酵母耐热相关基因及其用途 【技术领域】
本发明属于生物技术和工业微生物学。本发明涉及酵母耐热基因及其用途，以及利用这些耐热基因改良的工业菌株和作物品种。
背景技术
随着1996年酿酒酵母基因组测序完成，有关方面科学工作者的研究的注意力很快从基因结构转向基因功能，“基因争夺战”迅速展开。高温酵母是一种耐热真核生物，从基因组学的层面(而不是单个基因的行为)研究其耐热相关基因的整体表达，不仅能获得此类基因自主权、深入了解高温酵母耐热机制，更重要的是通过对酵母抗逆性基因调控本质的认识可为研究高等生物、甚至是人类基因组提供借鉴。另一方面将耐热因用于酵母工程菌的构建，将会解决发酵工业所面临的实际问题。世界上很多热带、亚热带国家或地区包括我国南方省区由于地域环境温度较高，夏季高温季节菌株生产能力低下，很多厂家被迫停产。即使在春秋季节，也要使用制冷设备降低发酵液的温度，极大增加生产运行费用。因此，高温酵母耐热相关基因的克隆不仅具有理论战略意义，而且潜在的商业价值也是重大的。
【发明内容】
本发明的目的在于获得酵母在高温与常温条件下基因表达的差异，再从中找出耐热相关的基因。
本发明包括下列步骤：
总体思路为：分别抽提30度下培养的酵母Y-179和45度下培养的酵母Y-179的总RNA，进行DD-RTPCR，回收差异片段，T-载体连接，转化DH5α，涂布平皿，挑取蓝白斑，扩大培养，抽提质粒，酶切鉴定；northern blot排除假阳性，测序。
具体地包括以下的方案：
一.实验方法：
1、酵母接种和培养：培养基成分葡萄糖2％、蛋白胨2％，酵母抽提物1％，菌种yeastY-179，培养条件30度和45度不同条件下恒温培养48个小时。
2、总RNA的抽提
采用本领域一般技术人员所熟悉的技术。
3.总RNA的处理
用不含RNA酶的DNA酶处理总RNA去除少量基因组DNA，采用本领域一般技术人员所熟悉的方法
4、RNA的鉴定及定量
采用比色法和电泳法鉴定总RNA的质量。
5、cDNA的合成
MgCl2 4μl
10×PCR缓冲液 2μl
dNTP混合液 2μl
RNase抑制物 0.5μl
逆转录酶 1μl
“锚链引物” 4μl
总RNA 1μg
无RNA酶的去离子水 加至20μl
上述成分混匀后，放入PCR仪，逆转录反应条件如下：
42℃ 5分钟
50℃ 50分钟
70℃ 15分钟
4℃ 保存
6、DD-PCR反应体系
10×PCR buffer 1.0μl
MgCl2(25mM) 1.5μl
dNTPs(2.5mM) 2.0μl
5′随机引物 1.75μl
3′TMR标记-锚链引物 0.7μl
RT反应产物 1.0μl
Ex Taq酶 0.1μl
去离子水加至 10μl
7、DD-PCR电泳
8、割胶和胶回收试验
9、差异片断的亚克隆
10.Northern blot
抽提总RNA，制成cDNA探针，与DD-PCR发现的差异条带进行Northern blot。
11.测序采用本领域一般技术人员所熟悉的技术对得到的差异表达序列进行测序。
附图说明：
图1.30℃和45℃生长的酵母PCR mRNA差异展示30℃时生长的酵母，右边的泳道为45℃时生长的酵母。数字表示30℃和45℃酵母差异表达的条带。
图2.逆向Northern blot分析30℃和45℃生长酵母差异展示的mRNA。DDRT-PCR克隆的14cDNA样品点在膜上，与30℃和45℃生长酵母mRNA的Bio-cDNA逆向转录物杂交。(A).(a)：对照基因。表中的数字代表14 cDNA样品及相应位置。
【具体实施方式】
一.实验方法：
1.酵母接种和培养：培养基成分葡萄糖2％、蛋白胨2％，酵母抽提物1％，菌种yeastY-179，培养条件30度和45度不同条件下恒温培养48个小时。
2、总RNA的抽提
根据TRIZOL总RNA抽提试剂的说明书，具体操作如下：
1)取0.1克新鲜的组织，用剪刀剪碎，放入含1ml TRIZOL液的玻璃匀浆器中彻底匀浆。
2)将组织匀浆液吸入50ml离心管，于室温下静置5分钟。
3)加入0.2ml氯仿，剧烈振摇15秒混匀后，室温静置3分钟。
4)4℃10,000g离心15分钟，RNA分布于水相中。
5)将上层无色水相转移到另一离心管中，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟。
6)4℃10,000离心10分钟
7)弃上清，用1m175％乙醇洗涤RNA沉淀，4℃7,500g离心5分钟，室温干燥15分钟。
8)经干燥的沉淀中加入30μl DEPC水溶解沉淀，于-20℃保存备用。
3.总RNA的处理
用不含RNA酶的DNA酶处理总RNA去除少量基因组DNA，具体方法如下：
在一灭菌的Eppendorf管中加入：
10×PCR buffer 5.0μl
50mmol/L MgCl2 1.5μl
RNasin 50u
DNA酶I(RNase-Free) 45u
总RNA 20μg
加DEPC处理过所双蒸水至50μl，混匀，37C℃，30分钟，加DEPC处理过的双蒸水至50μl，加酚/氯仿(3∶1)100μl，4℃，10000g，20分钟，转移上清，加等体积氯仿，4℃，10000g，20分钟，转移上清，加15μl 2mmol/L乙酸钠，250μl无水乙醇，-20℃，1小时，4℃，10000g，20分钟，75％乙醇洗沉淀一次，沉淀溶于20μl DEPC处理过的双蒸水中。
4、RNA的鉴定及定量
采用比色法和电泳法鉴定总RNA的质量
1.比色法：上述RNA溶液经适当稀释(50～100倍)后于260nm和280nm波长处测吸光度(A)，求出A260/A280的值。
2.电泳法：RNA电泳的具体操作过程如下：
a：凝胶的制备：称取琼脂糖1.2克，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液12ml，DEPC处理过的双蒸水37.3ml，加热溶解。待溶液冷却至60℃时加入12.3mol/L的甲醛贮存液10.7ml，10mg/ml的溴乙啶3.0μl，混匀，于室温中静置半小时左右，使凝胶凝固。
b：样品的制备及上样：在一灭菌的Eppendorf管中加入
RNA样品 4.5μl
5×甲醛凝胶电泳缓冲液 2.0μl
甲醛 3.5μl
甲酰胺 10.0μl
上述各成分混匀后于65℃保温15分钟，离心5秒钟使管内液体集中于管底，然后立即置于冰裕中，加2μl灭菌的并经EDPC处理的10×甲醛凝胶上样缓冲液，混匀。将凝胶预电泳5分钟(5V/cm)，然后上样。
c：电泳：在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中以4V/cm的场强电泳。40分钟后于紫外灯下观察电泳结果。
RNA的定量
测出RNA溶液的A260值后，根据下列公式求出其浓度：
RNA溶液的浓度(μg/ml)＝A260×40×稀释倍数
5、cDNA的合成
MgCl2 4μl
10×PCR缓冲液 2μl
dNTP 混合液 2μl
RNase抑制物 0.5μl
逆转录酶 1μl
“锚链引物” 4μl
总RNA 1μg
无RNA酶的去离子水 加至20μl
上述成分混匀后，放入PCR仪，逆转录反应条件如下：
42℃ 5分钟
50℃ 50分钟
70℃ 15分钟
4℃ 保存
6、DD-PCR反应体系
10×PCR buffer 1.0μl
MgCl2(25mM) 1.5μl
dNTPs(2.5mM) 2.0μl
5′随机引物 1.75μl
3′TMR标记-锚链引物 0.7μl
RT反应产物 1.0μl
Ex Taq酶 0.1μl
去离子水加至 10μl
DD-PCR反应条件如下：
1)95℃ 2分钟
2)4个循环
92℃ 15秒
50℃ 30秒
72℃ 2分钟
3)30个循环
92℃ 15秒
60℃ 30秒
72℃ 2分钟
4)72℃ 7分钟
5)4℃ 保存
7、DD-PCR电泳流程
准备工作：
(1)用蒸馏水反复冲洗玻璃板、垫片和梳子。
(2)将无切迹玻璃板的内面用4N NaOH处理，目的是为了提供一个亲水表面让胶能粘在玻璃板上，后用蒸馏水充分漂洗，自然晾干；将有切迹玻璃板的内面用GlassShield硅化，随后用乙醇处理，自然晾干。
(3)将无切迹玻璃板的处理面朝上置于灌胶工作台上，将垫片用蒸馏水浸湿，紧贴于玻板的两侧，将另一块玻板的处理面朝下覆盖在上述玻璃板上。在70ml 5.6％变性HR-1000胶中加入560ml新鲜制备的10％APS和56μl TEMED，水平灌胶，并将梳子的水平一侧插入凝胶内，玻板的两边用夹子固定，使胶充分凝固。
(4)在200μl薄壁管中加入4.0μl DD-PCR产物和1.5μl上样缓冲液，95℃变性2分钟，迅速置于冰内。
(5)上样前，将胶放在扫描仪上预扫描，以减少背景干扰。步骤如下：
1)打开扫描仪和电脑
2)取下夹子，将玻板周围碎胶去除，用蒸馏水冲洗干净，用玻璃清洁剂擦净；将胶放入扫描仪，有切迹的玻璃板朝外，关上扫描仪门。
3)双击Acquire SC图标，打开Scanner菜单，单击“Initialize”打开扫描灯，当“Ready”出现在屏幕左下角并且灯泡图标变亮时，单击“Setup”，调整扫描设置，单击″Browse”，设置正确盘符路径，然后单击“OK”。在Scanner菜单中点击“Initialize Flat Field”，开始扫描。
DD-PCR电泳及图像处理：
(1)梳子齿面向下插入凝胶1～2毫米，将胶板垂直置于Genomyx LR电泳系统中，加入上、下槽缓冲液并清洗样品孔去除碎胶，上样，电泳，条件如下：
电压 3000V
功率 100W
时间 5小时
(2)电泳结束后，把玻璃板用水充分冲洗，然后然后用玻璃清洁剂擦洗，晾干；把胶放入扫描仪中，关上扫描仪的门。
(3)打开Acquire SC程序并启动扫描仪，开始正式扫描，设置好文件名，单击“0K”，整块胶的扫描大约花费1小时，扫描结束后，电脑对扫描的图像进行处理。在Photoshop 5.0中找到并打开目标文件。打开“Adjust”菜单，使用“Invert”工具对图像进行转换，调节图像的亮度和对比度。
差异条带的定位：
1)打开胶图像和“Virtual Grid”这两个图像文件，将这两个图像并排摆在屏幕上，调节这两个图像使它们具有相同的大小。
2)选择Virtual Grid图像，打开“Select”菜单，单击“All”然后再打开“Edit”菜单，单击“Copy”。
3)选择胶图像，然后打开“Edit”菜单，单击“Paste”，这样Virtual Grid图像就覆盖在胶图像上，打开“Windows”菜单，单击“Show Layer”，调节“Opacity”由100％至25％，这样胶图像上就会出现方格，使方格图像上的1A和19H与凝胶图像上的两个圆圈型标志对齐，将差异条带准确地定位于相应的塑料方格板上。
割胶：
将胶从扫描仪取下，移走有切迹的玻璃板，干胶15分钟，用蒸馏水冲洗，再干胶5分钟。将方格板与胶板重叠置于割胶工作台上，注意方向及位置。用清洁刀片将对应于方格板上的差异片断割下，浸泡于50μl去离子水中，37℃温育1小时。切割完毕后将玻璃板放入扫描仪重新扫描，检测割胶的准确性。
割胶条带的再扩增：
10×buffer 2.5μl
dNTP 2μl
MgCl2 2.5μl
引物1 2μl
引物2 2μl
Taq酶 0.125μl
H2O 11.875μl
模板 2μl
总体积 25μl
反应条件：1)95℃ 2分钟
2)4cycles
92℃ 15秒
50℃ 30秒
72℃ 2分钟
3)25cycles
92℃ 15秒
60℃ 30秒
72℃ 2分钟
4)72℃ 7分钟
反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出特异条带。
8、割胶和胶回收试验
(1)紫外灯下，用干净的刀片将条带切割下来，放入1.5ml的Eppendorf管中。
(2)每100mg琼脂糖加入300μl S1液的比例加入S1液，置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化。每2分钟颠倒混匀一次。(若琼脂糖重量小于100mg，用双蒸水补充至100mg，以确保体系总体积不至太小。)
(3)入1/3 S1液体积的异丙醇，混匀。55℃温浴1分钟
(4)溶化后的Agarose液移入吸附柱，再将吸附柱放入同一个收集管中
(5)在吸附柱中加入450μl W1液，静置1分钟后，高速离心30秒。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
(6)在吸附柱加入450μl W1液，高速离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管。
(7)高速离心1分钟。
(8)将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30μlT1液，37℃静置5分钟后，高速离心1分钟。将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。
9、差异片断的亚克隆
(1)连接反应；
Insert DNA 4μl
PMD 18-T Vector 1μl
Solution I 5μl
加去离子水至 10μl
2)16℃反应1小时。
(2)转化
1)感受态细菌的制备
A：用无菌铂丝蘸取-70℃冻存的E.coli(DH52)，在LB平板上划线接种。然后将平板置于37℃保温16小时。
B：用无菌牙签挑取单菌落(约3mm)置于5ml LB培养基中，37℃振摇(200rpm)16小时。
C：取1ml上述培养液接种到一含有50ml LB培养基的烧瓶中，37℃振摇培养3小时，测A600，待其值达到0.3~0.4时将烧瓶取出，立即置冰浴10分钟。
D：在无菌条件下将细菌转移到一消毒过的预冷的50ml离心管。
E：4℃4000rpm离心10分钟，弃去上培养液，将离心管倒立于滤纸上1分钟使培养液流尽。
F：向离心管中加入10ml预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，重悬沉淀的菌体，置冰浴30分钟。
G：4℃4000rpm离心10分钟，弃去上清液，将离心管倒立于滤纸上1分钟。
H：加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，轻轻重悬菌体。
I：将上述菌体置于4℃冰箱中12～24小时，然后分装保存于15％的甘油中(-70℃)备用。
2)质粒的转化
转化过程的操作如下：连接产物5μl+感受态细菌200μl，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，加入800μl不含氨苄青霉素的LB培养基，混匀37℃振摇90分钟(120rpm)，将菌液接种于含有10μg/ml氨苄青霉素，及IPTG/X-Gal的LB培养板上培养板于37℃正放30分钟，37℃倒放20小时，挑取白色菌斑，接种于5ml含有，10μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇(120rpm)。
(3)质粒的抽提
采用柱离心式质粒抽提试剂盒从上述细菌培养液中抽取质粒，操作如下：采用柱离心式质粒抽提试剂盒从上述细菌培养液中抽取质粒，操作如下：细菌培养液于13000rpm离心2分钟，弃上清沉淀悬浮于150μl B1缓冲液中，剧烈振摇加入150μl B2缓冲液，温和颠倒5次，加入210μl B3缓冲液，立即温和颠倒5次，13000rpm离心10分钟，上清转移到吸附柱内，静置1分钟，13000rpm离心30秒弃液体，加入450μl P1缓冲液，13000rpm离心30秒，弃液体，加入450μl W1洗涤液，13000rpm离心30秒，弃液体再离心1分钟，弃液体以30μl双蒸水洗脱，洗脱液保存于-20℃备用。
9.Northern blot
按方法中2的方法再次抽提总RNA，用AtlasTMSpotLightTMLabeling Kit(clontech)制成cDNA探针，与DD-PCR发现的14条差异条带进行Northern blot(Nonrad-GEArayTMDetection KIT，Supperarray)
10.测序
氨基酸序列表
采用本方法发现了14条克鲁维酵母在高温和低温下差异表达的基因。其中两条为特异性的表达序列。
<110>上海大学
<120>CD374838序列
<160>3
<170>PatentIn Version 3.1
<210>1
<211>769
<212>DNA
<213>马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)
<220>
<221>
<222>
<223>n＝a或g或c或t
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga cgattagcgg ataacaattt cacacaggag 60
accattgcat aggggaatat atctatccaa gaggtcctac ggccaatcat taattaaaga 120
tattaccacc ggaggtagta gagtcaaggt tcaaccacac gaaccactgc gtgagtatag 180
ttacgaggac gtcgatttag atgccttgaa gaaggctaat gcagttcgcc aaagcatgga 240
attcgtggta aatctccgag atttacaaaa tttgatgagc attatggttt tcattactga 300
taaggtcgaa aaatttgtat atggtacggc agggctcaag aacgaacaga tttcaaccat 360
ggtgttcctt tcagggtttt tctttttaat atcattatgg gttatagcac cgttcataaa 420
ttgggcatta atgaccagca tgctggcatg gggagtcatg tttgtgctac atccaagagt 480
gagaccagta ttattaggac tcttaaaaaa gcagcagttg gaaaagggca aagaggttct 540
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agtgtttgaa attcaaatac aaggaatcac tgaaacagaa tggtcacatt atatgtatgc 660
gacacatgta ttcgacaaaa gtgatctata tcgnaaatct caaaagccac caccaggcgt 720
tcaaacnttt gaagaattaa acccccccaa cttgggtttt ttgatcgna 769
<110>上海大学
<120>CD374839序列
<160>3
<170>PatentIn Version 3.1
<210>1
<211>375
<212>DNA
<213>马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)
<220>
<221>
<222>
<223>n＝a或g或c或t
gggccccccc tcgaggtcga caccagcagg acggggcggc cgtccagtgc ggctgcgatg 60
ttgcgggcac caccgtggtg ggtggcgtat gcctcttcgg gatgcgactc gcaccaagtg 120
atgtcggagg ggccgtgcac ggccacgacg gcatcgggct cgacggcatc catcaaggca 180
gccacctgcg ggcccgaggt gacatcgacc tgcttccagc gcacacctcg gctctcgggg 240
aggactgggg cacgccggga gctgagcact gtctcggcgc cgagccgggt gaggcgggcg 300
gcgatgtgcc cggcaaggta gccggaaccg aggatcagga tgcggccagn nnnnnnnnnn 360
nncncnnnnn nnnnc
375