透明质酸钠的制备方法 【技术领域】
本发明涉及从动物组织中提取高分子多糖体的制备方法，更具体地说是从鸡的鸡冠等动物组织中提取高分子多糖体—透明质酸的制备方法。
背景技术
本发明是高纯度医用透明质酸钠的制取法。
透明质酸是存在于鸡冠等动物结缔组织中的一种高分子多糖体，它是从动物结缔组织中萃取精制获得具有良好的保水性和润滑性的透明质酸或透明质酸钠。目前已广泛用作化妆品的主要原料或眼科手术用的粘弹剂、骨科关节的润滑剂，以及妇科、外科手术中的防粘连剂。为了达到适用上述各领域的目的，就需要制取各种不同分子量且是高纯度的透明质酸或透明质酸钠。如分子量太低，就不能获得良好的保水性和润滑性，如纯度低则不能作为医疗领域中的各种辅料。
以往制取的透明质酸或其钠盐虽也从动物结缔组织中萃取精制而成，但其萃取法是将结缔组织的蛋白质采用多种酶促其分解，生产工艺繁琐复杂，而分解所得的质酸或质酸钠往往又采取多次添加卤化烷基吡啶盐，让质酸和吡啶盐呈结合物进行沉淀，然后让沉淀物溶解于食盐水中，使其附加物和质酸进行游离，再添加水溶性的非溶剂，例：添加乙醇等，这样作为质酸的钠盐就从溶液中折出。(USP 4141973.4328803)
上述方法，利用多种酶将共存蛋白质分解，鸡冠中含有的透明质酸酶(作为基质它能分解质酸)，就需加热灭活，天然的质酸具有较高的分子量(一般为150-250万)，为了使分子量不过度下降，且获得高纯度医用的透明质酸或其钠盐，上述方法就显得已不能满足，即在鸡冠结缔组织中，在透明质酸和硫酸软骨素或此外的其它粘多糖在共存状态下萃取，透明质酸中往往混有其它种类的粘多糖，而卤化烷基吡啶盐也能生成透明质酸以外的其它粘多糖类，在将沉淀物溶解于食盐水中时，必然也会将其它粘多糖同时带入该溶液中去，而利用乙醇在析出透明质酸钠的同时往往也会析出其它各类粘多糖。
【发明内容】
本发明目地克服现有技术中存在制得之产品纯度低，且含有其他粗多糖杂质，分子量较低等不足之处。采用鸡冠预处理和一次胰蛋白酶添加酶解法等步骤从而简易便利，符合大量生产要求，且能低成本制得高纯度的透明质酸钠。
本发明采用如下步骤制得透明质酸或透明质酸钠。
1、灭活处理：新鲜或冷冻鸡冠(如冷冻鸡冠则先在室温解冻4小时后在40-80℃，20-40分钟下进行灭活处理，将鸡冠中原有的各类酶进行灭活。
2、清洗预处理：将上述灭活后的鸡冠进行二次绞碎，然后用乙醇、生理盐水清洗预处理，以除去异蛋白和脂肪等。
3、酶解：经清洗预处理的鸡冠加入适量水搅拌成糊状，一次添加胰蛋白酶在35-45℃进行酶解处理。酶解时间为2-8小时。
4、纯化：一次或一次以上添加十六烷基吡啶盐进行提纯。
5、沉淀：将上述提纯物溶于乙醇和生理盐水的解离液中，再用乙醇沉淀获得纯品。
本发明的有益效果：
1、本发明增加鸡冠的灭活处理，将鸡冠中含有的各种酶灭活，使其不参加进一步的酶解，从而提高了最终产品的分子量和纯度以及避免了后续处理的复杂化。
2、采用一次胰蛋白酶的添加酶解法，使其在酶解时更完善。
3、采用十六烷基吡啶盐的方法提纯，即一次沉淀。
4、利用CPC提纯物与乙醇沉淀物对食盐水的解离度不同，依据它的差异用过滤的方法进行分离，能有效去除不纯物，从而获得高纯物。
5、本发明使用的步骤能使产品中的粗多糖及其他杂质呈非溶状态，从而简单的方法将其除去，使整个生产过程变得操作简便。成本也低地制取纯度高的医用产品—透明质酸钠。
【具体实施方式】
下面对本发明进行详细的描述。
1、灭活处理：
取新鲜鸡冠或冷冻鸡冠(-20℃以下)，新鲜鸡冠洗净或冷冻鸡冠常温流水缓慢解冻4-6小时，根据需要可在40-80℃热水中浸渍20-40mim，然后用摇肉机绞碎2次，鸡冠呈3×3mm状。
2、清洗预处理：
将灭活后的鸡冠夥粒浸泡于乙醇和生理盐水的混合液中，该混合液为鸡冠量的2-8倍，最佳为3-5倍，搅拌0.5-1小时后，用水稍洗净，去除异蛋白和脂肪等，滤净取出。
3、酶解：
添加1-3倍量的鸡冠重量的清水，最佳为2倍，让其成糊状，在糊状中一次添加胰蛋白酶，其含量为该酶解液的0.12-0.4％(重量比)，最佳为0.2％，处理条件为35-45℃，酶解时间为2-8小时，最佳为4-6小时，利用该糊状产物经酶解过滤就能获得透明质酸的水溶液。
4、纯化：
将上述水溶液适当添加蒸馏水、食盐和95％乙醇，然后再添加十六烷基吡啶盐，烷基的碳原子为12-18，卤素以氯、溴、碘较为理想，最佳是氯，即以氯代十六烷基吡啶盐(CPC)最为适当。CPC的添加量一般以鸡冠重量的1.0-3.0％为佳，最为理想为1.5-2.0％左右，利用CPC提纯简单方便。
5、沉淀：
利用上述方法制取的沉淀物经过滤，可将该沉淀物溶解于含有乙醇的食盐水中，乙醇的浓度为15-40％，食盐的浓度为0.1M-1M，最佳期为0.2-0.5M，如采用本发明进行沉淀—溶解，实施1或2次以上时，后一次可是0.2-0.5M，该食盐浓度以解离液的重量为基准，解离温度一般是20-60℃，解离时应适当搅拌，冷却至室温，基本溶解，稍有少量沉淀为止，用过滤方法去除少量沉淀物，然后再添加1.5-3.0倍解离液量的95％乙醇，经沉淀过滤精制，应能获得理想的医用透明质酸或其钠盐。
实施例1：
将-20℃冻结保存2个月内的22kg鸡冠在20℃清水中缓慢解冻4小时，然后将该鸡冠在80℃热水中浸渍30mim，利用绞肉机反复二次绞碎成3m/m左右的鸡冠粒，然后将鸡冠夥粒用1.5倍量的95％乙醇、清水和1M NaCl的混合液浸渍洗净(95％乙醇∶H2O＝40∶60)，然后加入2.5倍的清水，配制成80kg鸡冠糊状，加入胰蛋白酶140g(上海兰季科技发展有限公司1∶250)，45℃±2℃，4小时进行酶处理，酶解处理后，在糊状物中边搅拌边添加蒸馏水80L和0.2M NaCl、10％CPC 3600ml，并加热至45℃，产生沉淀物。
将获得的沉淀物过滤后，再次用0.4M NaCl解离液60L进行溶解解离，然后再添加120 L95％乙醇，让其产生沉淀物，将该沉淀物经溶解过滤、除菌、乙醇洗净、真空干燥，获得精粉75.5g。
实施例2
将-20℃冻结保存2个月内的36kg鸡冠在20℃清水中缓慢解冻4小时，然后将该鸡冠在80℃热水中浸渍30mim，利用绞肉机反复二次绞碎成3m/m左右的鸡冠粒，然后将鸡冠夥粒用3倍量的95％乙醇、清水和1M NaCl的混合清洗液进行浸泡洗净，然后再加入2倍的清水，配制成108kg鸡冠糊状，加入胰蛋白酶340g(上海兰季科技发展有限公司1∶250)，45℃±2℃，4小时进行酶处理，酶解处理后，在糊状物中边搅拌边添加蒸馏水120L和0.2M NaCl稀释搅拌，然后再添加10％CPC 5700ml，并加热至45℃，产生沉淀物。
将获得的沉淀物过滤后，再次用0.4M NaCl解离液160L进行解离，然后再添加250L 95％乙醇，让其产生沉淀物，将该沉淀物经溶解过滤、除菌、乙醇洗净、真空干燥，获得精粉130g。
对照例：
将-20℃冻结保存2个月内的22kg鸡冠在20℃清水中缓慢解冻4小时，然后利用绞肉机反复二次绞碎成3m/m左右的鸡冠粒，然后将鸡冠夥粒添加2.5倍量的清水，配制成80kg鸡冠糊状，分别加入胃蛋白酶600g、胰蛋白酶60g进行酶解，然后分别以38℃±2℃胃酶酶解2小时和45℃±2℃胰酶酶解2小时，利用上述实施例1相同的方法进行溶解、过滤、除菌、乙醇洗净、真空干燥，获得精粉68g。
下表是实施例1、2和对照例制取的HA-Na质量和得率的对比状况。 鸡冠量 GA 分子量 蛋白含量 260nm 280nm 精粉重量 得率实施例1 22kg 45.1 280万 0.11 0.19 0.12 78.5g 3.57％实施例2 36kg 47.3 289万 0.10 0.15 0.29 130g 3.61％对照例 22kg 46.0 165万 0.12 0.14 0.36 68g 3.0％
备注：
1、分子量：将样品用生理盐水进行稀释，用乌氏粘度计25℃±0.1进行测定其特性粘度，然后按M＝([η]/0.0361/0.76)计算其分子量。
2、紫外吸收260nm、280nm利用752紫外分光光度计进行测定。