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1、10申请公布号CN104087579A43申请公布日20141008CN104087579A21申请号201410321024722申请日20140707C12N15/11200601C12Q1/68200601A01H1/0420060171申请人合肥丰乐种业股份有限公司地址230031安徽省合肥市樊洼路8号72发明人朱先飞耿延琢王利明王兆贤张二朋杨焰华齐伟王丽梅74专利代理机构安徽省合肥新安专利代理有限责任公司34101代理人何梅生王伟54发明名称一种与玉米青枯病抗性基因紧密连锁的分子标记、引物及其应用57摘要本发明公开了一种与玉米青枯病抗性基因紧密连锁的分子标记，为序列表SEQIDNO1。
2、所示的核苷酸序列或序列表SEQIDNO2所示核苷酸序列。扩增该分子标记的引物对为序列表SEQIDNO3所示的核苷酸序列和SEQIDNO4所示的核苷酸序列。在用于玉米青枯病检测时，通过PCR扩增，若所得PCR扩增产物为234BP碱基片段，则待玉米为抗青枯病品种，若所得PCR扩增产物为274BP碱基片段，则待测玉米为青枯病感病品种。采用本发明方法可以在玉米播种前检测玉米是否具有青枯病抗性，进行有选择性地播种，缩短了育种时间，本发明方法快速简便，可广泛应用于玉米的辅助育种。51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页。
3、序列表3页附图1页10申请公布号CN104087579ACN104087579A1/1页21一种与玉米青枯病抗性基因紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列或序列表SEQIDNO2所示核苷酸序列。2一种扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的引物1为序列表SEQIDNO3所示的核苷酸序列，所述引物对的引物2为SEQIDNO4所示的核苷酸序列。3一种检测玉米青枯病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤1PCR扩增以待测玉米提取的基因组作为DNA扩增模板，以序列表SEQIDNO3所示核苷酸序列和序列表SEQIDNO4所示核苷酸序。
4、列组成为扩增引物对进行PCR扩增；2扩增产物的鉴定若所得PCR扩增产物为234BP碱基片段，则待玉米为抗青枯病品种，若所得PCR扩增产物为274BP碱基片段，则待测玉米为青枯病感病品种。4根据权利要求3所述的一种检测玉米青枯病抗性的方法，其特征在于，所述步骤2中，234BP碱基片段为序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列；274BP碱基片段为序列表SEQIDNO2所示核苷酸序列。5根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的待测玉米提取的基因组方法为碱煮法，具体步骤为取1/20的玉米籽粒胚乳用02MOL/L氢氧化钠40ML在100水浴5分钟，再加入60ML的017MOL/LTRISHC。
5、L水浴3分钟，4冰箱冷却备用，即得所述待测玉米提取的基因组。6根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的PCR扩增的反应体系为含MG2的10XBUFFER21，1OMM的DNTP04L，5M的序列表SEQIDNO3所示的核苷酸序列和序列表SEQIDNO4所示的核苷酸序列各21，所述待测玉米提取的基因组DNA11,5U/1的TAQ酶051，其余为超纯水，反应体积为201，滴加一滴矿物油覆盖；PCR反应程序为945MIN；9460S、53560S,7260S,35个循环；721OMIN。7根据权利要求1所述的分子标记在玉米育种中的应用。8根据权利要求2所述的引物对在玉米育种中的应用。9根。
6、据权利要求36中任一项用于检测玉米青枯病抗性的方法在玉米育种中的应用。权利要求书CN104087579A1/8页3一种与玉米青枯病抗性基因紧密连锁的分子标记、引物及其应用技术领域0001本发明属于农业生物技术领域，具体涉及用于检测玉米青枯病抗性的方法和PCR引物及其应用。背景技术0002基于表型选择的常规育种方法存在选择效率低和育种周期长等缺点，迫切需要注入现代分子技术手段，辅之于高效率地基因型定向选择，才能快速高效地培育出优异玉米新品种。随着分子生物学和基因组学的迅速发展，分子标记技术的应用更加广泛。基于PCR的分子标记如微卫星或SSRSIMPLESEQUENCEREPEAT等具有多态率高、。
7、相对稳定、检测方法简便快速及易于操作等特点而被广泛的应用。由于分子标记辅助选择不易受环境因素影响和性状显隐性干扰等，可以从分子水平定向选择目标性状基因，同时还有可能打破不利基因之间的连锁而高效率地聚合多个优良基因于一体。通常所说的分子标记既包括目标基因的连锁标记也包括目标基因自身功能标记。分子标记辅助多基因聚合育种技术已经成为玉米、水稻等作物育种研究的一种发展趋势，运用该技术能否有效地将优质、多抗和高产等基因聚合到少数骨干品种中，关键在于能否获得与目标性状基因或主效QTL紧密连锁的实用分子标记。0003玉米青枯病又称玉米茎腐病、玉米茎基腐病等,具有发病突然、发展迅速、减产严重、防治困难的特点,。
8、是世界玉米产区的主要病害之一。近年来,玉米青枯病在我国各地玉米制种田、大田普遍发生,一般年份产量损失在20左右,严重的可达50以上,近几年为害程度明显加重,呈逐年加重的趋势,所以研究玉米茎腐病病原和发病规律,培育抗病品种,减少玉米产量损失有重要意义。0004YANG等YANGQ,YINGM,GUOYL,ETALAMAJORQTLFORRESISTANCETOGIBBERELLASTALKROTINMAIZEJTHEORAPPLGENET2010121673687用自交系1145Y331的F2、BC2F1和BC3F1群体作为研究群体，证实QRFG1为抗茎腐病主效QTL，通过追踪BC4F1至BC6。
9、F1代的精细定位研究，发现QRFG1与标记SSR334和SSR58紧密连锁，距离为0500BP，抗性贡献率为3243，并且认为QRFG1通过发挥遗传能力能显著提高玉米的抗茎腐病能力。QING等QINGYANG,ZHILI,ETALCACTALIKETRANSPOSABLEELEMENTINZMCCTATTENUATEDPHOTOPERIODSENSITIVITYANDACCELERATEDTHEPOSTDOMESTICATIONSPREADOFMAIZEPNAS2013,10报道这个抗病QTL是一个包含CCT结构域的基因，命名为ZMCCT，包含CCT结构域的这类基因可能通过影响光周期进一步影响。
10、农作物的其他关键农艺性状，是一个有重大价值、可应用于作物遗传改良的关键基因。发明内容0005本发明目的在于提供用于检测玉米青枯病抗性的功能特异性分子标记和方法，采用本发明方法可以在玉米播种前检测玉米是否具有青枯病抗性，进行有选择性地播种，缩说明书CN104087579A2/8页4短了育种时间，本发明方法快速简便，可广泛应用于玉米的辅助育种。0006为实现本发明目的采用如下技术方案0007一种与玉米青枯病抗性基因紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列或序列表SEQIDNO2所示核苷酸序列。0008一种扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，所。
11、述引物对的引物1为序列表SEQIDNO3所示的核苷酸序列，所述引物对的引物2为SEQIDNO4所示的核苷酸序列。0009一种检测玉米青枯病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤00101PCR扩增以待测玉米提取的基因组作为DNA扩增模板，以序列表SEQIDNO3所示核苷酸序列和序列表SEQIDNO4所示核苷酸序列组成为扩增引物对进行PCR扩增；00112扩增产物的鉴定若所得PCR扩增产物为234BP碱基片段，则待玉米为抗青枯病品种，若所得PCR扩增产物为274BP碱基片段，则待测玉米为青枯病感病品种。00124、根据权利要求3所述的一种检测玉米青枯病抗性的方法，其特征在于，所述步骤2中，。
12、234BP碱基片段为序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列；274BP碱基片段为序列表SEQIDNO2所示核苷酸序列。0013所述步骤1中的待测玉米提取的基因组方法为碱煮法，具体步骤为取1/20的玉米籽粒胚乳用02MOL/L氢氧化钠40ML在100水浴5分钟，再加入60ML的017MOL/LTRISHCL水浴3分钟，4冰箱冷却备用，即得所述待测玉米提取的基因组。0014所述步骤1中的PCR扩增的反应体系为含MG2的10XBUFFER21，1OMM的DNTP04L，5M的序列表SEQIDNO3所示的核苷酸序列和序列表SEQIDNO4所示的核苷酸序列各21，所述待测玉米提取的基因组DNA11,5U。
13、/1的TAQ酶051，其余为超纯水，反应体积为201，滴加一滴矿物油覆盖；PCR反应程序为945MIN；9460S、53560S,7260S,35个循环；721OMIN。0015所述的分子标记在玉米育种中的应用。0016所述的引物对在玉米育种中的应用。0017所述检测玉米青枯病抗性的方法在玉米育种中的应用。0018所述分子标记位于抗性基因ZMCCT的启动子区域。0019本发明相对于现有技术具有如下有益效果0020本发明的方法克服了常规育种中因表型选择易受环境因素干扰而导致育种效率低等问题，可以利用序列表SEQIDNO3所示核苷酸序列和序列表SEQIDNO4所示核苷酸序列组成的专用引物对对玉米青。
14、枯病抗性基因进行早期世代选择而缩短育种周期，从而较快地筛选出抗青枯病的玉米材料。本发明可应用于玉米育种，以提高育种效率和玉米产量水平。0021本发明的方法克服了分子标记辅助育种中，由于分子标记和抗青枯病基因有一定的遗传距离，在育种过程中存在分离的可能性的问题。本发明中的序列表SEQIDNO3所示的核苷酸序列和序列表SEQIDNO4所示的核苷酸序列的标记位点位于抗性基因的启动子区域，与抗性基因紧密连锁，不会出现分离，可以更有效地提高育种效率。0022本发明序列表SEQIDNO3所示的核苷酸序列和序列表SEQIDNO4所示的核苷酸序列所组成的引物对可以很好地扩增经过简单处理所得到的待测玉米提取的基。
15、因组，克说明书CN104087579A3/8页5服了现有技术中与该基因紧密连锁的其他分子标记无法扩增经本发明方法所提取出的待测玉米基因组的问题，从而使得本发明方法能够对播种前的玉米种粒进行快速基因鉴定筛选，然后有选择性地播种，减少用工用地，缩短育种周期，进一步提高育种效率。附图说明0023图1是用序列表SEQIDNO5所示核苷酸序列和序列表SEQIDNO6所示核苷酸序列组成的引物对扩增抗病品种1145和不抗品种0908后，扩增产物碱基片段对比。0024图中虚线区域表示41BP的缺失，QUERY是1145父本，高抗青枯病的序列，QUERY是0908母本，不抗青枯病的序列。0025图2是序列表SE。
16、QIDNO3所示核苷酸序列和序列表SEQIDNO4所示核苷酸序列组成的引物对扩增抗病品种1145和不抗品种0908以及两者杂交种的电泳图。0026图中1145、0908和杂交种每个材料各3个重复，M大小为250BP。具体实施方式0027以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均由常规生化试剂公司购买得到。0028实施例1、青枯病抗性性状鉴定专用引物对序列表SEQIDNO3所示的核苷酸序列和序列表SEQIDNO4所示的核苷酸序列的获得0029一、双亲基因组扩增0030用于创建玉米重组自交系R。
17、ECOMBINANTINBREDLINE，RIL群体的双亲分别是1145和本公司选育的0908。0908为母本，不抗青枯病；1145为父本，高抗青枯病。0031采用CTAB法提取双亲叶片的基因组DNA，以QINGYANGQINGYANG,ZHILI,ETALCACTALIKETRANSPOSABLEELEMENTINZMCCTATTENUATEDPHOTOPERIODSENSITIVITYANDACCELERATEDTHEPOSTDOMESTICATIONSPREADOFMAIZEPNAS2013,10公布的引物对，由序列表SEQIDNO5所示核苷酸序列和序列表SEQIDNO6所示的核苷酸序列。
18、组成，委托北京梓熙生物公司合成后，进行扩增实验。PCR反应体系为10XBUFFER2L含MG2，DNTP04110MM，序列表所示的SEQIDNO5和序列表所示的SEQIDNO6各215，基因组DNA1L40NG/L，TAQ酶0515/1，其余为超纯水，反应体积为201，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序为945MIN；9460S,53560S,7260S，35个循环；721OMIN。0032PCR扩增产物送去测序，测序公司为北京梓熙生物公司，测序结果在NCBI网站的在线比对结果见图1。表中QUERY是1145父本，高抗青枯病的序列；QUERY是0908母本，不抗青枯病的序列。0033二、引物。
19、合成和验证0034根据图1的测序比对结果，在跨越两个序列有41BP插入缺失差异区域设计引物，上游引物为序列表SEQIDNO3所示核苷酸序列，下游引物为序列表SEQIDNO4所示核苷酸序列。委托北京梓熙生物公司合成。上游引物和下游引物将该引物对命名为QK1位于基因ZMCCT启动子区域。说明书CN104087579A4/8页60035利用新合成的引物扩增1145和0908，以及两者的杂交种。采用碱煮法提取玉米籽粒DNA,具体步骤为取1/20的玉米籽粒胚乳用02MOL/L氢氧化钠40ML在100水浴5分钟，再加入60ML的017MOL/LTRISHCL水浴3分钟，冷却备用，即得待测玉米提取的基因组。。
20、0036PCR反应体系为10XBUFFER21含MG2，DNTP0411OMM，上游引物和下游引物各215M，待测玉米提取的基因组DNA11,TAQ酶0515U/1，反应体积为201，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序为945MIN；9460S、53560S,7260S,35个循环；721OMIN。0037PCR扩增产物用6聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并观察拍照，见图2。对PCR扩增产物进行测序，从QK1扩增产物的电泳图可以清晰地看出，1145有一条电泳带，经测序所述电泳带对应的扩增产物为234BP碱基片段，为序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列；0908有一条电泳带，经测序所述电。
21、泳带对应的扩增产物为274BP碱基片段，为序列表SEQIDNO2所示核苷酸序列；杂交品种有二条电泳带，经测序所述电泳带对应的扩增产物为234BP和274BP碱基片段，为序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列和序列表SEQIDNO2所示核苷酸序列。0038实施例2、QK1的扩增产物与玉米青枯病抗性性状的相关性验证0039以高抗青枯病材料1145和不抗青枯病材料0908做亲本，两者杂交后的96个F2代材料为试验对象。采用碱煮法提取玉米胚乳的基因组DNA，具体步骤同与实施例1。以QK1进行PCR扩增实验。PCR反应体系为PCR反应体系为10XBUFFER21含MG2，DNTP0411OMM，序列表S。
22、EQIDNO3所示的核苷酸序列和序列表SEQIDNO4所示的核苷酸序列各215，待测玉米提取的基因组DNA11,TAQ酶0515U/1，反应体积为201，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序为945MIN；9460S、53560S,7260S,35个循环；721OMIN。0040PCR扩增产物用6聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并观察拍照记录,其中纯合的234BP的23株，纯合274BP的28株，杂合带型的45株。0041在玉米播种时,覆土前，将带有病原菌的玉米籽粒均匀盖在96个切取少许胚乳取1/20的玉米籽粒胚乳，可以取胚乳的任一部位只要不伤害到玉米胚即可后的F2种子上面。接种后灌溉1次。
23、,此后保持充足的土壤水分。所使用的病原菌由安徽农业大学提供。0042发病后，通过田间鉴定,叶片青枯或黄枯,果穗倒挂,茎基变软变褐并腐烂的,则认为是感病株,其它记为抗病植株。对田间调查结果进行记录。0043分析如下如下面表1所示，供试玉米样本中存在纯合234BP的23株，20株表现为抗病，有3株感病；而不带有234BP片段的28个材料中26株感病，有2株抗病；杂合的45株，41株表现为抗病，4株感病；两者的一致性达到906。因此，序列表SEQIDNO3和序列表SEQIDNO4组成的QK1引物对是与青枯病抗性性状相关位点相紧密连锁的分子标记，可用于玉米分子辅助育种。0044表1QK1扩增产物鉴定结果与田间青枯病接种试验对照0045说明书CN104087579A5/8页700460047说明书CN104087579A6/8页80048说明书CN104087579A7/8页90049说明书CN104087579A8/8页10说明书CN104087579A101/3页1100010002序列表CN104087579A112/3页120003序列表CN104087579A123/3页13序列表CN104087579A131/1页14图1图2说明书附图CN104087579A14。