白作为载体，包载所述目标投递物。0020如本文所述的，所述多聚体白蛋白纳米球中包载目标投递物优选为纳米球中的白蛋白形成蛋白外壳包裹所述目标投递物。0021如本文。
15、所述的，所述多聚体白蛋白纳米球中包载目标投递物的方式优选为0022纳米球中的白蛋白形成蛋白外壳，所述目标投递物被所述蛋白外壳包裹，或0023所述目标投递物与纳米球中的白蛋白相互镶嵌。0024进一步优选地，所述目标投递物为抗癌药物和造影剂中的至少一种。0025进一步优选地，所述抗癌药物为铂及铂的配合物、5,20环氧1,2,4,7,10,13六羟基紫杉烷11烯9酮4,10二乙酸酯2苯甲酸酯132R,3SN苯甲酰3苯基异丝氨酸酯紫杉醇、7S9S9羟乙酰基4甲氧基7,8,9,10四氢6,7,9,11四羟基702,3,6,三去氧3氯基A1来苏已吡喃基5,12萘二酮阿霉素、E,E1,7双4羟基3甲氧基苯基。
16、1,6庚二烯3,5二酮姜黄素、1,3,5,8四甲基2,4二A羟乙基卟酚6,7二丙酸血卟啉、4乙基4，12二氧4羟1H吡喃3，4，6，7吡吲哚1，26喹啉3，14二酮喜树碱、2S反式18羧基20羧甲基13乙基2,3二氢3,7,12,17四甲基8乙烯基21H,23H卟吩2丙酸二氢卟吩E6、IR700碘化物和11氯1,1二正丙基3,3,3,3四甲基10,12三亚甲基吲哚三碳花青碘盐IR780中的至少一种。0026进一步优选地，所述造影剂为2,7双1,3二氢1,1二甲基34磺丁基1,3,5庚三烯单钠盐吲哚青绿、对2,4二氨基喋啶6N甲基甲氨基苯甲酰谷氨酸甲氨蝶呤、3,7双二甲氨基吩噻嗪5翁氯化物美蓝、。
17、6,63,3二说明书CN104162165A3/21页6甲基1,1二苯基4,4二基双偶氮基双4氨基5羟基1,3萘二磺酸四钠盐伊文思蓝、24二乙氨基苯4二乙氨基环己烷2,5二烯甲烷苯基1,4二磺酸盐异硫蓝、4,4双二乙氨基三苯脱水甲醇2,4二磺酸单钠专利蓝和金属纳米粒子中的至少一种。0027由于白蛋白单体分子易溶性，物理方法团聚的白蛋白纳米球容易解体，纳米球中包载的药物很容易被过早地释放，不利于药物等目标投递物在人体循环系统内的运输，即物理方法团聚的白蛋白纳米球载体的释药性能的可控性不高，而本发明提供的多聚体白蛋白纳米球由多个白蛋白单体分子通过分子间的二硫键相互连接，这种化学键稳定的多聚体结构比。
18、通过物理方法聚集的蛋白纳米球更稳定，不易被人体体液稀释、溶解而解体，有助于保证靶向部位足够的给药浓度。0028在生物医学应用中，纳米粒子药物的粒径比较重要，不同的粒径代谢路径也不一样，小粒径通过肾代谢，大粒径通过肝代谢；其中，20200NM的粒子对肿瘤有被动靶向作用，在此粒径范围内的纳米粒子药物可以降低药物本身的毒副作用，同时也增加了疗效。0029此外，纳米粒子药物的分散性是比较重要的，分散性不好，粒子容易团聚，甚至沉淀，导致应用较为困难，特别是其生物医学应用，分散性尤其重要。0030本发明提供的多聚体白蛋白纳米球粒径小且尺寸均一，分散性好，用该纳米球包载投递药物在生物医学应用有较大优势，有利。
19、于纳米球通过EPR效应进入肿瘤内部并通过GP60通路靶向到肿瘤细胞。0031另外，一般自由蛋白质分子的分子量大都小于60KDA，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球由多个蛋白质单体分子聚集而成，分子量高于60KDA，不易被肾小球滤过由于肾小球的滤过作用下，一般分子量小于60KDA的蛋白质分子会在代谢的过程中被清除掉，而不能达到靶向位置，能提高药物等目标投递物的投递效率。0032第二方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤00331制备体积质量浓度为001300MG/ML的含巯基和/或二硫键的白蛋白水溶液，并调节所述白蛋白水溶液的PH值为712；00342向步骤1所得的所述PH。
20、值为712的白蛋白水溶液中加入带巯基的还原剂得反应液，然后在060下轻轻摇动反应00512小时，在所述反应液中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的105000倍；00353将步骤2反应后的溶液在060的条件下进行超声，所述超声的功率范围为1100KW，同时在搅拌的条件下在所述进行超声的溶液中以0011000ML/S的速度加入有机溶剂得到微乳溶液，所述微乳溶液在060的条件下反应5240MIN后，静置分层，然后去除有机相，得到含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液，其中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤2反应后的溶液的1100倍；00364将步骤3所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在060以及PH。
21、值为712的条件下进行透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；00375将步骤4所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为101000NM。0038优选地，所述步骤1中，所述含巯基或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛说明书CN104162165A4/21页7血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。0039优选地，所述步骤1中，所述白蛋白水溶液中含有第一有机溶剂。0040进一步优选地，所述第一有机溶剂为二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙。
22、醇和叔丁醇中的至少一种。0041更进一步优选地，所述第一有机溶剂在所述白蛋白水溶液中的体积分数为020。0042更进一步优选地，所述第一有机溶剂在所述白蛋白水溶液中的体积分数为00120。0043本发明采用的二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙醇或叔丁醇能提高药物或造影剂在溶液中的溶解度，使药物或造影剂充分溶解均匀。0044优选地，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法，将白蛋白水溶液和目标投递物先充分混合，使得白蛋白在包载目标投递物之间就与目标投递物充分接触，能提高白蛋白包载目标投递物的效率。0045优选地，所述步骤1中，所述白蛋白水溶液中含有目标投递物，所述目标投递物的质量为所述白蛋白质量的000。
23、0205倍。0046进一步优选地，所述目标投递物为抗癌药物和造影剂中的至少一种。0047进一步优选地，所述抗癌药物为铂及铂的类似物、紫杉醇、阿霉素、姜黄素、血卟啉、喜树碱、二氢卟吩E6、IR700碘化物和IR780中的至少一种。0048进一步优选地，所述造影剂为吲哚青绿、甲氨蝶呤、美蓝、伊文思蓝、异硫蓝、专利蓝和金属纳米粒子中的至少一种。0049本发明采用的第一有机溶剂不仅能提高目标投递物如药物或造影剂在溶液中的溶解度，使目标投递物与蛋白质充分溶解并混合均匀，且目标投递物与白蛋白分子可以充分接触，为下一步超声过程中白蛋白包载目标投递物做准备。0050优选地，所述步骤2中，所述带巯基的还原剂为谷。
24、胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇。0051优选地，所述步骤3中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇或叔丁醇中的至少一种。0052优选地，所述步骤3中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤2反应后的溶液的2100倍。0053进一步优选地，所述有机溶剂中还含有二甲基亚砜、三氯甲烷、二氯甲烷或正己烷中的至少一种。0054优选地，所述步骤4中，所述进行透析的方法为先将步骤3所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液置于PH值为712的PBS缓冲液中透析10300小时，然后在双蒸水内透析12小时，得到含多聚体白蛋白纳米球的溶液。0055本发明采用PH值为712的PBS缓冲液进行透析，一方面可以去除多聚体白蛋白纳米。
25、球的悬浊液中的无机小分子等杂质，另一方面，在碱性条件下，某些存在于多聚体白蛋白纳米球之间的二硫键断开，然后和各自纳米球中的蛋白质分子形成新的二硫键，从而使得聚集的多聚体白蛋白纳米球分离，达到分散多聚体白蛋白纳米球的目的，进而形成单个的分散的多聚体白蛋白纳米球。说明书CN104162165A5/21页80056如本文所述的，所述单个的分散的多聚体白蛋白纳米球为粒径范围在101000NM之间的多聚体白蛋白纳米球。碱性条件下透析处理之前，有些多聚体白蛋白纳米球之间会团聚，导致团聚后的纳米球的粒径偏大，经过碱性条件下透析处理后，团聚的纳米球得到分散，形成粒径更小的纳米球。本发明采用PH值为712的缓冲。
26、液进行透析，一方面可以去除纳米探针的悬浊液中的无机小分子等杂质，更重要的是，团聚的纳米探针在碱性条件下能分散为粒径更小的纳米球，从而获得分散、粒径均匀的多聚体白蛋白纳米球。0057优选地，所述步骤5中，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物。0058优选地，所述步骤5中，所述对步骤4所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理的方式为将步骤4所得的多聚体白蛋白纳米球溶液置于负0负20下预冻148小时后转移至负20负80下冷冻248小时,然后在冷冻干燥机中冷冻干燥12120小时。0059本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法，采用了边超声边将有机溶剂乙醇或含氯仿等非极性溶剂的乙醇注入白蛋白溶。
27、液的超声乳化去溶剂法的方式制备纳米球，一方面，乙醇等有机溶剂注入白蛋白溶液时能将蛋白质分子析出，与此同时，白蛋白分子间因二硫键的形成而聚集形成多聚体白蛋白纳米球。另一方面，控制好超声功率的大小和乙醇等有机溶剂的注入速度，可以控制所制备的多聚体白蛋白纳米球的粒径。这是因为，当超声功率大，乙醇等有机溶剂的注入速度大，所得的多聚体白蛋白纳米球的粒径就小；反之，当超声功率小，乙醇等有机溶剂的注入速度小，所得的多聚体白蛋白纳米球的粒径就大。因此，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法不但能获得多聚体白蛋白纳米球，而且能得到粒径可控的多聚体白蛋白纳米球，本发明提供的方法可以制备出粒径在101000NM之。
28、间的多聚体白蛋白纳米球。0060本发明提供的多聚体白蛋白纳米球在生物体内有还原剂谷胱甘肽等存在的条件下，白蛋白分子的二硫键被还原成巯基，多聚体白蛋白纳米球解聚，从而达到释放目标投递物的目的。0061第三方面，本发明提供了如第一方面所述的多聚体白蛋白纳米球或如第二方面所述的多聚体白蛋白纳米球的制备方法在制备预防、治疗或诊断癌症的药物中的应用。0062如本文所用的，“癌症”包括肿瘤。0063本发明提供了的多聚体白蛋白纳米球及其制备方法和应用具有如下有益效果00641本发明提供的多聚体白蛋白纳米球由不同的白蛋白分子通过分子之间二硫键相互连接形成纳米球团，在水、磷酸盐缓冲液、乙醇、血清、培养基等溶剂稀。
29、释条件下，比物理结合的白蛋白载体具有更高的稳定性；00652与使用化学交联剂如戊二醛等稳定的白蛋白载体相比，本发明提供的白蛋白纳米球采用了蛋白质分子本身的二硫键来获得稳定的纳米球，因此本分明提供的白蛋白纳米球更加安全；00663本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的粒径为101000NM，且其尺寸均一，分散性好，是运载药物或造影剂等目标投递物的良好载体，有利于在患者体内长时间有效、安全、稳定地释放投递物；00674本发明提供的多聚体白蛋白纳米球可用于制备预防、治疗或诊断癌症的药物。0068第四方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包说明书CN104162165A6/21页9。
30、括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，0069所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；0070所述目标投递物为造影剂；0071所述造影剂包括2,7双1,3二氢1,1二甲基34磺丁基1,3,5庚三烯单钠盐ICG和淋巴示踪剂；0072所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为101000NM。0073如本文所用的，“吲哚青绿”又称吲哚菁绿。0074优选地，本发明所采用的ICG优选为医用等级的无残留碘的ICG。0075如本发明所述的，“多聚体白蛋白纳米球”由白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，由于单体白蛋白分子中含有至少一个巯基或二硫键，若该单体分子中的巯基或二硫键在形成多聚体。
31、白蛋白纳米球时没有发生反应，则有可能保留在了多聚体白蛋白球，因此，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球可含有巯基、二硫键、或者同时含有巯基和二硫键，即本发明提供的多聚体白蛋白纳米球可含有巯基和/或二硫键。0076优选地，所述步骤5中，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为20100NM。0077优选地，所述步骤5中，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为20250NM。0078优选地，所述步骤5中，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为20300NM。0079优选地，所述步骤5中，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为300500NM。0080优选地，所述步骤5中，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为6001000NM。0081如本文所。
32、述的，所述多聚体白蛋白纳米球中包载目标投递物指纳米球中的白蛋白作为载体，包载所述目标投递物。0082如本文所述的，所述多聚体白蛋白纳米球中包载目标投递物优选为纳米球中的白蛋白形成蛋白外壳包裹所述目标投递物。0083如本文所述的，所述多聚体白蛋白纳米球中包载目标投递物的方式优选为0084纳米球中的白蛋白形成蛋白外壳，所述目标投递物被所述蛋白外壳包裹，或0085所述目标投递物与纳米球中的白蛋白相互镶嵌。0086优选地，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。0087优选地，所述淋巴示踪剂为3,7双二甲氨基吩噻嗪5翁氯化物美。
33、蓝、6,63,3二甲基1,1二苯基4,4二基双偶氮基双4氨基5羟基1,3萘二磺酸四钠盐伊文思蓝、24二乙氨基苯4二乙氨基环己烷2,5二烯甲烷苯基1,4二磺酸盐异硫蓝、4,4双二乙氨基三苯脱水甲醇2,4二磺酸单钠专利蓝中的至少一种。0088优选地，所述目标投递物的质量为所述多聚体白蛋白纳米球中白蛋白质量的0000205倍。0089优选地，所述目标投递物的质量为所述多聚体白蛋白纳米球中白蛋白质量的0000805倍。0090优选地，所述目标投递物的质量为所述多聚体白蛋白纳米球中白蛋白质量的000805倍。0091优选地，所述目标投递物中，所述ICG与淋巴示踪剂的质量比为100250。说明书CN104。
34、162165A7/21页100092改变多聚体白蛋白纳米球中各组分的摩尔比，可制得适合于不同药代动力学的多聚体白蛋白纳米球，本技术领域内普通技术人员可根据不同需要调整目标投递物的质量与白蛋白质量的摩尔比。0093如本文所用的，“吲哚青绿”又称吲哚菁绿。0094优选地，本发明所采用的ICG优选为医用等级的无残留碘的ICG。0095本发明提供的多聚体白蛋白纳米球是包括2,7双1,3二氢1,1二甲基34磺丁基1,3,5庚三烯单钠盐吲哚青绿、淋巴示踪剂和白蛋白的复合物；本发明提供的多聚体白蛋白纳米球具有稳定性好、靶向性好、尺寸均一、分散性好、生物相容性好、无残留的优点。本发明提供的多聚体白蛋白纳米球可。
35、用于荧光活体成像、光声成像和裸眼可视技术，实现术前精确定位和术中准确切除。此外，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球还可用于癌症的光动力学、光热治疗。0096如本发明所用的，“多聚体白蛋白纳米球”指包括可用于荧光活体成像、光声成像和裸眼可视技术的多功能用途纳米探针。0097本发明提供的多聚体白蛋白纳米球中，所述白蛋白能包载吲哚青绿和淋巴示踪剂，并形成二硫键稳定的多聚体白蛋白外壳，所述多聚体白蛋白外壳能提高纳米探针的稳定性、靶向性和生物相容性。0098白蛋白分子采用分子间二硫键交联形成多聚体白蛋白外壳，使得纳米探针可以稳定存在于生物体内血液循环系统中，从而避免淋巴示踪剂和ICG在血液循环系统传输过程中。
36、的无效释放。0099此外，多聚体白蛋白外壳提高了纳米探针的靶向性一方面，肿瘤组织的生长失控增加了大分子类物质和脂质粒子的选择性、高通透性和滞留性EPR效应，为纳米探针提供了一种被动靶向肿瘤组织的能力；另一方面，肿瘤组织细胞膜表面富含GP60、GP30、GP18等白蛋白受体，为具有白蛋白外壳的纳米探针提供了一种主动靶向肿瘤组织的能力。0100其次，本发明提供的纳米探针的生物相容性好、无残留，多聚体白蛋白外壳能在细胞中还原型谷胱甘肽GSH的作用下降解并释放出单体白蛋白，单体白蛋白在体内通过自然的新陈代谢进行降解，从而不会在体内引入任何外源性物质。0101吲哚菁绿ICG是目前唯一被美国食品药品管理局。
37、FDA和中国食品药品监督管理总局SFDA批准临床使用的近红外染料，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球中含有ICG，因此，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球能作为荧光活体成像以及光声成像探针，具有生物相容性好，代谢途径明确等优点。0102然而，作为一种有机小分子，ICG在临床应用过程中也存在不稳定、易分解、缺乏肿瘤主动靶向性等不足。0103本发明采用二硫键稳定的多聚体白蛋白纳米球包载ICG，可以避免ICG在血液循环系统传输过程中的无效释放和分解，提高ICG在生物体内血液循环系统中的稳定性。0104此外，ICG是一种具有近红外特征吸收峰的三碳花菁染料，在光照和氧存在下能够产生单线态氧和/或自由基而用于肿瘤。
38、的光动力学治疗，同时可将吸收的光能部分转化为热能而用于肿瘤的光热治疗，因此，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球还可用于癌症、肿瘤的光动力学、光热治疗。0105本发明提供的多聚体白蛋白纳米球中含有美蓝等淋巴示踪剂，能使肿瘤组织染说明书CN104162165A108/21页11色，从而与正常组织相区别，通过依靠本发明制备的多聚体白蛋白纳米球的靶向性将淋巴示踪剂运载到肿瘤组织，并在肿瘤组织富集，从而能在可见光的条件下进行裸眼观察，而无需借助额外的仪器。0106总之，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球采用白蛋白为载体、ICG为光学试剂、淋巴示踪剂为肿瘤示踪试剂，同时具有良好的近红外荧光成像、光声成像和裸眼可视。
39、能力，结合了荧光/光声和裸眼可视技术的优点，有助于实现术前精确定位和术中准确切除；本发明提供的多聚体白蛋白纳米球不仅可用于实时、无创地监测光学治疗前纳米粒子体内输送行为；光学治疗后还可通过成像对疗效进行实时评估，实现成像引导的光学治疗；还能在正常光线下，不借助额外的仪器，用肉眼即能区分肿瘤组织与正常组织，并准确切除肿瘤。0107第五方面，本发明提供了一种多聚体白蛋白纳米球的制备方法，包括以下步骤01081制备体积质量浓度为001300MG/ML的含巯基和/或二硫键的白蛋白水溶液，并调节所述白蛋白水溶液的PH值为712；0109其中，所述白蛋白水溶液为含有目标投递物的白蛋白混合液；0110所述目。
40、标投递物为造影剂；0111所述造影剂包括2,7双1,3二氢1,1二甲基34磺丁基1,3,5庚三烯单钠盐ICG和淋巴示踪剂；01122向步骤1所得的所述PH值为712的白蛋白混合液中加入带巯基的还原剂得反应液，然后在060下轻轻摇动反应00512小时，在所述反应液中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的105000倍；01133将步骤2反应后的溶液在060的条件下进行超声，所述超声的功率范围为1100KW，同时在搅拌的条件下在所述进行超声的溶液中以0011000ML/S的速度加入有机溶剂得到微乳溶液，所述微乳溶液在060的条件下反应5240MIN后，静置分层，然后去除有机相，得到含多聚体白。
41、蛋白纳米球的悬浊液，其中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤2反应后的溶液的1100倍；01144将步骤3所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在060以及PH值为712的条件下进行透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液；01155将步骤4所得的多聚体白蛋白纳米球溶液进行干燥脱水处理,得到多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，0116其中，所述多聚体白蛋白纳米球中包载有目标投递物；0117所述目标投递物为造影剂；0118所述造影剂包括2,7双1,3二氢1,1二甲基34磺丁基1,3,5庚三烯单钠盐和淋巴示踪剂；0119所述多聚体白。
42、蛋白纳米球的粒径为101000NM。0120优选地，所述步骤1中，所述含巯基和/或二硫键的白蛋白分子为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、重组血清白蛋白和血红蛋白中的至少一种。0121优选地，所述步骤1中，所述目标投递物的质量为所述白蛋白质量的0000205倍。0122进一步优选地，所述目标投递物的质量为所述多聚体白蛋白纳米球中白蛋白质量说明书CN104162165A119/21页12的0000805倍。0123进一步优选地，所述步骤1中，所述目标投递物的质量为所述多聚体白蛋白纳米球中白蛋白质量的000805倍。0124优选地，所述目标投递物中，所述ICG与淋巴示踪剂的质量比为10025。
43、0。0125优选地，所述步骤1中，所述淋巴示踪剂为美蓝、伊文思蓝、异硫蓝和专利蓝中的至少一种。0126优选地，所述步骤1中，所述白蛋白水溶液中含有第一有机溶剂。0127进一步优选地，所述第一有机溶剂为二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一种。0128更进一步优选地，所述第一有机溶剂在所述白蛋白水溶液中的体积分数为020。0129更进一步优选地，所述第一有机溶剂在所述白蛋白水溶液中的体积分数为00120。0130本发明采用的第一有机溶剂不仅还能提高目标投递物如药物或造影剂在溶液中的溶解度，使药物或造影剂充分溶解均匀。并使目标投递物与蛋白质充分混合均匀，目标投递物与白蛋白分子可以充分接触，。
44、为下一步超声过程中白蛋白包载目标投递物做准备。0131优选地，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法，将白蛋白水溶液和目标投递物先充分混合，使得白蛋白在包载目标投递物之前就与目标投递物充分接触，能提高白蛋白包载目标投递物的效率。0132优选地，所述步骤2中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的10100倍。0133优选地，所述步骤2中，所述带巯基的还原剂的摩尔数为白蛋白摩尔数的25005000倍。0134如本文所用的，所述“多聚体白蛋白”由单体白蛋白分子通过二硫键连接而成；多聚体的聚合度不仅与所采用的单体白蛋白分子的浓度，还与所采用的还原剂与单体白蛋白分子之间的摩尔比有关。0135优选。
45、地，所述步骤2中，所述带巯基的还原剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇。0136优选地，步骤2所述反应液在460下轻轻摇动反应。0137优选地，所述步骤3中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一种。0138进一步优选地，所有机溶剂还包括二甲基亚砜、三氯甲烷、二氯甲烷和正己烷中的至少一种。0139如本文所述的，所述步骤3中，静置分层是当采用的有机溶剂与水互不相溶时，才需要进行静置分层，并去除掉有机相；可替代地，当采用的有机溶剂与水互溶时，则不需要静置分层和去除有机相，所述与水互溶的有机溶剂优选为乙醇或DMSO。0140可替代的，本发明步骤3中所述的对溶液进行超声的目的是为了增。
46、加溶液中白蛋白、目标投递物的分散性，并使之充分接触，该超声步骤可以采用行业内其他混合方式，比如搅拌。说明书CN104162165A1210/21页130141其次，本发明采用的超声比搅拌等混合方式更优，因为超声功率的条件更可控。0142优选地，所述步骤3中，所述超声的功率范围为1100KW。0143优选地，所述步骤3中，所述超声的功率范围为50100KW。0144优选地，步骤3中步骤2反应后的溶液在460的条件下进行超声。0145优选地，步骤3中所述的微乳溶液在460的条件下反应5240MIN。0146优选地，所述步骤3中，所述有机溶剂中含有目标投递物，所述目标投递物包括2,7双1,3二氢1,。
47、1二甲基34磺丁基1,3,5庚三烯单钠盐和淋巴示踪剂。0147进一步优选地，所述淋巴示踪剂为美蓝、伊文思蓝、异硫蓝和专利蓝中的至少一种。0148优选地，所述步骤3中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤2反应后的溶液的2100倍。0149优选地，所述步骤3中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤2反应后的溶液的150倍。0150优选地，所述步骤3中，所述有机溶剂加入的体积为所述步骤2反应后的溶液的210倍。0151优选地，所述步骤3中，所述有机溶剂的速度加入为1001000ML/S。0152优选地，本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法，将白蛋白水溶液和目标投递物先充分混合，使得白蛋白在包载目标投递。
48、物之间就与目标投递物充分接触，能提高白蛋白包载目标投递物的效率。0153本发明可在步骤1的白蛋白溶液中加入目标投递物；可替代的，还可以在步骤3中的有机溶剂中加入目标投递物；可替代的，可以同时在步骤1的白蛋白溶液中，以及步骤3中的有机溶剂中加入目标投递物。0154本发明提供的多聚体白蛋白纳米球的制备方法将有机相有机溶剂加入水相白蛋白溶液，可替代的，也可将水相加入有机相。0155优选地，步骤4所述含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在460下进行透析。0156优选地，所述步骤4中，所述进行透析的方法为先将步骤3所得的含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液置于PH值为712的缓冲液中透析，得到多聚体白蛋白纳米球溶液。。
49、0157进一步优选地，所述步骤4中，所述用于透析的缓冲液为的PH为710。0158进一步优选地，所述步骤4中，所述用于透析的缓冲液为PBS缓冲液磷酸盐缓冲液或TRIS缓冲液。0159本文所用的PBS缓冲液或TRIS缓冲液按行业内常规方法配置。0160进一步优选地，所述步骤4中，所述含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液在缓冲液中的透析时间为10300小时。0161进一步优选地，所述步骤4中，含多聚体白蛋白纳米球的悬浊液置于PH值为712的缓冲液中透析后，再置于双蒸水内透析。0162更进一步优选地，置于双蒸水内透析的时间为124小时。0163本发明采用PH值为712的PBS缓冲液进行透析，一方面可以去除多聚体白蛋白纳米球粒的悬浊液中的无机小分子等杂质，更重要的是，团聚的多聚体白蛋白纳米球粒说明书CN104162165A1311/21页14之间的二硫键在碱性条件下发生交换或重排，在碱性条件下能分散为粒径更小的纳米球，从而获得分。