一种反蛋白石结构酶氧化硅杂化生物催化剂的制备方法.pdf

本发明是一种反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂的制备方法，包括以下步骤：（1）将酶和牛血清白蛋白溶于磷酸缓冲溶液中；（2）将酶溶液浸泡聚苯乙烯模板再用戊二醛溶液交联反应；（3）再浸入正硅酸甲酯水解液；（4）用乙酸乙酯溶解模板2-4h，得到反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂。本发明所得的固定化酶对高温有很好的耐受性。在50oC高温下浸泡120min后，仍能保持初始酶活的95%。

1.  一种反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂的制备方法，其特征为包括以下步骤：
（1）酶溶液的配制：将酶和牛血清白蛋白溶于磷酸缓冲溶液（PBS）中；其配比为每20mL缓冲溶液中加0.1g~0.5g酶和0.1g~0.5g牛血清白蛋白；所述的酶为氧化还原酶或水解酶；
（2）酶液的填充及交联：将聚苯乙烯模板放在密闭的舒伦克瓶中抽真空1h后，用注射器注入上步得到的酶溶液，在该真空状态下浸泡20~24h；之后将多余的酶液吸出，之后洗涤模板表面，真空下再注入质量分数0.5%~5%的戊二醛溶液，4^oC交联反应2~4h，得到含有酶的聚苯乙烯模板；其中，物料配比为每0.5g模板加酶液5mL，体积比酶溶液：戊二醛=1：1；
（3）氧化硅保护层的形成：将上述含有酶的聚苯乙烯模板放在舒伦克瓶中，抽真空1h后再注入100mmol/L的正硅酸甲酯水解液（氧化硅的前驱体，水解形成氧化硅），在该真空状态下浸泡1~2h，得到含有酶的并且在酶周围形成氧化硅保护层的聚苯乙烯；其中，物料配比为每0.5g含有酶的聚苯乙烯模板：5mL正硅酸甲酯水解液；
（4）去除模板：将上步得到的含有酶的并且在酶周围形成氧化硅保护层的聚苯乙烯放入锥形瓶中，加入乙酸乙酯，磁力搅拌下乙酸乙酯溶解模板2~4h；其中，物料配比为每0.5g聚苯乙烯加乙酸乙酯20~30mL，最后得到反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂。

2.  如权利要求1所述的反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂的制备方法，其特征为所述的酶具体为辣根过氧化物酶、脂肪酶或青霉素酰化酶。

3.  如权利要求1所述的反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂的制备方法，其特征为所述的磷酸缓冲溶液的配制：分别配制0.05mol/L的Na₂HPO₄溶液和0.05mol/L的NaH₂PO₄溶液；按照体积比Na₂HPO₄/NaH₂PO₄为2：1的比例混合两种溶液，即可得到磷酸缓冲溶液(PBS)。

一种反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂的制备方法
技术领域
本发明属于固定化酶领域，特别是提出了采用胶体晶体为模板、氧化硅作为保护层来制备反蛋白石结构的酶-氧化硅杂化生物催化剂的方法。
背景技术
酶由于其反应条件温和、来源广泛、无污染、催化效率高、催化专一等优点受到了人们青睐。但是游离酶稳定性差、难回收利用、易失活的缺点限制了其广泛应用。为了解决这项难题，固定化酶的理念应运而生，它克服了游离酶难以分离回收的缺点，酶被固定化后经过简单的离心等操作即可分离出来，可实现多次重复使用；它还可以提高酶的热稳定性和对酸碱环境的耐受性，避免某些操作步骤对酶活造成影响；相对于游离酶来讲，固定化酶的储藏稳定性也大大提高，不易被蛋白酶水解影响催化功能。总之，固定化酶的出现使生物酶在工业上的自动化生产和连续控制成为可能，同时在理论方面也为酶促反应机理及动力学的研究提供了良好的模型。
交联酶聚集体(CLEAs)克服了其他固定化方法操作复杂、费用昂贵、活性低的缺点，成为最常用的固定化酶方法之一。对于小分子底物，CLEAs展现出较好的催化性能，但是由于其孔隙率小，不利于大分子底物的传质，所以不适合催化大分子底物的酶促反应。为了解决大分子底物的传质问题，我们提出了采用胶体晶体为模板来制备反蛋白石结构固定化酶(即三维有序大孔CLEAs)的思想：采用胶体晶体聚苯乙烯(是指具有单一孔径尺寸且高度单分散的孔球，在三维空间内有序排列、孔球与孔球之间通过孔窗相互连接、孔径大于50nm)做模板，将酶填充进去并交联，去除模板后便能得到反蛋白石结构。调控模板的孔径和孔隙率，就能得到不同孔径尺寸的CLEAs，这对于大分子底物催化反应十分有利，能够大幅度的提高酶促反应速率。
反蛋白石结构(三维有序大孔CLEAs)具有较大的孔隙率，与传统的交联酶聚集体相比，反应速率确实提高许多。但是由于其孔隙的存在，会降低其机械强度和稳定性。为了在固定化酶有序大孔结构的基础上增加其机械强度，本专利提出了硅化的思想，即在反蛋白石表面形成一层氧化硅保护层，得到酶-氧化硅杂化的生物催化剂。氧化硅骨架的存在能够更好的支撑大孔结构，在外力的作用下固定化酶不易发生结构上的形变，这样在反应中利于保持三维有序的大孔结构，同时也能保留其原有的传质优势。这样，所制备的固定化酶机械性和稳定性大大提高，在应用时具备更好的潜力。
关于制备多孔CLEAs的文献报道包括：文献1：Bioresourcetechnology,2011,102,3541-3545将玉米淀粉溶液与酶溶液混合，随后加入沉淀剂制备其共沉物，再使用戊二醛共价交联酶聚集体，淀粉由于不具有交联氨基不被交联，最后使用淀粉酶将淀粉去除来获得具有大孔的CLEAs。通过这种技术获得的木瓜蛋白酶大孔CLEAs实现了减小CLEAs内部物质传递抑制的目标，增加了其对牛血清白蛋白和卵清蛋白等大分子底物的催化能力。文献2：CatalysisScience&Technology,2012,2,1575-1579和文献3：Bioresourcetechnology,2012,119, 28-34也使用淀粉作为致孔剂分别制备了酿酒酵母转化酶大孔CLEAs和漆酶大孔CLEAs，研究其催化特性后，发现其在大分子底物催化和降低扩散抑制方面有着突出表现。文献4：RSCAdvances,2014,4,11802-11810通过共沉淀方法将牛血清白蛋白或过氧化物酶捕捉进CaCO₃颗粒中，使用二硫苏糖醇作交联剂，去除CaCO₃模板之后就得到多孔球形牛血清白蛋白颗粒和杂化酶颗粒。通过调节CaCl₂和Na₂CO₃的浓度和沉淀时转速可以控制颗粒的大小，调节二硫苏糖醇的浓度可以控制颗粒的孔隙率。以上相关文献所述制备多孔CLEAs技术，虽然能得到多孔CLEAs，但是得到的孔径尺寸不单一，且孔结构都是无序存在的。调节各种制备条件只能控制其孔径大小，却无法保证其孔径的有序单一。而本发明提出的利用胶体晶体为模板制备反蛋白石结构固定化酶的方法，可以制备出孔径尺寸单一且孔分布有序的CLEAs，这在催化大分子底物反应时，更利于底物与酶分子的接触，加速了催化反应。目前还没有看到利用聚苯乙烯胶体晶体为模板来制备反蛋白石结构固定化酶并将其与氧化硅杂化的报道，可见本专利有一定的创新性。
发明内容
本发明的目的为针对当前技术的不足，提供一种反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂的制备方法，该方法在传统的多孔型交联酶聚集体的基础上，实现了酶与氧化硅的杂化，氧化硅的存在增加了多孔型交联酶聚集体的机械稳定性和使用稳定性，赋予其在工业应用中更好的潜力。此外，所制备的固定化酶还保留了反蛋白石三维有序大孔的特点，这种大孔结构更有利于物质从各个方向进入孔内，降低物质传质阻力，为物质的扩散提供了更高的流速和效率。具体体现在：1在真空状态下向模板中填充酶与牛血清白蛋白(BSA)的混合物，这样有利于酶液的充分、快速填充。2选择乙酸乙酯作为模板去除剂，既能将模板快速的去除干净，又不会对酶活造成较大损害；3酶表面覆盖的氧化硅保护层确保了固定化酶的机械强度；4目前没有报道写到制备出了反蛋白石结构的CLEAs，已有的关于多孔CLEAs的报道都是孔径大小不一、孔径位置在空间不规则排序的。本发明是首次提出这种思想。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：
一种反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)酶溶液的配制：将酶和牛血清白蛋白溶于磷酸缓冲溶液(PBS)中；其配比为每20mL缓冲溶液中加0.1g～0.5g酶和0.1g～0.5g牛血清白蛋白；所述的酶为氧化还原酶或水解酶；
(2)酶液的填充及交联：将聚苯乙烯模板放在密闭的舒伦克瓶中抽真空1h后，用注射器注入上步得到的酶溶液，在该真空状态下浸泡20～24h；之后将多余的酶液吸出，之后洗涤模板表面，真空下再注入质量分数0.5％～5％的戊二醛溶液，4℃交联反应2～4h，得到含有酶的聚苯乙烯模板；其中，物料配比为每0.5g模板加酶液5mL，体积比酶溶液：戊二醛＝1：1；
(3)氧化硅保护层的形成：将上述含有酶的聚苯乙烯模板放在舒伦克瓶中，抽真空1h后再注入100mmol/L的正硅酸甲酯水解液(氧化硅的前驱体，水解形成氧化硅)，真空状态下浸泡1-2h，得到含有酶的并且在酶周围形成氧化硅保护层的聚苯乙烯；其中，物料配比为每0.5g含有酶的聚苯乙烯模板：5mL正硅酸甲酯水解液；
(4)去除模板：将上步得到的含有酶的并且在酶周围形成氧化硅保护层的聚苯乙烯放入 锥形瓶中，加入乙酸乙酯，磁力搅拌下乙酸乙酯溶解模板2-4h；其中，物料配比为每0.5g聚苯乙烯加乙酸乙酯20～30mL，最后得到反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂。
所述的酶具体为辣根过氧化物酶、脂肪酶或青霉素酰化酶。
所述的磷酸缓冲溶液的配制：分别配制0.05mol/L的Na₂HPO₄溶液和0.05mol/L的NaH₂PO₄溶液；按照体积比Na₂HPO₄/NaH₂PO₄为2：1的比例混合两种溶液，即可得到实验中使用的磷酸缓冲溶液(PBS)。
本发明的有益效果是：
1.本发明制备固定化酶的方法，操作简单，推广性强，适用于大多数酶(其中已验证了此方案对辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶、青霉素酰化酶PGA、脂肪酶Lipase的可行性)。
2.本发明所得固定化酶大小分布均匀，孔径在100nm左右(见附图3)，这样能在极大的程度增加传质效率。而其他方法制备的交联酶聚集体孔径大小不固定且不均一，不利于传质。本发明所得固定化酶光泽性好，在自然条件下就会泛出蓝绿色(见附图2)，说明发生了布拉格衍射，间接证明内部大孔结构有序。
3.本发明所得的固定化酶对高温很好的耐受性。在50℃高温下浸泡120min后，仍能保持初始酶活的95％，而游离酶在50℃高温下浸泡120min后，活性变为初始活性的55％。
4.本发明得到的固定化酶传质速率为0.67mM/min，而传统方法制备的交联酶聚集体传质速率为0.50mM/min，可见本发明制备的固定化酶所具有的有序大孔结构促进了传质，加快了反应。
5.本发明得到的固定化酶机械稳定性强，在摇床上震荡十天以后活性仍然能保持在初始酶活的95％以上；重复使用十次仍能保持初始活性的90％以上。
6.本发明反应主要涉及水相，安全无污染。
附图说明
图1为反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂流程图；
图2为实施例1中辣根过氧化物酶反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂光学照片，由照片可以看出所制备的固定化酶在自然条件下就会泛出蓝绿色，说明其内部发生了布拉格衍射，间接证明固定化酶的内部大孔结构有序排列；
图3为实施例1中辣根过氧化物酶反蛋白石结构酶-氧化硅杂化生物催化剂电镜照片，其中图3(a)为放大50000倍后的电镜照片；图3(b)为放大20000倍后的电镜照片，由图中可以看出得到的固定化酶孔径在100nm左右，且孔径尺寸大小均一，孔与孔之间的连通性较好，进一步说明了制备的固定化酶符合三维有序大孔的要求，利于反应过程的传质。
具体实施方式
本发明所用的辣根过氧化物酶购自于上海源叶生物科技有限公司。
本发明所用的牛血清白蛋白购自与北京鼎国生物技术有限责任公司。
本发明所用的戊二醛购自于天津市福晨化学试剂厂。
本发明所用的乙酸乙酯购自于天津市福晨化学试剂厂。
本发明所述磷酸盐缓冲溶液：0.05mol/LNa₂HPO₄/L的和0.05mol/LNaH₂PO₄溶液按照体积比2:1混合而成；
本发明所用的电子天平购自于上海精科天平厂。
本发明所用的无菌注射器购自于上海精密科学仪器有限公司。
本发明所用的循环水式真空泵购自于上海米沙瓦医科工业有限公司。
实例1：
将0.5g聚苯乙烯模板置于舒伦克瓶中，使用循环水式真空泵抽真空1h将模板缝隙中的空气抽尽，随后注入5mL酶液(采用磷酸缓冲溶液(PBS)为溶剂，所得到的酶液中含辣根过氧化物酶5mg/mL，牛血清白蛋白25mg/mL)，保持真空状态浸泡24h。吸出多余的酶液，并用蒸馏水洗涤5次模板来去除表面附着的酶和蛋白。然后再将上述0.5g填充有酶的聚苯乙烯模板置于干净的舒伦克瓶中，真空泵抽真空1h后(压力为低于大气压0.1MPa，以下步骤及实施案例抽真空处理压力同)，注入5mL质量分数2.0％的戊二醛溶液，4℃下交联反应4h后，将未参与反应的戊二醛吸出并用蒸馏水洗涤5次以去除表面附着的戊二醛。之后将上述0.5g经交联的聚苯乙烯模板放入干净的舒伦克瓶中，抽真空1h后注入5mL100mmol/L的正硅酸甲酯的水解液(氧化硅的前驱体，水解形成氧化硅)，在该真空状态下浸泡2h后将多余的水解液吸出，将上述0.5g聚苯乙烯模板放入锥形瓶中，在磁力搅拌下用20mL乙酸乙酯浸泡4h以去除模板。模板去除后，即得到反蛋白结构的辣根过氧化物酶-氧化硅杂化的生物催化剂，将其置于4℃下保存备用。制备的反蛋白石结构的生物催化剂光学照片如图2所示，材料表面色彩斑斓的光泽是由于有序结构的布拉格衍射造成的，这也间接说明制备的反蛋白石生物催化剂具有良好的三维有序大孔结构。将制备的反蛋白石结构的辣根过氧化物酶-氧化硅杂化催化剂经冷冻干燥后进行电镜表征(附图3)，可以看到它的大孔结构约为100nm，孔结构在三维空间有序排列，孔与孔之间的连通性较好，且孔径大小均一，利于底物从各个方向进入酶的内部与之进行反应。
将其应用于苯酚的去除反应中(苯酚去除率的测定方法：配制83.4mmol/L的铁氰化钾溶液和20.8mmol/L的4-氨基安替比林溶液，测定反应体系中苯酚含量时，量取50μL反应液，加入到750μLpH7.0的磷酸缓冲溶液中，再加入100μL铁氰化钾溶液和100μL4-氨基安替比林溶液，混合均匀后，显色10-15min后，利用紫外分光光度计505nm下测定OD值。参比溶液为800μLpH7.0的磷酸缓冲溶液和100μL铁氰化钾溶液和100μL4-氨基安替比林溶液，显色10-15min后作为空白对照。OD值通过苯酚标准曲线折合成为苯酚含量。
苯酚去除率的计算公式如下：
苯酚去除率(％)＝(C₀-C_f)/C₀*100
C₀和C_f分别为苯酚初浓度和去除后浓度。)，通过分光光度计测量反应前后苯酚的含量，可知苯酚去除率可达36.4％，重复使用十次之后活性保持初始活性的92％。
实例2：
将0.5g聚苯乙烯模板置于舒伦克瓶中，使用循环水式真空泵抽真空1h将模板缝隙中的空气抽尽，随后注入5mL酶液(辣根过氧化物酶5mg/mL，牛血清白蛋白25mg/mL，均采 用磷酸缓冲溶液(PBS)作为溶剂)，保持真空状态填充24h。吸出多余的酶液，并用蒸馏水洗涤5次模板来去除表面附着的酶和蛋白。然后再将上述0.5g填充有酶的聚苯乙烯模板置于舒伦克瓶中，真空泵抽真空1h后，注入5mL质量分数1.5％的戊二醛溶液，4℃下交联反应4h后，将未参与反应的戊二醛吸出并用蒸馏水洗涤5次以去除表面附着的戊二醛。之后将上述0.5g经交联的聚苯乙烯模板放于舒伦克瓶中，抽真空1h后注入5mL100mmol/L的正硅酸甲酯的水解液，在该真空状态下浸泡2h后将多余的水解液吸出，将上述0.5g聚苯乙烯模板放入锥形瓶中，在磁力搅拌下用20mL乙酸乙酯浸泡4h以去除模板。模板去除后，即得到反蛋白结构的辣根过氧化物酶-氧化硅杂化的生物催化剂，4℃下保存备用。制备的反蛋白石结构的生物催化剂光学照片及反蛋白石结构的辣根过氧化物酶-氧化硅杂化催化剂经冷冻干燥后进行电镜表征效果同实施例1。将其应用于苯酚的去除反应中，通过分光光度计测量反应前后苯酚的含量，苯酚去除率可达62.3％，重复使用十次之后活性保持初始活性的94％。
实例3：
将0.5g聚苯乙烯模板置于舒伦克瓶中，使用循环水式真空泵抽真空1h将模板缝隙中的空气抽尽，随后注入5mL酶液(辣根过氧化物酶5mg/mL，牛血清白蛋白25mg/mL，磷酸缓冲溶液(PBS)为溶剂)，保持真空状态填充24h。吸出多余的酶液，并用蒸馏水洗涤5次模板来去除表面附着的酶和蛋白。然后再将上述0.5g填充有酶的聚苯乙烯模板置于舒伦克瓶中，真空泵抽真空1h后，注入5mL质量分数为1.0％的戊二醛溶液，4℃下交联反应4h后，将未参与反应的戊二醛吸出并用蒸馏水洗涤5次以去除表面附着的戊二醛。之后将上述0.5g经交联的聚苯乙烯模板放于舒伦克瓶中，抽真空1h后注入5mL100mmol/L的正硅酸甲酯的水解液，在该真空状态下浸泡2h后将多余的水解液吸出，将上述0.5g聚苯乙烯模板放在锥形瓶中，在磁力搅拌下用20mL乙酸乙酯浸泡4h以去除模板。模板去除后，即得到反蛋白结构的辣根过氧化物酶-氧化硅杂化的生物催化剂，4℃下保存备用。制备的反蛋白石结构的生物催化剂光学照片及反蛋白石结构的辣根过氧化物酶-氧化硅杂化催化剂经冷冻干燥后进行电镜表征效果同实施例1。将其应用于苯酚的去除反应中，通过分光光度计测量反应前后苯酚的含量，可知苯酚去除率可达70.0％，重复使用十次之后活性保持初始活性的95％。
实例4：
将0.5g聚苯乙烯模板置于舒伦克瓶中，使用循环水式真空泵抽真空1h将模板缝隙中的空气抽尽，随后注入5mL酶液(辣根过氧化物酶5mg/mL，牛血清白蛋白25mg/mL，磷酸缓冲溶液(PBS)为溶剂)，保持真空状态填充24h。吸出多余的酶液，并用蒸馏水洗涤5次模板来去除表面附着的酶和蛋白。然后再将上述0.5g填充有酶的聚苯乙烯模板置于舒伦克瓶中，真空泵抽真空1h后，注入5mL质量分数0.5％的戊二醛溶液，4℃下交联反应4h后，将未参与反应的戊二醛吸出并用蒸馏水洗涤5次以去除表面附着的戊二醛。之后将上述0.5g经交联的聚苯乙烯模板放于舒伦克瓶中，抽真空1h后注入5mL100mmol/L的正硅酸甲酯的水解液，在该真空状态下浸泡2h后将多余的水解液吸出，将上述0.5g聚苯乙烯模板放入锥形瓶中，在磁力搅拌下用20mL乙酸乙酯浸泡4h以去除模板。模板去除后，即得到反蛋白结构的辣根过氧化物酶-氧化硅杂化的生物催化剂，4℃下保存备用。制备的反蛋白石结构的生物催化剂光学照片及辣根过氧化物酶-氧化硅杂化催化剂经冷冻干燥后进行电镜表征效果同实施例1。 将其应用于苯酚的去除反应中，通过分光光度计测量反应前后苯酚的含量，可知苯酚去除率可达50.4％，重复使用十次之后活性保持初始活性的90％。
实例5：
将0.5g聚苯乙烯模板置于舒伦克瓶中，使用循环水式真空泵抽真空1h将模板缝隙中的空气抽尽，随后注入5mL酶液(脂肪酶20mg/mL，牛血清白蛋白25mg/mL，磷酸缓冲溶液(PBS)为溶剂)，保持真空状态填充24h。吸出多余的酶液，并用蒸馏水洗涤5次模板来去除表面附着的酶和蛋白。然后再将上述0.5g填充有酶的聚苯乙烯模板置于舒伦克瓶中，真空泵抽真空1h后，注入5mL质量分数0.5％的戊二醛溶液，4℃下交联反应4h后，将未参与反应的戊二醛吸出并用蒸馏水洗涤5次以去除表面附着的戊二醛。之后将上述0.5g经交联的聚苯乙烯模板的舒伦克瓶中，抽真空1h后注入5mL100mmol/L的正硅酸甲酯的水解液，在该真空状态下浸泡2h后将多余的水解液吸出，将上述0.5g聚苯乙烯模板放入锥形瓶中，在磁力搅拌下用20mL乙酸乙酯浸泡4h以去除模板。模板去除后，即得到反蛋白结构的脂肪酶-氧化硅杂化的生物催化剂，4℃下保存备用。制备的反蛋白石结构的生物催化剂光学照片及反蛋白石结构的脂肪酶-氧化硅杂化催化剂经冷冻干燥后进行电镜表征效果同实施例1。用对硝基苯基棕榈酸酯来检测其水解活性(所得脂肪酶活性测定：取100μL5mg/mL的4-硝基苯基棕榈酸酯(p-NPP)，加入到5mL所得脂肪酶悬浮液中，室温条件下反应1min后，取2mL反应液与2mL0.25mol/LNa₂CO₃混合终止反应，10000r/min离心5min，取上清液在可见分光光度计410nm下测定OD值。根据OD值，通过标准曲线可知对硝基苯酚的含量，酶活定义为：在检测条件下，每分钟释放1μmol对硝基苯酚所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。)通过分光光度计测量产物的含量，可知酶活为600U/g酶蛋白。
实例6：
将0.5g聚苯乙烯模板置于舒伦克瓶中，使用循环水式真空泵抽真空1h将模板缝隙中的空气抽尽，随后注入5mL酶液(青霉素酰化酶10mg/mL，牛血清白蛋白25mg/mL，磷酸缓冲溶液(PBS)为溶剂)，保持真空状态填充24h。吸出多余的酶液，并用蒸馏水洗涤5次模板来去除表面附着的酶和蛋白。然后再将上述0.5g填充有酶的聚苯乙烯模板置于舒伦克瓶中，真空泵抽真空1h后，注入5mL质量分数0.5％的戊二醛溶液，4℃下交联反应4h后，将未参与反应的戊二醛吸出并用蒸馏水洗涤5次以去除表面附着的戊二醛。之后将上述0.5g经交联的聚苯乙烯模板的舒伦克瓶中，抽真空1h后注入5mL100mmol/L的正硅酸甲酯的水解液，在该真空状态下浸泡2h后将多余的水解液吸出，将上述0.5g聚苯乙烯模板放入锥形瓶中，在磁力搅拌下用20mL乙酸乙酯浸泡4h以去除模板。模板去除后，即得到反蛋白结构的青霉素酰化酶-氧化硅杂化的生物催化剂，4℃下保存备用。制备的反蛋白石结构的生物催化剂光学照片及反蛋白石结构的青霉素酰化酶-氧化硅杂化催化剂经冷冻干燥后进行电镜表征，效果同实施例1。用其催化青霉素G分解反应(所得催化剂活性测定方法：取一定质量的所得催化剂置于1mLpH7.0的PBS中，在37℃水浴锅中预热5min后，加入1mL4％(质量分数)的青霉素G钾盐溶液，磁搅反应3min后，取出1mL反应液与3mLpH2.5的醋酸缓冲液、1mL0.25％的(质量分数)PDAB溶液避光显色10min，单层滤膜过滤后，用紫外分光光度计415nm下测其OD值。根据OD值对比产物的标准曲线，可知产物生成量。绝对酶活定义： 在上述反应条件下，每1min催化生成1μmol产物所需催化剂的质量定义为1U。)通过分光光度计测量产物的生成量，可知活性为400U/g酶蛋白。
本发明未尽事宜为公知技术。