一种他替瑞林的分离纯化方法.pdf

本发明公开了一种利用低压制备色谱法与高压液相制备色谱法相结合分离纯化他替瑞林的方法。主要解决现有技术不能得到高收率的产品的技术问题。本发明分离纯化方法包括如下步骤：1） 将固相合成所得的粗液肽先加乙醚处理，去掉里面的切割液，然后再加去离子水进行分层得上清液做粗液，反复水洗分层多次得粗液；2）用色谱甲醇（或乙醇）水溶液用常规柱减压柱色谱装置过滤粗液可以得到纯度超过95%以上的产品，然后用反相硅胶水系短柱；流动相为两相，醋酸水溶液为A相，色谱甲醇（或乙醇）水溶液为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；3) 将所得到的肽溶液进行减压旋蒸浓缩冻干；4）再处理：将一次冻干之后的产品加乙醚析出2-5次，得含醋酸盐粉末状成品。通过本发明可以得到纯度大于99%含醋酸盐的他替瑞林。

权利要求书
1.  一种他替瑞林的分离纯化方法，其特征是包括如下步骤：
1） 将固相合成所得的粗液肽先加乙醚处理，去掉里面的切割液，然后再加去离子水进行分层得上清液做粗液，反复水洗分层多次得粗液；
2）用色谱甲醇水溶液或色谱乙醇水溶液用常规柱减压柱色谱装置过滤粗液可以得到纯度超过95%以上的产品，然后用反相硅胶水系短柱进行梯度洗脱纯化，流动相为两相，醋酸水溶液为A相，色谱甲醇水溶液或色谱乙醇水溶液为B相，收集目的峰值的肽溶液；
3) 将所得到的肽溶液进行减压旋蒸浓缩冻干；
4）再处理：将一次冻干之后的产品加乙醚析出2-5次，得含醋酸盐粉末状成品。

2.  根据权利要求1所述的一种他替瑞林的分离纯化方法，其特征是：步骤1所述乙醚添加量为粗液肽2-10倍体积，去离子水添加量为粗液肽1-5倍体积；步骤2所述常规柱减压柱色谱装置用色谱甲醇水溶液或色谱乙醇水溶液质量百分浓度为3-5%。

3.  根据权利要求1所述的一种他替瑞林的分离纯化方法，其特征是：所述流动相A相：质量百分浓度为2%醋酸水溶液，B相：质量浓度百分比为2-10%的色谱甲醇水溶液，检测波长为254nm。

4.  根据权利要求1所述的一种他替瑞林的分离纯化方法，其特征是：所述反相硅胶水系短柱为德国MN Pyramid水系柱。

说明书一种他替瑞林的分离纯化方法
技术领域
本发明属于低压制备色谱法与高压液相制备色谱法相结合分离纯化他替瑞林的技术领域，可以得到纯度大于99%含醋酸盐的他替瑞林。
背景技术
他替瑞林是一种垂体激素释放兴奋药，由日本田边三菱制药株式会社研制成功，商品名Taltirelin，属于化药新药3.1类，目前临床用于改善脊髓小脑变性患者的运动失调最为有效的药物。他替瑞林（Taltirelin） 是世界上第一个批准的口服促甲状腺素释放激素(TRH)，除具有内分泌作用外，还可发挥一定的中枢神经系统(CNS)作用，包括提高运动活性，拮抗利舍平诱导的体温降低，以及拮抗戊巴比妥诱导的睡眠。此外，在动物CNS疾病模型中的药理学研究显示THR可改善抑郁，血循环性休克，意识紊乱，记忆力减退和运动技能障碍。然而，临床研究显示因TRH在体内快递代谢降解，作用时间较短。另外，TRH产生内分泌作用的剂量远低于对CNS的起效剂量，因而临床应用受到限制。该品种由日本田边三菱制药株式会社开发，2000年9月首次在日本上市，用于改善脊髓小脑变性病人的共济失调。脊髓小脑共济失调(SCAs)旧称常染色体显性共济失调，是一组以共济失调、辨距不良为主要临床表现的中枢神经系统慢性变性疾病。2000年9月前，促甲状腺素释放激素（TRH）注射液是唯一用于治疗该类疾病的药物。
近年来中国他替瑞林机行业取得了很大的发展，但是行业发展中也存在一些问题，和国外相比仍有很大的差距。中国制造业由于缺乏核心技术，贴牌生产仍然是“中国制造”普遍的生存模式。很多高端产品表面上市中国生产，其实核心技术都来自国外。为此，“十二五”明确指出必须坚持发挥市场基础性作用与政府引导推动相结合，科技创新与实现产业化相结合，深化体制改革，以企业为主体，推进产学研结合，让高端制造业成为国民经济的先导产业和支柱产业。制造业的升级和转型，对于他替瑞林行业有着深远影响和重大意义。
由于他提瑞林的本身结构性质的特殊性，只有两个氨基酸成分，这样固相合成所得到的粗肽不容易析出来，最终是液体状态，并且里面还含有大量的TFA切割液。这样在粗品的第一步的前处理上与以往常规产品的处理会有很大的不同，不仅需要去掉里面的切割剂，还需要去掉或是减弱里面很强的酸。一般我们做这一类产品分离方法几乎都是高压制备，这个产品仅仅高压制备的话，特别影响色谱柱的寿命以及产品的得率，因为里面含有大量的TFA切割液，TFA切割液的酸性极强，常规高压制备所使用的色谱柱承受不了极酸性的条件，并且TFA切割液进入色谱柱中会带走大部分的产品，致使产品得率很低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离纯化他替瑞林的方法，主要解决现有技术不能得到高收率的产品的技术问题。本发明不仅降低了成本，减少分离纯化路径，而且可以得到高纯度的醋酸盐成分的他提瑞林成品。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种他替瑞林的分离纯化方法，其特征是包括如下步骤：
1） 将固相合成所得的粗液肽先加乙醚处理，去掉里面的切割液，然后再加去离子水进行分层得上清液做粗液，反复水洗分层多次得粗液；
2）用色谱甲醇（或乙醇）水溶液用常规柱减压柱色谱装置过滤粗液可以得到纯度超过95%以上的产品，然后用反相硅胶水系短柱；流动相为两相，醋酸水溶液为A相，色谱甲醇（或乙醇）水溶液为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液（直接醋酸盐）；
3) 将所得到的肽溶液进行减压旋蒸浓缩冻干；
4）再处理：将一次冻干之后的产品加乙醚析出2-5次，得含醋酸盐粉末状成品。
优选地：步骤1所述乙醚添加量为粗液肽2-10倍体积，去离子水添加量为粗液肽1-5倍体积；步骤2色谱甲醇（或乙醇）水溶液用常规柱减压柱色谱装置的色谱甲醇（或乙醇）水溶液质量百分浓度为3-5%；A相：质量百分浓度为2%醋酸水溶液，B相：质量浓度百分比为2-10%色谱甲醇水溶液，检测波长为254nm；所述反相硅胶水系短柱为德国MN Pyramid水系柱。
发明的有益效果是：本发明的提出的一条适于批量化制备他替瑞林的工艺方法，经过研究我们发现：分离纯化上面利用低压制备色谱与反相高压制备色谱相结合的分离方法：低压制备色谱操作方便且成本低，它可以过滤掉很多盐成分，还有很多常规的色谱柱不能承受的强酸或是强碱，同时也分离一些产品里面的杂质，进而可以得到相对高一些纯度的他提瑞林中间体；反相高压液相制备色谱分离与主成分相邻的杂质，通过含有不同离子对试剂的流动相来得到不同盐成分的高纯度的他提瑞林成品，分离效果高收益大。使用反相高效液相色谱法与flash柱相结合制备他替瑞林，不仅能得到HPLC纯度大于99.5%的精肽，而且两种方法相结合，使得产品在收率上面可以大大提高，进而可以批量化与产业化。
附图说明
图1为本发明处理流程图。
图2为实施例1常规过滤产品色谱图。
图3为实施例1经纯化后产品色谱图。
图4为实施例1最终产品色谱图。
图5为实施例2常规过滤产品色谱图。
图6为实施例2最终产品色谱图。
图7为实施例3常规过滤产品色谱图。
图8为实施例3最终产品色谱图。
具体实施方式
实施例1：处理流程见图1，
1.  样品处理：将固相合成所得的粗液肽先加2倍体积的乙醚静置处理，目的是去掉里面的切割液，然后再加去5倍体积的去离子水进行静止分层得上清液做粗液，反复水洗分层多次，得粗液备用；
2.  常规柱减压柱色谱装置过滤粗液：配比质量百分浓度为5%的色谱甲醇水溶液用常规柱减压柱色谱装置过滤粗液，可以得到纯度大于92%的产品(图2)；
3.  纯化：
纯化条件：色谱柱：德国MN Pyramid水系柱，柱子直径和长度为：10cm×5cm.流动相：A相：质量百分浓度为2%的醋酸水溶液；B相：色谱甲醇水溶液。流速：80ml/min。检测波长：254nm。梯度：流动相B的质量百分浓度：2-10%，梯度处理时间60min（图3）；
纯化过程：将德国MN Pyramid水系柱用去离子水冲洗干净后上样，上样量为常规柱减压柱色谱装置过滤样品溶液（一次上样量15g左右），线性梯度2-10%洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用；
4. 将所得到的肽溶液进行减压旋蒸浓缩冻干；
5. 再处理，将一次冻干的产品加乙醚析出3次，再冻干，得含醋酸盐形式的粉末状成品，纯度大于99.5%，收率93%以上（图4）。
实施例2
1. 样品处理：将固相合成所得的粗液肽先加5倍体积的乙醚静置处理，目的是去掉里面的切割液，然后再加去3倍体积的离子水进行静止分层得上清液做粗液，反复水洗分层多次。得粗液备用；
2. 常规柱减压柱色谱装置过滤粗液：配比质量百分浓度为3%的色谱乙醇水溶液用常规柱减压柱色谱装置过滤粗液，可以得到纯度大于90%的产品(图5)；
3. 纯化：
纯化条件：色谱柱：德国MN Pyramid水系柱，柱子直径和长度为：10cm×5cm.流动相：A相：质量百分浓度为2%的醋酸水溶液；B相：色谱乙醇水溶液。流速：80ml/min。检测波长：254nm。梯度：流动相B的质量百分浓度：3-8%，梯度处理时间80min；
纯化过程：将德国MN Pyramid水系柱用去离子水冲洗干净后上样，上样量为常规柱减压柱色谱装置过滤样品溶液（一次上样量13g左右），线性梯度3-8%洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用；
4. 将所得到的肽溶液进行减压旋蒸浓缩冻干；
5. 再处理，将一次冻干的产品加乙醚析出4次，再冻干，得含醋酸盐形式的粉末状成品，纯度大于99.5%，收率90%以上（图6）。
实施例3
1. 样品处理：将固相合成所得的粗液肽先加10倍体积的乙醚静置处理，目的是去掉里面的切割液，然后再加去3倍体积的离子水进行静止分层得上清液做粗液，反复水洗分层多次。得粗液备用；
2. 常规柱减压柱色谱装置过滤粗液：配比质量百分浓度为5%的色谱甲醇水溶液用常规柱减压柱色谱装置过滤粗液，可以得到纯度大于95%的产品（图7）；
3. 纯化：
纯化条件：色谱柱：德国MN Pyramid水系柱，柱子直径和长度为：10cm×5cm.流动相：A相：质量百分浓度为2%的醋酸水溶液；B相：色谱甲醇水溶液。流速：80ml/min。检测波长：254nm。梯度：流动相B的质量百分浓度：2-8%，梯度处理时间70min；
纯化过程：将德国MN Pyramid水系柱用去离子水冲洗干净后上样，上样量为常规柱减压柱色谱装置过滤样品溶液（一次上样量15g左右），线性梯度2-8%洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用；
4. 将所得到的肽溶液进行减压旋蒸浓缩冻干；
5. 再处理，将一次冻干的产品加乙醚析出5次，再冻干，得含醋酸盐形式的粉末状成品，纯度大于99.5%，收率95%以上（图8）。