半边旗提取物及其医药组合物 本发明涉及一组从凤尾蕨科植物半边旗(Pteris Semipi-nnate Linn)提取的化合物，以及其医药组合物，特别是涉及新的抗肿瘤药物。
恶性肿瘤是危害人类健康的最严重的疾病，国内外学者对抗癌化学药物研究历时40多年，进行了很广泛的研究，经筛选的物质约五十万种，在临床上有一定意义的约有60多种，现有的抗癌化疗药在防治肿瘤已取得较大的进展，但这类化疗药大多数在杀灭癌细胞的同时，对正常组织器官，如骨髓、胃肠道等也有损害作用，呈现一定的毒性，从而限制用量，阻碍疗效发挥。本研究组已证明一种植物——凤尾蕨科植物半边旗的提取物具有显著的抗癌作用，其单独应用有显著抑制肿癌细胞的增殖作用，与其他化疗药合用可以促进化疗药物抗癌活性，但又能对抗其抑制骨髓和损害胃肠道功能的不良反应，具有高效低毒，不良反应少的优点。然而，半边旗这种抗癌的主要活性成份是什么，它的提取物中那一种是最主要的有效成份，这些有效成份的抗癌机制如何？这些有效成份是不是一种新的、尚未被人们认识的高效低毒地抗癌药，这是过去的研究尚未解决的问题。
本发明的目的在于从半边旗中提取出一种或数种具有抗癌活性的化合物，确定其化学结构，了解其抗癌机制，为临床医学提供一种新的医药组合物，特别是新的抗肿瘤药物。
本发明的另一目的在于提供一种或数种具有医疗作用的化合物，或由这些化合物组成的医药组合物。
本发明涉及下述两种化合物，这两种化合物最初是从凤尾蕨科植物半边旗提取，分离并经鉴定证实的。
1、化合物F-ACompound F-A：mp243-246℃，[α]D-74°(c＝0.2，MeOH)ent-7α，11α-dihydroxy-15-oxo-Kaur-16-en-19，6β-olide对映-7α，11α-二羟基-15氧-16烯-拷利酸内酯(19，6)
2、化合物F-BCompound F-B：mp235-239℃，[α]D-145°(c＝0.2，MeOH)ent-11α-hydroty-15-oxo-Kaur-16en-19-oic acid对映-11α-羟基-15氧-16烯-19拷利酸
以上两种化合物的提取工艺为：
取半边旗全草洗净风干，乙醇提取3次，浓缩后上活性炭柱，以MeOH∶CHCH3(2∶1)洗脱，浓缩后上硅胶柱分离，以CHCl3∶MeOH(90∶2)洗脱，得一系列化合物。其中上述两种化合物经实验研究证明具有显著的药理活性后，再经本组研究已确定了它们的化学结构，对这些化学结构的鉴定后来又得到日本东京理科大学药学系Nobutoshi Tanaka教授帮助，经核磁共振(NMR)等光谱方法作进一步的确定。
经上述方法提取分离的两种化合物，经动物实验证明对培养的人白血病细胞株HL-60和红白血病细胞株K562、鼻咽癌细胞(CNE-22)、口腔上皮癌细胞(KB Cell)有明显的抗癌活性，进一步的研究初步证明此两种化合物抗癌活性可能与抑制细胞的有丝分裂有关。
上述两种化合物也可从凤尾蕨科其它植物中提取及分离，如凤尾蕨科植物刺齿凤尾蕨(Pteris dispar L.)，以及Pterisaltissima Poir；Pteris tremula R.Br； Pteris livida mett；Pteris Longipes Don等植物中也可提取出上述化学成分。其它植物也可提取或分离出其中一种或多种成分。
上述两种化合物尚可通过类似化合物进行结构改造或用人工的方法合成而获得。
上述两种化合物作为医药组合物，特别是抗肿瘤的药理活性，是通过下述实验证实的。
实施例一：
1、材料与方法
采用经鉴定的上述化合物F-A，溶于5％DMSO中，再用培养液稀释至实验浓度。
试剂及仪器：3H-TdR为上海核技术开发公司产品，比活为22ci/mmol，RNA酶为上海伯奥科技公司产品，核酸掺入剂碘化丙啶(PI)染料，NBT(p-nitro-blue-tetrazolium chloride)，TPA(12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)均为sigma产品，RPMI-1640为Gibco产品，美国COULTER公司EPICS XL型流式细胞仪。
肿瘤细胞及其培养人早幼粒细胞白血病HL-60和人红白细胞白血病K562由中国医学科学院药物研究所引进，均在含10％灭活小牛血清，100单位·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素的RPMI-1640培养基中，置37℃5％的CO2孵箱中传代培养。
细胞增殖抑制作用及IC50测定：取对数生长期细胞，配制成1×105个·ml-1细胞悬液，分别接种于1ml的培养板中，药物分成5个不同浓度，每浓度设三个平行管，对照加入同量培养液，药物与细胞接触24hr后，以台盼兰排斥法计数活细胞，算出细胞生长抑制率，再按改良Karber公式算出IC50。
HL-60细胞生长曲线的测定，取对数生长期细胞，配成5×104个·ml-1细胞悬液，分装培养板中，每组每天三孔，然后加入药物，对照组加等量培养液，置37℃5％CO2培养。于不同时间取出细胞，按台盼兰排斥法计数活细胞，连续观察5天。
3H-脱氧胸苷(3H-TdR)掺入实验：取对数生长期细胞配成一定细胞数接种培养板中，每组四个平行孔，加入药物培养药物作用不同时间内细胞计数后，每孔加入3H-TdR使终浓度为1uci·ml-14hr后，用多头细胞收集器收集细胞于49型玻璃纤维纸上，处理后，于液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(CPM)，扣除本底CPM，以CPM/5×105细胞为计算单位。按下式求得抑制率(IR％)
对HL-60细胞NBT还原能力的影响[]，将培养4d的给药组及对照组细胞，在4℃1000r·min-1离心5min，弃上清液，每管加入0.5ml含1％NBT及200ng·ml-1 TPA的培养液，37℃保温60min，离心弃上清液，取细胞涂片，wright-Giemsa染色10min，油镜下观察，细胞内出现蓝黑色甲沉淀者为阳性。随机观察200个细胞，计算NBT细胞阳性率。
细胞周期分析对照组与加药组细胞，在规定时间离心收获细胞达1×106个，加冷PBS液洗涤两次，用70％冷乙醇固定，4℃保存。测定时离心弃乙醇，PBS洗涤两次。加RNA酶(0.1mg/管)37℃消化30分钟，PI染色(50μg·ml-1)15分钟，置EPICSXL型流式细胞仪(FCM)分析细胞周期分布。
HL-60细胞电镜标本的制备在规定时间内取对照组与给药组细胞，用冷PBS液洗涤二次，充分吹打后固定于PH7.2的2.5％或二醛二甲胂酸钠缓冲液中，梯度酒精脱水，Epon812包埋，LKB-V超薄切片机切片，铀铅双染色，H-300透射电镜检查。
2、实验结果
F-A对HL-60及K562细胞的抑制作用和IC50值F-A不同浓度对HL-60和K562细胞作用24hr后的抑制率见表1，其中对两细胞株的IC50值分别为7.6和9.1μg·ml-1。阳性对照顺氯氨铂(Cisplatin，DDP)对HL-60的IC50为8.7·ml-1。结果表明F-A的抗肿瘤活性较高。
表l F-A对HL-60和K562抑制作用及IC50值细胞
药物浓度(μg·ml-1)与抑制率％
IC50(ug·ml-1)
50 25 12.5 6.25 3.125HL-60 93.0 71.2 57.3 46.7 44.4 7.6K562 94.0 77.5 55.4 36.7 26.7 9.1
F-A对HL-60细胞生长曲线的影响HL-60细胞在F-A作用下，生长受抑制，并呈浓度和时间依赖性(图1)，浓度在4μg·ml-1时即可明显抑制HL-60细胞的生长。
F-A对3H-TdR掺入试验的影响F-A对HL-60细胞作用3hr和24hr后对3H-TdR的掺入情况见表2，F-A作用3hr时，HL-60细胞对3H-TdR掺入影响不大，而作用24hr后，对3H-TdR掺入有一定抑制作用，呈浓度依赖性。说明F-A有一定的抑制DNA合成的作用。
表2 F-A对3H-TdR掺入HL-60细胞DNA合成影响药物浓度 CPM/5×105细胞(X±SD) 抑制率(％)(μg·ml-1)
3hr 24hr 3hr 24hr对照 4686±1091 12853.9±2820.7 - -3.0 4824±1245 11832.5±1002.3 0 7.910.0 3683.7±242.9 7908±1201 21.4 38.550.0 3116±726.7 7488±231.5 33.5 41.7
F-A对HL-60细胞NBT还原能力的影响人早幼粒白血病HL-60细胞缺乏NBT还原能力，如果细胞被诱导向成熟细胞分化，则获得NBT还原能力。F-A分别4μg·ml-1和8μg·ml-1作用于HL-60细胞4d后，出现甲颗粒的阳性细胞率小于5％，与不给药组比较P＞0.05，说明F-A对HL-60细胞不具有分化诱导作用。
[F-A对HL-60细胞周期分布的影响]F-A对HL-60细胞作用8hr后对细胞周期DNA含量的影响见表3。
表3 F-A对HL-60细胞作用48hr后的细胞周期变化
％G0＋G1％S ％G2＋MHL-60细胞对照 36.2 63.8 0正常人淋巴细胞对照 89.2 9.8 1.0抗癌药5-Fu对照 73.0 27.0 0F＝A(5μg·ml-1， 47.3 36.2 16.4F-A(10μg·ml-1) 75.3 14.8 9.9
如表3结果，不加药组(对照组)HL-60细胞大部分处于S期，这是肿瘤细胞的特性(与淋巴cell比较)，用5-Fu作抗癌药对照，可见S期细胞明显抑制，多数为G1期细胞。说明5-Fu明显抑制DNA的合成。F-A的情形与5-Fu不同，它主要表现在G2＋M期细胞增多，即此时G2＋M期细胞受阻，使细胞停留于M期，说明F-A的作用可能与抑制肿癌细胞的有丝分裂有关。
F-A对HL-60细胞组织学结构的影响透射电镜检查可见，对照组瘤细胞核大，不规则，核/浆比例大，核仁大，核内多为常染色质，胞体内核蛋白体、内质网和线粒体等清晰可见(见图4A、D、G)，治疗组(10μg·ml-1)瘤细胞胞体小，可见多个坏死的瘤细胞，核小，核/浆比例减少，核浓缩，异染色体较多，而呈团快边集，核仁变小，多数被破坏。细胞器如线粒体变模糊不清。
3、结论
研究表明，化合物F-A的抗癌活性较高，对HL-60细胞24hr的IC50在5-7μg·ml-1之间，72hr的IC50可达1μg·ml-1，研究还发现其对瘤细胞的杀伤作用机制可能与细胞的有丝分裂有关，说明F-A在化学结构及作用原理上有一定新颖性，作为一种新抗癌药，可能有临床价值。
实施例二：
用前述方法对F-B进行研究，也初步证明这种化合物也有类似的抗肿瘤活性。
实施例三：
本研究小组还采用了人鼻咽癌细胞(CNE-2z)进行了深入的研究，证实了这两个化合物也有显著的抗肿瘤活性。
实施例四：
本研究小组委托日本大阪大学药学系采用口腔上皮癌细胞进行研究，也证明了这几个化合物有显著的抗肿瘤活性。
实施例五：
本研究小组进一步研究表明这两个化合物对小鼠移植癌EAC、S180、肝癌等瘤株有一定的抑制作用。
实施例六：
研究初步证明，此两个化合物与影响核酸合成的化疗药物氟尿嘧啶合用或组成新的制剂疗效更佳。
实施例七：
对上述两个化合物进行了其他药理学方面的研究，初步了解到此两个化合物有一定抗炎、抗风湿作用以及免疫抑制作用，在临床上用于治疗各种炎症、风湿病以及各种变态反应性疾病可能有一定的疗效。
药效学研究结果提示：本类化合物可单独或与其他相应药物组成复方制剂，包括胶囊、片剂、注射剂、冲剂等，提供临床用于抗肿瘤、抗炎、抗风湿以及治疗各种变态反应性疾病。