一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法.pdf

本发明公开了一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法，包括河川沙塘鳢基因组DNA的提取、DNA片段扩增、PCR产物的电泳及微卫星位点带型分析等步骤。检测样本仅在靠近标准图谱259bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为是闽江河川沙塘鳢种群；检测样本仅在靠近标准图谱263bp、265bp位置扩增出1条或2条特异性条带，则鉴定为是其他流域野生河川沙塘鳢种群。本发明操作简单快捷和准确，可以用于对闽江流域河川沙塘鳢种群的鉴定，从而对该流域的河川沙塘鳢种群的种质资源保护具有重要意义。

权利要求书
1.  一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法，其特征在于包括以下步 骤：
1)DNA提取：采用基因组DNA提取试剂盒提取河川沙塘鳢基因组DNA，并测定其纯度 和浓度，取A260/A280值为1.6～1.9，浓度为200～2000ng/μL的基因组DNA进行扩增；
2)DNA片段扩增：采用聚合酶链式(PCR)反应扩增DNA片段，PCR反应的1对引物 序列为：
正向引物：5′-TRAMA-TTTATGGGTTCAGAAATGGG-3′，
反向引物：5′-CAGTCACAAAGCAAGGCAC-3′；
3)PCR产物的电泳和微卫星带型分型：用ABI3500xl毛细管电泳进行基因分型检测；
4)与DL2000Marker标准图谱进行对比：与标准图谱对比，读出待测样本的目的条带所 处的位置，如检测样本仅在靠近标准图谱259bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定 为是闽江河川沙塘鳢种群；检测样本仅在靠近标准图谱263bp、265bp位置扩增出1条或2条 特异性条带，则鉴定为是其他流域野生河川沙塘鳢种群。

2.  根据权利要求1所述的一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢的微卫星标记方法，其特征 在于：步骤2)中所述的PCR反应的程序为：94℃预变性5min，30个cycles，其中每个循环 包括94℃变性30sec，51℃退火35sec，72℃延伸50sec，最后72℃延伸5min，4℃保存。

3.  根据权利要求1所述的一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢的微卫星标记方法，其特征 在于：步骤2)中所述微卫星引物在正向引物5′端添加荧光标记TRAMA。

说明书一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法
技术领域
本发明属于水产养殖中野生种群分子鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别闽江流域野生河川 沙塘鳢种群的微卫星标记方法。
技术背景
河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)属鲈形目(Perciformes)，沙塘鳢科(Odontobutidae)， 沙塘鳢属(Odontobutis)，俗称：浦鱼、虎头鲨、土布鱼、虎头呆子等。在我国广泛分布于长江 中下游、闽江、钱塘江等水系，属于中国特有种。该鱼为淡水底栖小型肉食性鱼类，肉质细 嫩、味道鲜美、营养丰富，深受广大人们的喜爱。近些年，随着野生资源的急剧衰退和市场 需求的不断增长，河川沙塘鳢已发展成为一个非常具有潜力的水产养殖新品种。目前全国已 经零星开展了沙塘鳢的混养和套养，但产量还远不能满足市场的消费需求。在生产该鱼苗种 过程中，生产单位不注重该鱼种质资源管理，导致养殖成鱼发生生长速度变慢、病害增加等 种质退化现象。因此，为了解决河川沙塘鳢繁殖过程中种质退化的问题，对其不同地理种群 进行检测和遗传评估势在必行。目前，我国关于河川沙塘鳢的研究主要集中在基础生物学、 繁殖生物学及养殖技术方面，而关于该鱼的种群鉴别研究较少。为尽快掌握该鱼种质资源状 况，从而制定和实施更科学的渔业管理政策，如通过河川沙塘鳢不同流域种群的家系建立进 行遗传改良等，有必要对分布于我国各流域的河川沙塘鳢种群进行鉴别。
微卫星标记是一种常见的单序列重复片段(SSRs)或者是短期串联重复序列(STR)，其中包 括有1-6个碱基的碱基突变机制。不仅分布在非编码区，目前在多个功能基因(如：人类胰 岛素基因、人心肌肌动蛋白基因、α-珠蛋白基因)中同样也存在着不同程度的重复序列。由 于微卫星其高度多态、共显性、PCR检测方便、含量丰富、分布相对较均匀等特点，在种群 鉴定、群体遗传学、遗传图谱的构建、QTL作图和分子标记辅助育种等方面被广泛的应用。 目前，尚没有采用微卫星分子标记技术对河川沙塘鳢野生种群进行快速简便的鉴别方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快捷准确、简便有效的鉴别野生河川沙塘鳢种群的微卫星标 记方法
本发明的基本原理是：(1)用高效磁珠富集法大量开发获得河川沙塘鳢的微卫星标记； (2)从所开发引物中选取在河川沙塘鳢的安徽省当涂地区野生种群，江苏省射阳地区野生种 群，浙江省余姚地区野生种群和江苏省太湖东西山野生种群能够稳定扩增且具有多态性的多 对微卫星引物用于福建省闽江流域河川沙塘鳢野生种群的扩增；(3)筛选出在福建省闽江流 域河川沙塘鳢野生种群中亦能明显扩增，但扩增条带位置明显不同其他野生地理种群的微卫 星引物，用于鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群和其他野生种群。
本发明所述的一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法，包括以下步 骤：
1)DNA提取：采用基因组DNA提取试剂盒提取河川沙塘鳢基因组DNA，并测定其 纯度和浓度，取A260/A280值为1.6～1.9，浓度为200～2000ng/μL的基因组DNA进行扩增；
2)DNA片段扩增：采用聚合酶链式反应扩增DNA片段，PCR反应的1对引物序列为：
正向引物：5′-TRAMA-TTTATGGGTTCAGAAATGGG-3′(SEQ ID NO.1)，
反向引物：5′-CAGTCACAAAGCAAGGCAC-3′(SEQ ID NO.2)；
反应体系20μL:

扩增条件：94℃预变性5min，30个cycles，其中每个循环包括94℃变性30sec，51℃ 退火35sec，72℃延伸50sec，最后72℃延伸5min，4℃保存。
3)PCR产物的电泳和微卫星带型分型：于ABI3500xl毛细管电泳仪上进行基因分型 检测。
4)与DL2000Marker标准图谱进行对比：与标准图谱对比，读出待测样品的目的条 带所处的位置，如检测样本在靠近标准图谱259bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴 定为是闽江河川沙塘鳢种群；检测样本在靠近标准图谱263bp、265bp位置扩增出1条或2条 特异性条带，则鉴定为是其他流域野生河川沙塘鳢种群。
优选的：步骤1)中所提取的基因组DNA的A260/A280值为1.8～1.9。
优选的：步骤1)中所提取的基因组DNA的浓度为200～2000ng/μL。
其中，步骤2)中的PCR反应体系为：

其中，步骤2)中所述的PCR反应的程序为：94℃预变性5min，30个cycles，其中每 个循环包括94℃变性30sec，51℃退火35sec，72℃延伸50sec，最后72℃延伸5min，4℃保 存。
其中，步骤3)中所述需采用ABI3500xl毛细管电泳仪检测。
本发明的有益效果：
本发明是用于鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的一种分子鉴定方法，操作简单快捷， 能够提高对河川沙塘鳢种群间的鉴定效率和准确性，从而对该流域的河川沙塘鳢种群的种质 资源保护具有重要意义。
附图说明
图1：为野生河川沙塘鳢种群PCR扩增的荧光微卫星带谱，从上至下依次为安徽省当涂 地区野生种群，江苏省射阳地区野生种群，浙江省余姚地区野生种群，福建省闽江流域野生 种群，江苏省太湖东西山野生种群。
具体实施方式
本发明一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法实例如下，具体参数为说明 本发明技术方案所需，不应理解为对本发明保护范围的限制。
一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法，包括以下步骤：
1)DNA提取：
取5个具有野生河川沙塘鳢分布代表性的5个种群(当涂地区野生种群，射阳地区野生 种群，甬江流域余姚野生种群，闽江流域野生种群，太湖流域东西山野生种群)(河川沙塘鳢 主要分布于我国长江、钱塘江、闽江3大水系。由于本发明是鉴别闽江流域种群，因此，本 实验具体选取的其余4个种群分别代表了我国长江水系和钱塘江水系。4个代表性种群作为 对照种群。)各32尾实验鱼的尾鳍0.1～0.3g加入450μL DNA抽提缓冲液(10mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L EDTA，75mmol/L NaCl)，混匀后依次加入SDS和蛋白酶K至终浓度分别为0.5％ 和200μg/mL，然后于55℃水浴消化过夜。
加入等体积饱和苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、氯仿/异戊醇(24:1)各抽提一次。每 次抽提均轻柔混合10min后，4℃，12000rpm离心20min，取上清。
将所得上清液加入2.5mol/LNaCl(终浓度为0.2mol/L)和预冷的2倍体积的无水乙 醇沉淀，12000rpm离心20min取沉淀；用70％乙醇漂洗2次后在室温下自然干燥，待乙醇 挥发后溶于200μL的TE中，置于4℃冰箱备用。在核酸蛋白测定仪上测定其纯度及浓度， 1％琼脂糖凝胶电泳检测后进行PCR扩增。
河川沙塘鳢样品选自当涂地区野生种群，射阳地区野生种群，甬江流域余姚野生种群， 闽江流域野生种群，太湖流域东西山野生种群，每个野生种群随机选取16个样品。
2)DNA片段扩增：
采用聚合酶链式反应，以下为PCR反应的相关信息：
用于PCR反应的一对引物名称为OP87a：
正向引物：5′-TRAMA-TTTATGGGTTCAGAAATGGG-3′，
反向引物：5′-CAGTCACAAAGCAAGGCAC-3′；
PCR反应体系如下：

PCR的反应条件为：94℃预变性5min，30个cycles，其中每个循环包括94℃变性 30sec，51℃退火35sec，72℃延伸50sec，最后72℃延伸5min，4℃保存；
3)PCR产物的电泳及毛细管电泳检测鉴定；
毛细管电泳图谱见附图1，从上至下依次为当涂地区野生种群，射阳地区野生种群， 余姚地区野生种群，闽江流域野生种群，太湖流域东西山野生种群。对比标准图谱，样品仅 在靠近标准图谱259bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为是闽江流域野生河川沙 塘鳢种群；如样品仅在靠近标准图谱263bp、265bp位置扩增出1条或2条特异性条带，则鉴 定为是其他流域野生河川沙塘鳢种群。