以疏水层析为主要手段的分离纯化重组细胞色素P450bm-3的方法 技术领域
本发明涉及一种以疏水层析为主要手段的分离纯化重组细胞色素P450bm-3的方法。
背景技术
细胞色素P450是一类还原态与CO结合后在波长450nm处有吸收峰的含血红素的单链蛋白质，它是自然界最具催化活力的生物催化剂，它的底物包括药物、类固醇、致癌物、除草剂、脂肪酸和杀虫剂等，1958年由Garfinkel和Klingenberg在哺乳动物的肝脏微粒体中首次发现。P450bm-3又称P450 102A1，是Narhi和Fulco在1986年首先从Bacillus megaterium ATCC14581中分离出来，是一种可溶解的单加氧酶，由于其类似与哺乳动物微粒体P450加氧酶，现在已作为哺乳动物微粒体P450单加氧酶重要的模型。目前，编码P450bm-3的基因已经被克隆和表达于Escherichia coli中，P450bm-3的分离纯化已成为进一步对其深入研究的关键。Narhi等用硫酸铵分级沉淀，Bio-Gel A-1.5m凝胶层析，DEAE-agarose离子交换层析，最后用Bio-Gel P-200凝胶层析，该工艺总收率为6％，提取工艺复杂，收率低。Shaun D.black等用2`，5`-ADP agrose亲和分离P450bm-3，洗脱时用2`-AMP，回收率虽高，由于2`-AMP价格十分昂贵不适于大规模纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本低、周期短、方法简单、易于掌握的以疏水层析为主要手段的分离纯化重组细胞色素P450bm-3的方法。
其方法步骤如下：
1)硫酸铵分级沉淀
用冷冻离心机将发酵液于0～20℃下以2000～10000rpm的速度离心8～15min，收集菌体，用冰水洗去培养基地杂质，重悬于0.8～1.5M(NH4)2SO4、0.1M PMSF、0.1M EDTA、pH6～8的磷酸缓冲液中，用超声波破碎仪在100～300W下破碎，然后以2000～10000rpm的速度离心8～30min，收集上清液，在上清液中加入20～40％饱和度的(NH4)2SO4沉淀，2000～10000rpm离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至60～85％的饱和度，2000～10000rpm离心收集沉淀，将沉淀重悬于0.8～1.5M(NH4)2SO4、0.1M PMSF、0.1M EDTA、pH6～8的磷酸缓冲液中，2000～10000rpm离心10～30min收集上清液，于0～20℃保存备用。
2)疏水层析分离
用层析系统将保存的上清液以15～60cm/h的线速度加入层析柱中，用含有0.2～2M(NH4)2SO4、10～200mM、0.1M PMSF、pH6～8的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至波长为280nm时的紫外吸收峰为零，再用不含(NH4)2SO4相同的磷酸缓冲液线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm进行检测。收集含P450bm-3的活性峰洗脱液，洗脱液于0～10℃条件下保存备用。
3)凝胶层析分离
用层析系统将疏水层析分离得到的活性洗脱峰收集液以10～100cm/h的线速度加入凝胶层析柱中，用10～200mM的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm和417nm进行检测，收集保留体积为9～12ml处的洗脱液，收集液体积为3～5ml。
本发明的优点：
1)分离工艺简单、生产周期短
本分离纯化工艺由硫酸铵分级沉淀、疏水层析与凝胶层析操作单元组成。硫酸铵分级沉淀约为5小时，疏水层析约为3小时，凝胶层析约为2小时；
2)作用条件温和、见效快
P450bm-3含有40％的疏水残基，疏水作用层析介质与蛋白质表面在非变性状态下依靠疏水相互作用与其它蛋白质进行分离，作用条件温和。
3)生产自动化水平高，操作方便
本生产工艺采用KTA explorer 100层析分析系统，可通过波长280nm、417nm的吸收值在线检测P450bm-3的存在与否。
4)占地小、成本低
本分离生产操作仅需二十多平方米的实验室即可进行。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明：
用以疏水层析为主要手段的分离纯化方法制备重组细胞色素P450bm-3，其具体步骤如下：
1)工程菌发酵
从固体培养基上挑取表达P450bm-3的单菌落接入10～200ml的种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50～200mg/l，在28～37℃、150～300rpm下摇床培养10～25小时，按1％～5％接种量接入发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到10～500mg/l，再在28～37℃、150～300rpm下摇床培养3～8小时，使其菌浓(OD578)达到0.6～1.0之间，升温至37～45℃，继续培养3～6小时，重组细胞色素P450bm-3在大肠杆菌细胞内表达。
2)硫酸铵分级沉淀
用冷冻离心机将发酵液于0～20℃条件下以2000～8000rpm的速度离心8～15min，收集菌体，用冰水洗去培养基等杂质，重悬于50mM含有0.1mM EDTA、0.1M PMSF、pH6～8的磷酸缓冲液中，用超声波破碎仪100～200W破碎细胞，然后以2000～10000rpm的速度离心8～30min，收集上清液，在上清液中加入20～40％饱和度的(NH4)2SO4沉淀，以2000～10000rpm速度离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至60～85％的饱和度，以2000～10000rpm速度离心收集沉淀，将沉淀重悬于0.8～1.5M(NH4)2SO4、0.1mM EDTA、0.1M PMSF、pH6～8的磷酸缓冲液中，以2000～10000rpm速度离心10～30min收集上清液，于0～20℃保存备用。
3)疏水层析分离
用层析系统将保存的上清液以10～100cm/h的线速度加入层析柱中，用含有0.2～2M(NH4)2SO4和0.1mM EDTA、0.1M PMSF的浓度为10～200mM、pH6～8的磷酸缓冲液以与进样相同的线速度洗涤至波长为280nm时的紫外吸收峰为零，再用除了不含(NH4)2SO4其它组分相同的磷酸缓冲液线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm下进行检测。收集含P450bm-3的活性峰洗脱液，洗脱液于0～10℃条件下保存备用。
4)凝胶层析分离
用层析系统将疏水层析分离得到的活性洗脱峰收集液以15～30cm/h的线速度加入层析柱中，用10～200mM的磷酸缓冲液以与进样相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm下进行检测，收集保留体积为9～12ml处的洗脱液，收集液体积为3～5ml。
在本发明中所用设备及材料如下：
1)菌种
宿主为Escherchia coli DH 5a，菌种由浙江大学生物工程研究所保存；
2)培养基
种子培养基(g/l)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 5.0，pH7.5；
发酵培养基(g/l)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 5.0，pH7.5；
固体培养基(g/l)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 5.0，pH7.5，琼脂8；
3)设备
电泳仪(Mini-Proten3cell)购自Bio-RAD公司；层析系统(KTA explorer100)、层析柱(XK16/20)、凝胶(Source 15ISO、Sephacryl S-200)购自AmershamPharmacia Biotech AB.Sweden；其他试剂均为市售的分析纯试剂。
实施例1
用以疏水层析为主要手段的分离纯化方法制备重组细胞色素P450bm-3，其具体步骤如下：
1)工程菌发酵
从固体培养基上挑取表达P450bm-3的单菌落接入25ml的种子培养基中(250mL的三角瓶)，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到100mg/l，在37℃、150rpm下摇床培养16小时，按1％接种量接入发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到100mg/l，再在37℃、150rpm下摇床培养5小时，然后升温至42℃，继续培养5小时，重组细胞色素P450bm-3在大肠杆菌细胞内表达。
2)硫酸铵分级沉淀
用冷冻离心机将发酵液于4℃条件下以4000rpm的速度离心10min，收集菌体，用冰水洗去培养基的杂质，重悬于含0.1mM EDTA和0.1M PMSF浓度为50mM、pH7的磷酸缓冲液中，用超声波破碎仪以200W破碎，然后以8000rpm的速度离心25min，收集上清液，在上清液中加入25％饱和度的(NH4)2SO4，8000rpm离心收集上清，继续在上清中加入(NH4)2SO4至70％的饱和度，以8000rpm的速度离心收集沉淀，将沉淀重悬于含1.0M(NH4)2SO4，1mM EDTA和0.1MPMSF的浓度为50mM的pH7的磷酸缓冲液中，以8000rpm的速度离心20min收集上清液，于4℃下保存备用。
3)疏水层析分离
用层析系统将保存的上清液以30cm/h的线速度加入层析柱中，用含有1.0M(NH4)2SO4、0.1mM EDTA和0.1M PMSF浓度为50mM、pH7的磷酸缓冲液以与进样相同的线速度洗涤至波长为280nm时的紫外吸收峰为零，再用不含(NH4)2SO4相同的磷酸缓冲液线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm进行检测。收集含P450bm-3的活性峰洗脱液，洗脱液于4℃条件下保存备用。
4)凝胶层析分离
用层析系统将疏水层析分离得到的活性洗脱峰收集液以22.5cm/h的线速度加入层析柱中，用50mM的磷酸缓冲液以进样相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm进行检测，收集保留体积约为9.5mL处的洗脱液，收集液体积为3ml。
实施例2
用以疏水层析为主要手段的分离纯化方法制备重组细胞色素P450bm-3，其具体步骤如下：
1)工程菌发酵
从固体培养基上挑取表达P450bm-3的单菌落接入25ml的种子培养基中(500mL的三角瓶)，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到120mg/l，在37℃、150rpm下摇床培养18小时，按2％接种量接入发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到120mg/l，再在37℃、150rpm下摇床培养3小时，然后升温至42℃，继续培养4.5小时，重组细胞色素P450bm-3在大肠杆菌细胞内表达。
2)硫酸铵分级沉淀
用冷冻离心机将发酵液于4℃条件下以4000rpm的速度离心30min，收集菌体，用冰水洗去培养基的杂质，重悬于含有0.1mM EDTA和0.1M PMSF浓度为50mM、pH7的磷酸缓冲液中，用超声波破碎仪180W破碎细胞，然后以10000rpm的速度离心25min，收集上清液，在上清液中加入35％饱和度的(NH4)2SO4，10000rpm离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至85％的饱和度，以10000rpm的速度离心20min收集沉淀，将沉淀重悬于含有1.1M(NH4)2SO4、0.1mM EDTA和0.1M PMSF的浓度为50mM、pH7的磷酸缓冲液中，以8000rpm的速度离心20min收集上清液，于4℃下保存备用。
3)疏水层析分离
用层析系统将保存的上清液以30cm/h的线速度加入层析柱中，用含有1.1M(NH4)2SO4、0.1mM EDTA和0.1M PMSF的浓度为50mM、pH7的磷酸缓冲液以与进样相同的线速度洗涤至波长为280nm时的紫外吸收峰为零，再用除了不含(NH4)2SO4其它组分均相同的磷酸缓冲液线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm进行检测。收集含P450bm-3的活性峰洗脱液，洗脱液于4℃条件下保存备用。
4)凝胶层析分离
用层析系统将疏水层析分离得到的活性洗脱峰收集液以15cm/h的线速度加入层析柱中，用50mM、pH7.0的磷酸缓冲液以与进样相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm进行检测，收集保留体积约为9.5mL处的洗脱液，收集液体积为3ml。
实施例3
用以疏水层析为主要手段的分离纯化方法制备重组细胞色素P450bm-3，其具体步骤如下：
1)工程菌发酵
从固体培养基上挑取表达P450bm-3的单菌落接入10ml的种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50mg/l，在30℃、200rpm下摇床培养过夜，按3％接种量接入发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50mg/l，再在30℃、150rpm摇床培养3小时，然后升温至42℃，继续培养5小时，重组细胞色素P450bm-3在大肠杆菌细胞内表达。
2)硫酸铵分级沉淀
用冷冻离心机将发酵液于4℃条件下以4000rpm的速度离心15min，收集菌体，用冰水洗去培养基等杂质，重悬于含0.1mM EDTA和0.1M PMSF的浓度为50mM、pH8的磷酸缓冲液中，用超声波破碎仪以150W破碎细胞，然后以10000rpm的速度离心15min，收集上清液，在上清液中加入20％饱和度的(NH4)2SO4，10000rpm离心15min收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至85％的饱和度，以10000rpm的速度离心15min收集沉淀，将沉淀重悬于含1.0M(NH4)2SO4、0.1mM EDTA和0.1M PMSF的浓度为50mM、pH8.0的磷酸缓冲液中，以10000rpm的速度离心20min收集上清，于4℃保存备用。
3)疏水层析分离
用层析系统将保存的上清液以30cm/h的线速度加入层析柱中，用含有1.0M(NH4)2SO4、0.1mM EDTA和0.1M PMSF的浓度为50mM、pH8的磷酸缓冲液以与进样相同的线速度洗涤至波长为280nm时的紫外吸收峰为零，再用除了不含(NH4)2SO4其它组分均相同的磷酸缓冲液线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm进行检测。收集含P450bm-3的活性峰洗脱液，洗脱液于4℃条件下保存备用。
4)凝胶层析分离
用层析系统将疏水层析分离得到的活性洗脱峰收集液以30cm/h的线速度加入层析柱中，用50mM、pH8.0的磷酸缓冲液以进样相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm进行检测，收集保留体积为9mL处的洗脱液，收集液体积为3ml。
实施例4
用以疏水层析为主要手段的分离纯化方法制备重组细胞色素P450bm-3，其具体步骤如下：
1)工程菌发酵
从固体培养基上挑取表达P450bm-3的单菌落接入50ml的种子培养基中(500mL的三角瓶)，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到200mg/l，在35℃、200rpm下摇床培养20小时，按5％接种量接入发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到200mg/l，再在35℃、200rpm下摇床培养6小时，然后升温至42℃，继续培养5小时，重组细胞色素P450bm-3在大肠杆菌细胞内表达。
2)硫酸铵分级沉淀
用冷冻离心机将发酵液于4℃条件下以6000rpm的速度离心5min，收集菌体，用冰水洗去培养基的杂质，重悬于含有0.1mM EDTA和0.1M PMSF的浓度为50mM pH7的磷酸缓冲液中，用超声波破碎仪以120W破碎细胞，然后以8000rpm的速度离心10min，收集上清液，在上清液中加入35％饱和度的(NH4)2SO4，以6000rpm的速度离心30min收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至85％的饱和度，以6000rpm的速度离心30min收集沉淀，将沉淀重悬于含有1.0M(NH4)2SO4、0.1mM EDTA和0.1M PMSF的浓度为50mM、pH7.0的磷酸缓冲液中，以10000rpm的速度离心30min收集上清液，于4℃下保存备用。
3)疏水层析分离
用层析系统将保存的上清液以30cm/h的线速度加入层析柱中，用含有1.0M(NH4)2SO4、0.1mM EDTA和0.1M PMSF的浓度为50mM、pH7.0的磷酸缓冲液以与进样相同的线速度洗涤至波长为280nm时的紫外吸收峰为零，再用除了不含(NH4)2SO4其它组分均相同的磷酸缓冲液线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm进行检测。收集含P450bm-3的活性峰洗脱液，洗脱液于4℃条件下保存备用。
4)凝胶层析分离
用层析系统将疏水层析分离得到的活性洗脱峰收集液以30cm/h的线速度加入层析柱中，用50mM、pH7.0的磷酸缓冲液以进样相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm下进行检测，收集保留体积为10mL处的洗脱液，收集液体积为3ml。