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本发明公开了一种党参多糖硫酸酯在制备抗Ⅰ型单纯疱疹病毒药物中的应用及其制备方法。本发明采用氨基磺酸法对党参多糖进行硫酸酯化修饰，优化了修饰方法，并发现党参多糖硫酸酯对单纯疱疹病毒Ⅰ型具有较强的预防及治疗效果。同时还筛选出活性最好的党参多糖硫酸酯（取代度为0.763），无论是预防给药还是治疗给药，细胞存活率均高于病毒对照组（P<0.01），且其预防作用与阿昔洛韦相当（P>0.05），治疗效果优于阿昔洛韦（P<0.05）。表明其抗病毒活性最强，可以作为研制新型抗HSV-Ⅰ病毒药物的材料，为研制新型抗HSV-Ⅰ病毒药物提供了材料和理论依据。

1.  一种党参多糖硫酸酯在制备抗Ⅰ型单纯疱疹病毒药物中的应用。

2.  一种党参多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：先提取、纯化党参多糖，再用氨基磺酸法对党参多糖进行硫酸化修饰，修饰条件为党参多糖与氨基磺酸的摩尔质量比为1:0.04  g/mol，反应时间15 min。

3.  权利要求2所述的党参多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：获得取代度为0.763的党参多糖硫酸酯。

党参多糖硫酸酯在制备抗Ⅰ型单纯疱疹病毒药物中的应用及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种药学领域，尤其是一种党参多糖硫酸酯在制备抗Ⅰ型单纯疱疹病毒药物中的应用及其制备方法。 
背景技术
单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus typeⅠ，HSV-Ⅰ) 属于疱疹病毒亚科，主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染，可引起人腰部以上黏膜和神经系统感染，所致疾病主要有角膜炎、疱疹性脑炎、唇疱疹和龈口炎等，并可形成潜伏感染。人是单纯疱疹病毒的唯一自然宿主。病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破损皮肤进入体内，潜居于人体正常粘膜、血液、唾液及感觉神经节细胞内。原发性感染多为隐性，大多无临床症状或呈亚临床表现，仅有少数可出现临床症状。原发感染发生后，病毒可长期潜伏于体内。正常人群中约有50%以上为该病毒的携带者。HSV在人体内不产生永久免疫力，每当机体抵抗力下降时，如发热、胃肠功能紊乱、月经、妊娠、病灶感染和情绪改变时，体内潜伏的HSV被激活而发病。研究证明，复发性单纯疱疹患者可有细胞免疫缺陷。HSV-Ⅰ是普遍存在的且接触传染的，当患者产生和释放病毒时，单纯疱疹病毒就会传播，危害很大。HSV-Ⅰ 一般传播的非常快速和广泛，对人的潜伏感染的时间是非常长的。 
单纯疱疹病毒I型具有宿主变化范围大,在细胞培养中繁殖与传播速度快,易破坏感染细胞和常在神经节中建立潜伏感染的特点。感染人体后可侵犯中枢神经系统引起单纯疱疹病毒性脑炎,脑膜炎,导致病毒性脑损伤, 能感染人体脏器组织导致器官病变(如非嗜肝病毒性肝炎),危及生命。还能能引起口唇疱疹、角膜炎、内脏器官感染等。病毒由包膜、被膜、核衣壳和含有病毒DNA的核心组成，由于HSV的基因为双链DNA,易与宿主DNA发生整合作用,或形成潜伏状态,限制了病毒疫苗的发展和作用。因此，研制开发高效低毒的新型抗病毒药物仍是当今抗病毒研究热点之一。 
目前国内外治疗单纯疱疹病毒的药物以阿昔洛韦及其衍生物为多，但该类药物存在毒副作用大、易耐药等许多不足，在临床应用中受到限制。因此国内外众多学者都在不断寻求安全有效的抗HSV-Ⅰ的新型药物。 
多糖( Polysaccharide)是中药重要活性成分之一，由 10个以上的单糖分子通过糖苷键聚合而成，在生物体内作为能量物质，广泛存在于动植物体内和微生物细胞壁中，参与细胞的各种生理活动。多糖作为生物活性物质能够抗各种病毒，如免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等有抑制作用，具有无细胞毒性且质量通过化学手段容易控制等优点，己引起医药界的高度重视，显示了广阔的药用前景。 
但天然药物的药效相对较低，多糖的活性直接或间接地受其分子结构的影响，与其初级和高级结构特别是三维空间构象密切相关，而且与分子量、溶解度、粘度等物理化学性质有关。采取一定的方法对多糖分子结构进行修饰，通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、数目和位置，可以提高或赋予多糖新的生物活性、降低其毒副作用。目前最为常见的修饰方法有：硫酸化、磷酸化、乙酰化、烷基化、羧甲基化等。无论天然或化学合成多糖经不同程度的硫酸化修饰后其抗病毒活性会有明显的变化，尤其是一些无抗病毒作用的多糖硫酸化修饰后具有了抗病毒活性。如香菇多糖本身虽无抗HIV活性，硫酸化修饰后却可抑制人类免疫缺陷病毒HIV产生的细胞病变。多糖硫酸化的抗病毒活性研究成为多糖修饰研究领域的热点，已成为多糖结构修饰中的一个重要方向。 
多糖硫酸酯(polysaccharides sulfate，PSS)，也称硫酸多糖（sulfated potysaccharides，SPS)，是多糖大分子链中单糖分子上的羟基被硫酸根所取代而形成的天然及半合成的酸性多糖，为聚阴离子化合物糖。具有广泛的生物学性质，包括抗病毒、抗肿瘤、对免疫系统作用和抗凝活性。有文献报道多种多糖硫酸酯具有抗病毒作用。有研究资料表明，多糖硫酸酯显著的抗病毒活性可能是硫酸基团的负电荷与病毒上蛋白的正电荷通过静电作用结合, 进而阻止了病毒对细胞的吸附, 封闭了包膜病毒与细胞受体结合的部位，其硫酸聚阴离子对病毒感染细胞进行抑制作用发挥更强的抗病毒活性。此外多糖硫酸酯的抗病毒作用机制也归功于对病毒向细胞吸附相关作用的抑制，即直接抑制病毒进入细胞或进入细胞后复制的某一步骤。从已有的多糖硫酸酯研究来看，大多是通过病毒与宿主细胞之间的分子亲和力来完成吸附过程，从而达到抗病毒的作用。此外引入硫酸基团后所引起的多糖立体结构的变化也是硫酸化多糖产生生物学活性的重要原因。 
党参为桔梗科植物党参Codorwpsis pilosula (Franch.) Nannf.、素花党参Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta (Nannf. ) L. T. Shen或川党参Codonopsis tang shen Oliv.的干燥根，以肉质根食用或入药。党参具有健脾益肺，养血生津的作用。常用于脾肺气虚，食少倦怠，咳嗽虚喘，气血不足等病症。党参主要成分有党参多糖、党参皂苷、甾醇类、三萜类、生物碱、内酯类、香豆素类等。党参多糖( Codonopsis tangshen Oliv.polysaccharides)是从党参的干燥根中提取分离得到的水溶性杂多糖，药理试验证明党参多糖具有明确的增强免疫力、抗肿瘤、抗应激、抗衰老等多个方面的药理作用。但党参抗病毒研究的文献只见苟鹏报到了轮叶党参提取物对犬细小病毒有一定的抑制作用，和党参多糖硫酸酯对鸡新城疫病毒（NDV）有抑制作用。 
发明内容
本发明的目的是：提供一种党参多糖硫酸酯的新用途。 
还提供了一种党参多糖硫酸酯的新制备方案。 
本发明是这样实现的：党参多糖硫酸酯在制备抗Ⅰ型单纯疱疹病毒药物中的应用。
党参多糖硫酸酯的制备方法，先提取、纯化党参多糖，用氨基磺酸法对党参多糖进行硫酸化修饰，修饰条件为党参多糖与氨基磺酸的摩尔质量比为1:0.04  g/mol，反应时间15 min。 
获得取代度为0.763的党参多糖硫酸酯。 
为了验证本发明的技术效果，发明人进行了如下实验： 
1、党参多糖的提取
用水煎-醇沉法。取党参饮片1000 g，粉碎，至于索氏提取器中，用80%乙醇加热回流3次脱脂，药渣加10倍量水煎煮3次，第1次3 h，第2次2 h，第3次1 h；抽滤药渣，合并3次滤液后浓缩。浓缩液加入95%乙醇到乙醇含量为80%，于4 ℃冰箱内静置12 h后，3000 r/min离心，收集沉淀部分，真空干燥后，复溶，加95%乙醇到乙醇含量为80%后，离心，收集沉淀，冻干，干燥沉淀物，得到深棕色党参粗多糖。党参多糖的最佳提取工艺是温度100℃，料液比为16倍，提取时间为3h，提取次数为2次，在此条件下，党参粗糖的提取率为26%左右。
2、党参多糖的纯化 
（1）粗多糖中除去蛋白质：党参粗多糖按照1:100(g/mL)溶解于足量蒸馏水中后，另取少量溶液，加蒸馏水稀释后，在紫外分光光度计下从800nm到200nm波长进行扫描。对溶解有粗多糖的溶液中，每1000mL中加入1g胃蛋白酶，并在37℃下进行恒温水浴12h后，将200mL的氯仿与正丁醇混合物加入含有胃蛋白酶的粗多糖中，充分震荡，静置12h后分离收集下层有机相，弃去中层变性蛋白层，收集上层含有党参多糖的水溶液，并在紫外分光光度计下做全波长扫描，反复数次，直至水溶液无蛋白的特征吸收峰260~280nm处无蛋白特征吸收峰时，证明多糖中的蛋白已经清除干净。
（2）党参多糖脱色素处理 
将去蛋白的党参多糖溶液浓缩后，加入5倍量95%乙醇醇沉，离心收集醇沉多糖，复溶后，再次醇沉处理，经过数次后，醇沉上清液颜色变无色后，证明粗多糖中的色素已经被脱去。收集多次醇沉的党参多糖冻干，得到灰白色党参多糖，证明多糖中的色素已经得到清除，清除后的党参多糖收集保存于4℃备用。
（3）膜分离纯化党参多糖 
将去蛋白、脱色素的党参粗多糖10g，溶解后将此溶液在3500r/min的速度下离心，弃去不溶物后，上清液转移到容量瓶中定容至500ml，使得党参粗多糖溶液浓度为20mg/mL，得到党参多糖COP-1组分，在4℃条件下保存待透析。
将离心后的COP-1多糖装入不同截留量大小的透析袋中进行透析，分别收集浓缩透析袋内透析液，冻干后得到COP-2，COP-3 、COP-4三份多糖样品。COP-2组分糖分子量在3500~10000之间；COP-3多糖分子量大于10000；COP-4多糖分子量在3500~7000之间，将透析袋分离后多糖冻干物均在4℃条件下保存备用。 
（4）DEAE-52阴离子交换柱层析分离党参多糖 
湿法装DEAE-52阴离子交换层析柱，将用HCl、NaOH溶液中浸泡处理的DEAE-52粉末，用大量去离子水反复冲洗至中性后，平衡，过夜，取膜分离纯化处理后的党参多糖COP-2溶液上样，开启恒流泵，用0~0.3mol/L的NaCl洗脱，恒流泵流速设置为0.2mL/min，收集洗脱液，5 mL /管，各管取样后按照苯酚-硫酸法检测多糖含量，绘制多糖洗脱曲线，合并收集含糖管洗脱液，进一步分离纯化。
党参多糖经过DEAE-52 纤维素凝胶对分离后，以管数为横坐标，吸光度为纵坐标，取各管中洗脱液，采用苯酚-硫酸法做洗脱曲线见图1所示，洗脱曲线显示第25管-28管中有较大吸收峰，收集25~28管合并。收集完组分1后，换用0.1mol/L的NaCl溶液洗脱DEAE凝胶，后得到组分2。组分1含量较多，对收集合并后组分1反复过柱纯化后，合并浓缩冻干后得到第一个分离组分，该组分程白色粉末状，无特殊气味. 
（5）葡聚糖G-25凝胶柱层析分离党参多糖
湿法装葡聚糖G-25凝胶层析柱，用0.9% NaCl冲洗，平衡，过夜，取经DEAE-52阴离子交换柱层析分离的党参多糖组分1溶液上样，开启恒流泵，用去离子水进行洗脱，恒流泵流速设置为0.2mL/min，收集洗脱液，5 mL /管，各管取样后按照苯酚-硫酸法检测多糖含量，绘制多糖洗脱曲线，合并收集含糖管洗脱液，再进一步分离纯化。
采用G-25葡聚糖凝胶，对DEAE-52凝胶分离后的党参多糖组分1进一步做脱盐处理。DEAE凝胶分离的组分1部分经G-25凝胶分离结果见图2：该凝胶下洗脱曲线做法与DEAE-52下做法相同。由于在G-25凝胶中，最后洗脱组分为分子量较小的物质，不是实验分离设定的目标多糖，因此对G-25凝胶分离后仅收集组分1部分。 
（6）葡聚糖G-100凝胶柱层析分离党参多糖 
湿法装葡聚糖G-100凝胶层析柱，用0.15mol/L的NaCl冲洗，平衡，过夜，取经G-25凝胶分离后的党参多糖溶液上样，开启恒流泵，洗脱液为0~0.3mol/L的NaCl溶液，恒流泵流速设置为0.2mL/min，收集洗脱液，5 mL /管，各管取样后按照苯酚-硫酸法检测多糖含量，绘制多糖洗脱曲线，将G-25凝胶分离合并的组分1部分，再经葡聚糖G-100凝胶多次分离后进行纯化，对洗脱组分做洗脱曲线后，收集合并第21~27管组分，合并浓缩后冻干，分离得到党参多糖COP-5（见图3）组分，采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量，糖含量达到98.61%，糖醛酸含量为4.72%。
（7）党参多糖的分子量测定 
党参多糖分子量HPLC法测定条件：仪器：Agilent 1100 型高效液相色谱系统；色谱柱为：色谱柱：Ultrahydrogel^TM2000 和Ultrahydrogel^TM 500 柱两根串联（25 cm × 0.75 cm；流动相：0.2mol/mL的NaCl溶液；流速：0.8mL/min，进样体积40μl，柱温40℃，检测器：示差检测器，参比为液体流动相，在上述色谱条件下对党参多糖进行分子量测定。
测定方法：精密称取已知相对分子量的普鲁兰多糖标准对照品，用蒸馏水溶解后，配制1mg/ml的溶液，对照品相对分子量分别为为：2.0×10⁶，7.88×10⁵，4.04×10⁵，2.12×10⁵， 1.12×10⁴，4.73×10³，按照3.5.1下方法测定分子量标准曲线。 
精密称取1mg的党参多糖COP-5样品后，加入到1mL的流动相中，充分振荡溶解后，离心10min除去不溶物后，取上清液，得到多糖供试品后，进样后对不同的多糖样品分子量进行测定。 
取已知分子量的糖，采用SEC色谱法测定分子量标准曲线后以分子量作为纵坐标，时间作为横坐标，采用最小二乘法对数据处理后，得到分子量-时间曲线先回归方程Y=-0.2291X+9.453（r=0.998），分子量在4.73×10³~2.0×10⁶内线性关系良好。 
对不同条件下分离得到的几种党参多糖分子量，进行凝胶排阻法进行分子量、纯度测定，具体的数据如表1所示，经过DEAE-52凝胶、G-25、G-100凝胶层析柱联合分离后的多糖COP-5组分，凝胶排阻色谱测定其纯度D值为1.42，表明糖的均一性好，90%的分子量与数均分子量、众均分子量，分布系数数据显示，COP-5组分的党参多糖这4个指标接近，也表明了凝胶分离多糖后，对于多糖的分子量得到了较好的控制。 

注：Mn为数均相对分子质量，Mw为重均相对分子质量，Mz为z均分子量其中分布系数，D为（Mn/Mw），90%处相对分子量标记为M90，D值反映多糖纯度情况。 
3、党参多糖硫酸酯的制备（党参多糖的硫酸化修饰） 
（1）多糖硫酸酯化的方法，国内外采用氨基磺酸法来进行硫酸酯化研究，少有报道，本发明采用氨基磺酸为硫酸酯化试剂来制备硫酸酯，选择常温下温和的氨基磺酸作为酯化试剂，在试验中设计中选择了均匀设计实验来优化多糖的硫酸酯化反应。
（2）硫酸化修饰条件优化由于反应温度（A）、反应时间（B）、投料比（多糖质量/氨基磺酸摩尔）（C））是多糖硫酸酯化的主要影响因素，在单因素实验的基础上，根据多糖及硫酸酯化试剂性质上选择了上述3个因素，各因素选择4个水平，并采用均匀设计拟水平法，均匀设计实验U ₈ (4 ³)安排实验，以获得最佳的硫酸化修饰的实验条件。 

（4）在250mL三颈烧瓶中加入精密称取纯化的党参多糖（Codonopsis pilosul polysaccharide，CPPS）1 g，搅拌6 h使党参多糖完全溶解于50 mL的二甲基亚砜（DMSO）中，按表1设定的反应温度、反应时间和投料比（g/mol）分别搅拌反应。反应结束后，将反应物倒入烧杯中，用10%的NaOH溶液中和至pH=7.0～8.0终止反应，然后加入三倍量体积的无水乙醇，于4℃下静置过夜，离心收集沉淀，复溶后用截留量为3500的透析袋透析72h后收集浓缩物，离心后，浓缩并冷冻干燥，得到党参多糖硫酸酯（sulfated Codonopsis pilosul polysaccharide，SCPPS），共得到8种SCPPS，分别标注为SCPPS₁、SCPPS₂、SCPPS₃、SCPPS₄、SCPPS₅、SCPPS₆、SCPPS₇、SCPPS₈。 

（6）数据分析 
均匀设计数据（表3）数据采用均匀设计实验处理软件DPS7.0标准版进行数值模拟后得到拟合方程为：Y=22.794021-0.0428288958X₁-0.776477473X₂
+0.1434399243X₃²+0.00805862119X₁X₂-0.0538186794X₁X₃+0.0354103763X₂X₃；拟合方程中，Y为硫酸根含量（%），X₁为反应温度（℃）；X₂为反应时间（min）；X₃为投料比（ml/mol）。

拟合方程中P=0.0402。回归方程有显著意义；剩余标准差S=0.1070392， 
调整后的相关系数Ra=0.998393。由拟合方程中各个系数，可以得出投料比对硫酸根的含量是正相关的作用，时间和温度相应的是负效应。因而在反应体系中应该降低温度，缩短反应时间，增大投料比，依次达到最大硫酸酯化率。
根据回归方程，得出最优组合为反应温度60℃，反应时间15min，投料比（（多糖质量/氨基磺酸摩尔）为1:0.04(g/mol)。 
（7）验证试验 
在反应温度60℃，反应时间15min，每50ml加入氨基磺酸为0.04mol的条件下，称取干燥至恒重的党参多糖三份各1.0g，进行3次酯化操作，得到三份硫酸化党参多糖，采用氯化钡-明胶法测定硫酸根含量，测定其取代度分别为0.7630、0739、0.754，与均匀设计试验结果的差异不显著，证实验说明均匀设计实验筛选的党参多糖硫酸酯化工艺可靠，对多糖硫酸化取代稳定，证明该条件为最佳条件。
（8）多糖硫酸化后鉴别 
精密称取反应后的硫酸化多糖SCPPS250mg，溶解于25mL蒸馏水中，取5mL后，滴加1mol/mL的BaCl₂溶液数滴后，观察现象；另取5mL后，加入20mL的无水乙醇沉淀，并离心，再滴加滴加1mol/mL的BaCl₂溶液数滴后，观察现象。
取反应前多糖加入KBr压片后，进行红外扫描，对比硫酸化后多糖的红外吸收，对其特征峰进行解析。 
SCPPS溶液(10mg/mL)中滴加1mol/mL的BaCl₂溶液后，出现白色沉淀；当加入20mL乙醇沉淀并离心后，滴加1mol/mL的BaCl₂溶液，并未出现白色沉淀，结果表明，硫酸根与党参多糖结合良好。 
对党参多糖进行红外扫描，结合原图可以看到相关区域波长吸收有变化：3436cm-1处的-OH羟基吸收减少，表明发生了酯化反应，1632cm-1处C=O羰基吸收峰增加，表明硫酸化后多糖中的乙酰氨基结构增加，1250cm-1前后的强吸收峰产生，表明在硫酸化多糖内产生了-C-SO2，-S=O分子键的伸缩振动，另外在1057cm-1处有类似于硫酸软骨素类药物的特征吸收，799cm-1处吸收为-C-S键的振动吸收。同时酯化前后的两种物质在波形上接近，表明硫酸化发生在多糖骨架上（图4）。 
（9）硫酸根含量分析方法 
硫酸根标准曲线：精密称取在120℃下干燥至恒重的无水Na₂SO₄ 50mg，用去离子水溶解后，定容到100ml，即配制得到浓度为0.5mg/ml的Na₂SO₄标准溶液备用。精密吸取标准溶液100μL，200μL，400μL，600μL，800μL，1000μL，1200μL，置于具塞试管中，另取一管加蒸馏水5ml做为空白管，其余加水定容至5ml，加入已配制好的3%三氯乙酸3.8ml，氯化钡-明胶1.2ml，摇匀后于25℃水浴放置18分钟后于420nm处测量吸光度，记录数据；另取一组具塞试管，加样与前一组相同，加水定容后，加入3.8ml三氯乙酸，加入明胶溶液，于25℃水浴放置18分钟后，测量吸光度后，以加液量为横坐标，吸光度（A_{明胶-氯化钡}-A_明胶）为纵坐标绘制标准曲线（图5）。
样品测定：取合成的党参多糖硫酸酯70mg，加入到50ml容量瓶中，加入1mol/L的HCL10ml，于100℃下反应3h终止反应，用1mol/L的HCL定容至50ml后，摇匀，离心后取上清液，测定含硫酸根含量。根据标准曲线，计算所得样品SO₄^2-含量。党参多糖的硫酸根取代度计算公式为：DS=1.62S%/(32-1.02S%)。硫酸根含量标准曲线：Y=1.3156x+0.0159，R=0.9957，曲线相关性较好（见图5）。 
4、党参多糖硫酸酯的抗HSV-1病毒活性比较 
在预试验的结果基础上，选择SCPPS₆为研究对象，以未进行硫酸化修饰的CPPS作为对照，首先测定了它们对非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）的安全浓度，然后用MTT法比较它们HSV-1感染细胞能力的影响。
（1）病毒滴度的测定  取对数生长期的Vero细胞，按4.0×10³个/孔的细胞数接种于96孔培养板中，置37℃，5%CO₂培养箱培养，待细胞贴壁后，吸尽上清，加入不同稀释度的病毒液（用含2%胎牛血清的维持液将HSV-Ⅰ病毒以10倍稀释度稀释成10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9），每个稀释度设6个复孔，同时设病毒阴性对照组，每孔100μl，置培养箱培养，每日检查病毒生长情况，观察特征性细胞病变的孔数，72h后按如下方法记录结果：25%以下记“+”，26%～50%记“++”，51%～75%记“+++”，76%～100%记“++++”；按照Reed-Muench公式，计算病毒的半数细胞感染量（TCID50）。 
病毒感染滴度的测定结果  与正常Vero细胞相比，HSV-Ⅰ感染的细胞出现细胞肿胀、变圆、从瓶壁脱落等细胞病变效应（CPE）的典型现象（图6）。根据Reed-Muench公式计算，HSV-1的TCID₅₀为10^-8/0.1mL。 
（2）硫酸化党参多糖的细胞毒性试验  按照上述方法将Vero细胞接种于96孔培养板中，置37℃，5%CO2培养箱培养，待细胞贴壁后，吸尽上清，用维持液将硫化党参多糖分别稀释为0、10、20、50、100、200μg/ml等6个浓度，将各浓度药物以每孔100μl加入细胞中，每个浓度设置6个复孔；培养箱中培养72h后，每孔加入5mg/ml的MTT染液10μl，继续培养4h后，弃上层液体，加入DMSO 100μl/孔，振荡10min，直至形成的甲瓒结晶全部溶解，在酶标仪490nm处测定吸光度（A）值，计算药物的最大无毒浓度。 
党参多糖（CPPS）和硫酸化党参多糖（SCPPS₆）对细胞毒性的测定 随着CPPS和SCPPS₆使用浓度的增加，活细胞数量相应减少。当浓度达到200μg/ml 时，CPPS组的细胞存活率与对照组相比有统计学差异（P < 0.05），而SCPPS₆组的无统计学差别（P >0.05）。因此，CPPS和SCPPS₆对Vero细胞最大无毒浓度分别确定为100μg/ml和200μg/ml（表4）。 

（3）硫酸化党参多糖抗HSV-Ⅰ实验  将Vero细胞计数后接种于96孔培养板中，置37℃，5%二氧化碳孵箱中培养，待细胞长成单层后分为以下几组：细胞对照组、病毒对照组、阳性药物对照组，不同浓度药物组。每组设6个复孔，实验重复3次。 
1）药物的预防作用 将不同浓度的药物加入单层细胞中，24h后弃上清，用100×TCID50的病毒液攻击细胞1h，而后PBS清洗以除去未结合的病毒，再加入不同浓度的药物作用72h，镜下观察细胞病变情况，并记录。 
2）药物的治疗作用 用100×TCID50的病毒液攻击已长成单层的细胞1h，而后PBS清洗，再加入不同浓度的药物作用72h，镜下观察细胞病变情况，并记录。 
3）统计学分析方法 采用SPSS14.0软件，对计量资料进行单因素方差分析，两组间比较采用t检验，实验数据以均数±标准差（± s）表示，P<0.05为有显著性差异。 
CPPS和SCPPS₆在预防及治疗给药时的抗HSV-Ⅰ作用从图7中可以看出，未经硫酸化修饰的CPPS-预防及治疗给药组的细胞存活率均高于病毒对照组，但仅预防组的有统计学差异，与阳性药物阿昔洛韦（ACV）相比，预防组和治疗组的细胞存活率都较低，说明CPPS只有一定的预防HSV-Ⅰ感染的效果，且该作用弱于ACV；而经过硫酸化修饰后的SCPPS₆呈现出明显的预防及治疗效果（与病毒对照组相比，P<0.01），其预防作用与ACV相当（与ACV预防组相比，P>0.05），治疗效果优于ACV（与ACV治疗组相比，P<0.05）。 
对党参多糖进行了硫酸化修饰及鉴定，并对硫酸化修饰前后的党参多糖体外抗HSV-1的效果进行了研究。预防给药组是先加药物预处理24h后再予以病毒攻击，其方式是模拟临床上的预防疾病给药，其目的是观察药物能否影响病毒生活周期中的吸附阶段；治疗给药组则是先予以病毒攻击再加入药物，模拟临床上感染后的治疗给药，其目的是观察药物能否对已进入宿主细胞的病毒发挥作用，这主要是病毒生活周期中的穿入后阶段，包括脱壳、生物合成、组装、成熟以及释放。实验结果表明：经硫酸化修饰后的党参多糖，其对HSV-Ⅰ的预防及治疗效果明显增强，这可能是经硫酸化修饰后的多糖空间构象发生了变化，占据了病毒与宿主细胞受体结合的位点，导致病毒吸附减少，表现为明显的预防效果；而对吸附后阶段抑制的影响可能与构象发生改变的多糖影响了病毒复制周期的一些关键酶的功能有关，其相关机制及其作用靶点尚需进一步的研究。 
根据前期研究证明，硫酸化修饰能够显著提高党参多糖的生物活性，尤其是抗病毒活性，本发明采用氨基磺酸法对党参多糖进行硫酸酯化修饰，优化了修饰方法，并发现党参多糖硫酸酯对单纯疱疹病毒Ⅰ型具有较强的预防及治疗效果。同时还筛选出活性最好的党参多糖硫酸酯（取代度为0.763），无论是预防给药还是治疗给药，细胞存活率均高于病毒对照组（P<0.01），且其预防作用与阿昔洛韦相当（P>0.05），治疗效果优于阿昔洛韦（P<0.05）。表明其抗病毒活性最强，可以作为研制新型抗HSV-Ⅰ病毒药物的材料，为研制新型抗HSV-Ⅰ病毒药物提供了材料和理论依据。 
附图说明
附图1为党参多糖的DEAE-52凝胶分离曲线； 
附图2为党参多糖的G-25凝胶柱色谱分离；
附图3为党参多糖的G-25凝胶柱色谱分离；
附图4为党参多糖的G-25凝胶柱色谱分离；
附图5为硫酸根含量标准曲线；
附图6为HSV-Ⅰ感染前后的Vero细胞；
附图7为CPPS-1和SCPPS-1在预防及治疗给药时的抗HSV-1作用（MTT法）；
附图7中*代表P<0.05,**代表P<0.01；与病毒对照组比较： Δ代表P<0.05,ΔΔ代表P<0.01；与ACV预防组比较： #代表P<0.05,##代表P<0.01；与ACV治疗组比较： @代表P<0.05,@@代表P<0.01 。
具体实施方式
本发明的实施例1：党参多糖硫酸酯的制备方法，具体如下： 
1）党参多糖的提取
用水煎-醇沉法。取党参饮片1000 g，粉碎，至于索氏提取器中，用80%乙醇加热回流3次脱脂，药渣加10倍量水煎煮3次，第1次3 h，第2次2 h，第3次1 h；抽滤药渣，合并3次滤液后浓缩。浓缩液加入95%乙醇到乙醇含量为80%，于4 ℃冰箱内静置12 h后，3000 r/min离心，收集沉淀部分，真空干燥后，复溶，加95%乙醇到乙醇含量为80%后，离心，收集沉淀，冻干，干燥沉淀物，得到深棕色党参粗多糖。党参多糖的最佳提取工艺是温度100℃，料液比为16倍，提取时间为3h，提取次数为2次，在此条件下，党参粗糖的提取率为26%左右；
2）党参多糖的纯化
（1）粗多糖中除去蛋白质：党参粗多糖按照1:100(g/mL)溶解于足量蒸馏水中后，另取少量溶液，加蒸馏水稀释后，在紫外分光光度计下从800nm到200nm波长进行扫描；对溶解有粗多糖的溶液中，每1000mL中加入1g胃蛋白酶，并在37℃下进行恒温水浴12h后，将200mL的氯仿与正丁醇混合物加入含有胃蛋白酶的粗多糖中，充分震荡，静置12h后分离收集下层有机相，弃去中层变性蛋白层，收集上层含有党参多糖的水溶液，并在紫外分光光度计下做全波长扫描，反复数次，直至水溶液无蛋白的特征吸收峰260~280nm处无蛋白特征吸收峰时，证明多糖中的蛋白已经清除干净；
（2）党参多糖脱色素处理
将去蛋白的党参多糖溶液浓缩后，加入5倍量95%乙醇醇沉，离心收集醇沉多糖，复溶后，再次醇沉处理，经过数次后，醇沉上清液颜色变无色后，证明粗多糖中的色素已经被脱去；收集多次醇沉的党参多糖冻干，得到灰白色党参多糖，证明多糖中的色素已经得到清除，清除后的党参多糖收集保存于4℃备用；
（3）膜分离纯化党参多糖
将去蛋白、脱色素的党参粗多糖10g，溶解后将此溶液在3500r/min的速度下离心，弃去不溶物后，上清液转移到容量瓶中定容至500ml，使得党参粗多糖溶液浓度为20mg/mL，得到党参多糖COP-1组分，在4℃条件下保存待透析；
将离心后的COP-1多糖装入不同截留量大小的透析袋中进行透析，分别收集浓缩透析袋内透析液，冻干后得到COP-2，COP-3 、COP-4三份多糖样品。COP-2组分糖分子量在3500~10000之间；COP-3多糖分子量大于10000；COP-4多糖分子量在3500~7000之间，将透析袋分离后多糖冻干物均在4℃条件下保存备用；
3）用氨基磺酸法对党参多糖进行硫酸化修饰
在250mL三颈烧瓶中加入精密称取纯化的党参多糖（Codonopsis pilosul polysaccharide，CPPS）1 g，搅拌6 h使党参多糖完全溶解于50 mL的二甲基亚砜（DMSO）中，修饰条件为党参多糖与氨基磺酸的摩尔质量比为1:0.04  g/mol，反应时间为15 min，搅拌反应，反应结束后，将反应物倒入烧杯中，用10%的NaOH溶液中和至pH=7.0～8.0终止反应，然后加入三倍量体积的无水乙醇，于4℃下静置过夜，离心收集沉淀，复溶后用截留量为3500的透析袋透析72h后收集浓缩物，离心后，浓缩并冷冻干燥，获得取代度为0.763的党参多糖硫酸酯。
本发明的实施例2：取党参多糖硫酸酯3g、药用淀粉75 g、微晶纤维素20 g，将药用淀粉先干燥，过120目筛，再与党参多糖硫酸酯、微晶纤维素混合，过两次120目筛，填入硬胶囊中，制成1000粒本发明胶囊。每粒硬胶囊含主药成分0.3 mg。 
本发明的实施例3：取党参多糖硫酸酯3g、羟丙甲纤维素6g、羧甲淀粉钠10g，微晶纤维素8g，乳糖115g、淀粉50g，硬脂酸镁1g；将主药与辅料充分混匀后投入高速搅拌机中，喷雾加水适量，整粒，水分控制在3~4%，然后压片，制成1000片，包薄膜衣。每粒含主药成分0.3 mg。 
本发明的实施例4：取党参多糖硫酸酯3g，加入400 ml聚乙二醇200溶解，再加入适量蒸馏水进行稀释，然后再加入适量蔗糖并调整体积至1000 ml， 搅匀，过滤，灌装成10 ml 或20 ml 每只，灭菌包装。