发明内容
为了进一步提高重组痘苗病毒疫苗的安全性及有效性，本发明目的在
于提供一种同源重组构建B8R基因缺失区插入外源基因的的IFN-γ受体
基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒VTTΔB8RlacZ及其在制备重组痘
苗病毒疫苗中的应用。
具体涉及一种B8R基因缺失、表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8R(B8R基
因缺失不带lacZ选择标记，TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol
env基因)的天坛株重组痘苗病毒recombinant vaccinia virius VTKgpe
的艾滋病疫苗，该重组痘苗病毒recombinant vaccinia virius VTKgpe
于2004年2月24日在北京保藏，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委
员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.1099；涉及一种B8R基因缺
失表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8RlacZ(B8R基因缺失为lacZ所取代，
TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天坛株重组痘苗
病毒的艾滋病疫苗；还涉及一种B8R基因缺失、表达乙型肝炎病毒HBSAg
抗原，IL-2的(B8R基因缺失插入HBSAg抗原，TK区插入IL-2基因)
的天坛株重组痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗。
本发明的目的在于提供用于以痘苗病毒VTT为母本病毒，构建B8R区
缺失，同时在该区插入各种外源基因的重组痘苗病毒转移质粒pSKB8R、
pSKB8RLacZ、pSKB8RNeo、pSKB8RPNeo和它们的构建方法。
本发明提供了一种用于转移质粒pSKB8RLacZ构建的质粒pSC65，含有
该质粒的大肠埃希氏菌Esherichia coli已于2004年2月24日在北京保
藏，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏
号为CGMCC No.1097。
本发明提供了一种用于转移质粒pSKB8Rneo构建的质粒pVI75，含有该
质粒的大肠埃希氏菌Esherichia coli已于2004年2月24日在北京保
藏，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏
号为CGMCC No.1098。
本发明所涉及的一种B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTTΔ
B8R1acZ可以作为同源重组构建B8R基因缺失区插入外源基因的疫苗株的
亲本毒株。VTTΔB8RlacZ构建方法即将痘苗病毒天坛株VTT(北京生物
制品所保藏，Tiantan株752-1)与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细
胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为
lacZ所取代的重组病毒VTTΔB8RlacZ。提取DNA，进行PCR扩增及DOT
BLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失的稳定性，表明VTTΔB8RlacZ在
CEF细胞连续培养传代15代B8R基因缺失稳定。VTTΔB8RlacZ在CEF细
胞连续培养传代15代插入外源基因lacZ稳定表达。重组缺失病毒VTT
ΔB8RlacZ在CEF、TK-143、CV-1细胞中的繁殖生长曲线测定，结果表明
VTTΔB8RlacZ的生长曲线与VTT生长曲线相似。B8R基因缺失对重组缺
失病毒在细胞中的繁殖复制没有影响。兔皮内毒力实验表明VTT752-1形
成红肿痘疱面积显著大于VTTΔB8RlacZ形成痘疱，VTT752-1形成红肿痘
疱而后出现溃破接痂，VTTΔB8RlacZ形成痘疱无溃破接痂，VTTΔ
B8RlacZ形成痘疱消褪较VTT752-1形成痘疱消褪早。B8R基因缺失显著
降低痘苗病毒天坛株病毒毒力。
本发明涉及的一种B8R基因缺失、表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8R(B8R
基因缺失不带lacZ选择标记，TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol
env基因)的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗及一种B8R基因缺失表达
HIV-1抗原的VTKgpe/ΔB8RlacZ(B8R基因缺失为lacZ所取代，亲本毒
株VTTΔB8RlacZ的TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)
的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗。即将VTKgpe(TK区插入B’/C型
CN54株HIV-1 gagpol env基因的天坛株重组痘苗病毒)与转移质粒
pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、
鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTKgpeΔB8RlacZ，再
以VTKgpeΔB8RlacZ为亲本株与pSKB8RNeo共转染CEF细胞进行同源重组，
经G418压力筛选、蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失
不带lacZ选择标记的重组病毒VTKgpeΔB8R。裸鼠毒力实验表明VTKgpe
ΔB8R毒力较VTKgpe显著降低，腹腔接种VTT(104pfu)及VTKgpe
(106pfu)15天裸鼠死亡，接种VTKgpeΔB8R(107pfu)裸鼠存活。胞内
IFN-γ.染色流式细胞仪分析、T淋巴细胞增殖、CTL检测显示B8R基因
缺失显著提高表达HIV-1基因的天坛株重组痘苗病毒特异性细胞免疫。本
发明上述所涉及的TK区
是指Tiantan株Genebank，gi6969640基因组的79799bp-81271bp的一段
核苷酸序列。
本发明涉及B8R基因缺失、表达HIV-1和乙型肝炎病毒各种单价或多
价抗原的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病及乙型肝炎病疫苗。
本发明涉及B8R基因缺失、表达外源基因单价或多价抗原的天坛株重
组痘苗病毒包括：重组疫苗、表达外源基因重组痘苗病毒以及它们在制
备治疗病毒病的重组痘苗病毒疫苗药物中的应用。
以上本发明所描述的技术特征目前国内外未见任何报道，所以本发明
具有创造性、新颖性和实用性。对人类病毒病的重组痘苗病毒疫苗药物治
疗将带来十分重要的意义。
附图说明
图1显示转移质粒pSKB8R、pSKB8RLacZ、pSKB8RNeo的构建路线
图2显示pSKB8R酶切确认分析结果，图中泳道2，3：分子量标记
DL2000，DL15000(购自大连宝生物工程有限公司)，泳道1：pSKB8R
(NdeI和BgLII)。
图3显示pSKB8RlacZ酶切确认分析结果，图中泳道1：分子量标记
DL15000，泳道2：pSKB8RLacZ(SpeI)，泳道3：pSKB8RLacZ(SacI)，
泳道4：pSKB8RLacZ(NdeI)。
图4显示pSKB8RNeo酶切确认分析结果，图中泳道1：分子量标记
DL15000，泳道2：pSKB8RNeo(BamHI和BgLII)。
图5显示pSKB8RPNeo酶切确认分析结果，图中泳道12：分子量标记
DL2000，15000，泳道3：pSKB8RPNeo(SaLI/SmaLI)。
图6显示重组病毒VTTΔB8RlacZ、VTKgpeΔB8RlacZ、VTKgpeΔB8R构建
示意图。
图7显示PCR扩增检测重组病毒VTTΔB8RlacZ B8R基因缺失
1，6：DNA标准2：VTTDNA PCR扩增产物(引物B8RLF、B8RRR)
3：VTTDNA扩增产物(引物B8RF、B8RRR)
图8Dot Blot检测病毒基因组中B8R基因
提取痘苗病毒VTT752-1DNA及重组病毒VTTΔB8RlacZ传代15代DNA，以
B8R基因地高辛标记探针进行Dot Blot检测。VTT752-1Dot Blot结果显
示杂交印迹斑点，VTTΔB8RlacZ传代15代Dot Blot结果未显示杂交印
迹斑点，表明VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定
缺失
图9显示重组缺失病毒VTTΔB8RlacZ细胞中的繁殖曲线测定
以VTTΔB8RlacZ重组病毒在CEF中增殖，其不同时间收获的病毒PFU值，
绘制病毒繁殖曲线(与TK-143、Wish、CV-1细胞上繁殖曲线相似)。结果
表明VTTΔB8RlacZ的繁殖曲线与对照VTT繁殖曲线相似。B8R基因缺失
对重组缺失病毒在细胞中的繁殖复制没有影响。48h病毒繁殖高峰达
107PFU/ml。(生长曲线纵轴为PFU对数值)
图10显示兔皮内毒力实验结果：兔背皮内左侧接种1×106PFU的VTTΔ
B8RlacZ，右侧接种1×106PFU/ml的VTT752-1，将0.1ml 1×107pfu/ml VTT
ΔB8RlacZ重组病毒，对兔背皮内注射后，逐日观察皮肤红肿面积，第5
天可见红肿痘疱，明显小于对照痘苗病毒，且无溃破，消褪较早。表明重
组病毒VTTΔB8RlacZ毒力比对照VTT752-1显著减弱。
图11显示PCR扩增检测重组病毒VTKgpeΔB8R B8R基因缺失
提取重组病毒DNA为模板，以引物B8RLF、B8RRR进行PCR扩增。重组病毒
VTKgpeΔB8R由于B8R基因缺失，PCR扩增出1244bp片段，包括B8R基
因外左侧同源序列B8RL片段583bp、右侧同源序列B8RR片段661bp。
而对照VTTDNA为模板扩增出2Kb片段，包括B8R基因外左侧同源序列B8RL
片段583bp、B8R基因818bp、右侧同源序列B8RR片段661bp。结果
表明VTKgpeΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失。
图12、Dot Blot检测病毒VTKgpeΔB8R基因组中B8R基因
1、VTT752-1 2、VTKgpeΔB8R
提取痘苗病毒VTT752-1DNA及重组病毒VTKgpeΔB8R传代15代DNA，以
B8R基因地高辛标记探针进行Dot Blot检测。VTT752-1Dot Blot结果显
示杂交印迹斑点，VTKgpeΔB8R传代15代Dot Blot结果未显示杂交印迹
斑点，表明VTKgpeΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺
失
图13显示胞内IFN-γ.染色流式细胞仪分析结果。DNA+VTKgpeΔB8R免
疫组小鼠脾细胞T淋巴细胞，在体外经表位肽刺激后，分泌IFN-γ的CD8+
T淋巴细胞占脾脏总CD8+T淋巴细胞的百分比数显著高于DNA+VTKgpe
免疫组。VTKgpeΔB8R免疫组小鼠脾细胞分泌IFN-γ.CD8百分比数显著
高于VTKgpe免疫组。
图14显示T淋巴细胞增殖3H-TdR法检测结果。DNA+VTKgpeΔB8R免疫
组小鼠脾细胞T淋巴细胞，在体外经表位肽刺激后，刺激指数(SI)显著
高于DNA+VTKgpe免疫组。
图15显示CTL乳酸脱氢酶法检测结果。DNA+VTKgpeΔB8R免疫组小鼠
脾细胞T淋巴细胞，特异性杀伤显著高于DNA+VTKgpe免疫组。VTKgpe
ΔB8R免疫组高于VTKgpe免疫组
图16 Western Blot分析VTKgpeΔB8R目的基因表达
1 VTT感染CEF细胞 2，3，4VTKgpeΔB8R感染CEF细胞5预染蛋白
Marker
具体实施方案
实施例一、转移质粒的构建
1.质粒pBR-SK的构建
5’PBR322-SACI-FOR
G
GAGCTCCGACCGATGCCCTTGAGAGCC
3’PBR322-KPNI-RE
GG
GGTACCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG
PCR扩增商业质粒pBR322包括全部功能元件的序列，记为pBR。
反应体系
10×Pyrobest Buffer 5μl
dNTPMisture(各2.5mM) 5μl
3’PBR322-KPNI-RE(50μM) 0.5μl
5’PBR322-SACI-FOR(50μM) 0.5μl
pBR322 0.5μl
Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml) 0.5μl
ddH2O 38μl
反应条件94℃预变性2min；94℃30s，68℃5min，共35个循环；72℃7min；
4℃。
纯化
![]()
大连宝生物的KpnI和SacI共酶切PCR产物pBR，跑胶回收。
用大连宝生物的KpnI和SacI共酶切质粒pBS-SK，得到多克隆位点
序列(小片段)，记为SK，跑1.5％琼脂糖胶回收。
连接酶切回收产物pBR和SK，转化Top10大肠杆菌感受态，并筛选
出正确克隆子，记为pBR-SK。
2.转移质粒pSKB8R的构建
在载体质粒pBR-SK插入痘苗病毒天坛株B8R基因外左侧同源序列B8RL
片段、右侧同源序列B8RR片段。见图1。采用PCR技术分别以痘苗病毒
DNA扩增痘苗病毒天坛株B8R基因外左侧同源序列B8RL片段(引物B8RLF、
B8RLR)右侧同源序列B8RR片段(引物B8RRF、B8RRR)，B8RL片段、B8RR
片段分别用BgLII切连接，以连接产物为模板PCR扩增(引物B8RLF、B8RRR)
B8R基因外左右侧同源序列连接大片段B8RLR。大片段B8RLR、pBRSK质粒
分别以KpnI/BamHI酶切、T4DNALigase连接构建带有天坛株B8R基因外
左右侧同源臂的转移质粒pSKB8R。引物序列：B8RLF：
gtaataggtaccgtagcatcctattcg B8RLR：tataatagatcttatggtgttgtttg
B8RRF：aactaaagatctcggtagcac B8RRR：attcgtggatccattgtaacaagatatc
B8RL片段(引物B8RLF、B8RLR)，B8RR片段(引物B8RRF、B8RRR)，，
连接大片段B8RLR(引物B8RLF、B8RRR)PCR扩增反应采用大连宝生物工
程有限公司的试剂盒，反应体系如下：
模板DNA 1μl
正、反向引物 各1μl
10×Pyrobest缓冲液 5μl
dNTP混合物(各2.5mM) 5μl
Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μl
ddH2O 37.5μl
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共
20个循环；72℃7min；4℃。
大片段B8RLR延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进
行纯化回收，回收产物KpnI/BamHI共酶切(Takara公司产)。pBRSK质
粒载体KpnI/BamHI共酶切(Takara公司产)。用Omega公司E.Z.N.A.Gel
Extraction Kit进行电泳纯化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司产)
连接构建带有天坛株B8R基因外左右侧同源臂的转移质粒pSKB8R。连接
产物分别转化感受态大肠杆菌Top10，涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃
培养12-16小时。提取质粒，用相应限制性内切酶酶切分析鉴定，酶切鉴
定结果分别参见图2。
3.转移质粒pSKB8RLacZ的构建
在pSKB8R左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段间插入痘苗
病毒启动子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列。以质粒pSC65为模板扩增
痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列(引物pSC65F、pSC65R)。
pE/L、p7.5及下游LacZPCR扩增片段(引物pSC65F、pSC65R)以BamHI酶
切、转移质粒pSKB8R以BgLII酶切，二者T4DNALigase连接构建转移质
粒pSKB8RLacZ。pSKB8RLacZ带有痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5和p7.5
下游的LacZ序列以及两侧的B8R基因外同源臂。pSC65F：
tctttcggatccttgttgaattagatcg pSC65R：gtttgccatacgctcacagaag
pE/L、p7.5及下游LacZPCR扩增片段PCR扩增反应采用大连宝生物
工程有限公司的试剂盒，反应体系如下：
质粒pSC65 1μl
正、反向引物(pSC65F、pSC65R) 各1μl
10×Pyrobest缓冲液 5μl
dNTP混合物(各2.5mM) 5μl
Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μl
ddH20 37.5μl
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共
20个循环；72℃7min；4℃。
pE/L、p7.5及下游LacZPCR扩增片段延伸产物用Omega公司的
E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物BamHI酶切(Takara公
司产)。转移质粒pSKB8R载体BgLII酶切(Takara公司产)。用Omega公
司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收.。二者
T4DNALigase(Takara公司产)连接构建pSKB8RlacZ。连接产物分别转化感
受态大肠杆菌Top10，涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16小时。
提取质粒，用相应限制性内切酶酶切分析鉴定，酶切鉴定结果分别参见图
3。
4转移质粒pSKB8Rneo的构建
即在pSKB8R左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段外侧插入
痘苗病毒启动子序列pH6及下游Neo序列。以质粒pVI75为模板扩增痘苗
病毒启动子序列pH6及下游Neo序列(引物NeoF，NeoR)，BamHI、SacII
酶切pH6+Neo片段、转移质粒pSKB8RBamHI、SacII酶切，二者T4DNALigase
连接构建转移质粒pSKB8RNeo。引物NeoF：
cgcggatcctcgatccccagattacaaacaactagg，引物NeoR：
tccccgcggacagatttctccgtgatagggatcg
pH6及下游Neo序列PCR扩增反应采用大连宝生物工程有限公司的试
剂盒，反应体系如下：
质粒 1μl
正、反向引物(NeoF，NeoR) 各1μl
10×Pyrobest缓冲液 5μl
dNTP混合物(各2.5mM) 5μl
Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μl
ddH2O 37.5μl
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，共
20个循环；72℃7min；4℃。
pH6及下游Neo序列PCR扩增片段延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A
Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物SacII/BamHI酶切(Takara公司
产)。转移质粒pSKB8R载体SacII/BamHI酶切(Takara公司产)。用Omega
公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收.。二者
T4DNALigase(Takara公司产)连接构建转移质粒pSKB8RNeo。连接产物分
别转化感受态大肠杆菌Top10，涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16
小时。提取质粒，用相应限制性内切酶酶切分析鉴定，酶切鉴定结果分别
参见图4。
5转移质粒pSKB8RPNeo的构建
即在pSKB8RNeo左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段间插
入两个互为反向的痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5。以质粒pSC65为模
板扩增痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及多克隆位点。pE/L、p7.5及多
克隆位点扩增片段(引物PMF，PMR)以BamHI酶切、转移质粒pSKB8R以
BgLII酶切，二者T4DNALigase连接构建pSKB8RP。质粒
pSKB8RPSacII/BamHI酶切，pH6及下游Neo序列PCR扩增片段延伸产物用
SacII/BamHI酶切(Takara公司产)，二者T4DNALigase连接构建转移质
粒pSKB8RPNeo。PMF：cgggatccgtcgacttcgaacttattt PMR：
cgggatcccccgggctcgagttatgatctt
pE/L、p7.5及多克隆位点扩增片段PCR扩增反应采用大连宝生物工
程有限公司的试剂盒，反应体系如下：
质粒pSC65 1μl
正、反向引物(PMF，PMR) 各1μl
10×Pyrobest缓冲液 5μl
dNTP混合物(各2.5mM) 5μl
Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μl
ddH2O 37.5μl
PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共
20个循环；72℃7min；4℃。
pE/L、p7.5及多克隆位点扩增片段延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A
Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物BamHI酶切(Takara公司产)。
转移质粒pSKB8R载体BglII酶切(Takara公司产)。用Omega公司E.Z.N.A.
Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收.。二者T4DNALigase(Takara公
司产)连接构建pSKB8RP。
质粒pSKB8RP SacII/BamHI酶切，pH6及下游Neo序列PCR扩增片段(如
前)用SacII/BamHI酶切(Takara公司产)，二者T4DNALigase连接构建转
移质粒pSKB8RPNeo。图5。
实施例二B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTTΔB8RlacZ的构建。
图6。
将痘苗病毒天坛株VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源
重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代
的重组病毒VTTΔB8RlacZ。以0.1~0.01PFU/cell病毒量VTT752-1感染
80％成片CEF细胞吸附1~1.5h后，采用脂质体转染技术(参照美国
INVITROGEN公司Lipofectin试剂盒)将重组质粒pSKB8RLacZ转染CEF
细胞中。48小时后收获重组病毒液，用含200μg/ml X-gal营养琼脂铺
斑，随机挑取孤立蓝斑病毒，连续单斑纯化5代，以待鉴定获得B8R基因
缺失为lacZ所取代的重组病毒VTTΔB8RlacZ。
提取DNA，进行PCR扩增及DOT BLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失
的稳定性，表明VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因缺
失稳定。VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代插入外源基因lacZ
稳定表达。VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代，VTTΔB8RlacZ
传代第5、15代分别感染CEF细胞，检测其样品中β-半乳糖苷酶活性，同
时设立VTT感染细胞对照。第5代β-半乳糖苷酶活测定OD420nm值为3.027，
第15代OD420nm值为2.819。VTT感染细胞对照OD420nm值为0.04。结果表明
VTTΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代插入外源基因lacZ稳定表达.(图
7，图8)和表1。
表1
5passegeVTTΔ
B8RlacZ
15passegeVTTΔ
B8RlacZ
VTT
0.D420nm
3.027
2.819
0.04
重组缺失病毒VTTΔB8RlacZ在CEF、TK-143、CV-1细胞中的繁殖生长曲
线测定，结果表明VTTΔB8RlacZ的生长曲线与VTT生长曲线相似(图90。
B8R基因缺失对重组缺失病毒在细胞中的繁殖复制没有影响。兔皮内毒力
实验表明VTT752-1形成红肿痘疱面积显著大于VTTΔB8RlacZ形成痘疱，
VTT752-1形成红肿痘疱而后出现溃破接痂，VTTΔB8RlacZ形成痘疱无溃
破接痂，VTTΔB8RlacZ形成痘疱消褪较VTT752-1形成痘疱消褪早。B8R
基因缺失显著降低痘苗病毒天坛株病毒毒力。见图10。
实施例三B8R基因缺失表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8RlacZ(B8R基因缺
失为lacZ所取代，TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)
的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗。
即将VTKgpe(TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天
坛株重组痘苗病毒)与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重
组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的
重组病毒VTKgpeΔB8RlacZ。以0.1~0.01PFU/cell病毒量VTKgpe感染80％
成片CEF细胞吸附1~1.5h后，采用脂质体转染技术(参照美国INVITROGEN
公司Lipofectin试剂盒)将重组质粒pSKB8RLacZ转染CEF细胞中。48
小时后收获重组病毒液，用含200μg/ml X-gal营养琼脂铺斑，随机挑
取孤立蓝斑病毒，连续单斑纯化5代，以待鉴定获得B8R基因缺失为lacZ
所取代的重组病毒VTKgpeΔB8RlacZ
提取DNA，进行PCR扩增及DOT BLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失
的稳定性，表明VTKgpeΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代B8R基
因缺失稳定。VTKgpeΔB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代插入外源
基因gagpol env稳定表达。
实施例四B8R基因缺失、表达HIV-1抗原的VTKgpeΔB8R(B8R基因缺
失不带lacZ选择标记，TK区插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基
因)的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗。
再以VTKgpeΔB8RlacZ为亲本株与pSKB8RNeo共转染CEF细胞进行同源重
组，经G418压力筛选、蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺
失不带lacZ选择标记的重组病毒VTKgpeΔB8R。以0.1~0.01PFU/cell病
毒量VTKgpeΔB8RlacZ感染80％成片CEF细胞吸附1~1.5h后，采用脂质
体转染技术(参照美国INVITROGEN公司Lipofectin试剂盒)将重组质粒
pSKB8RNeo转染CEF细胞中。48小时后收获重组病毒液，以400ug/mlG418
压传三代。用含200μg/ml X-gal营养琼脂铺斑，随机挑取孤立白斑病
毒，连续单斑纯化5代，以待鉴定获得B8R基因缺失不带lacZ选择标记
的重组病毒VTKgpeΔB8R。
提取DNA，进行PCR扩增及DOT BLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失
的稳定性，表明VTKgpeΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因缺
失稳定。VTKgpe/ΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代插入外源基因gagpol
env稳定表达。
裸鼠毒力实验表明VTKgpe/ΔB8R毒力较VTKgpe显著降低，腹腔接种VTT
(104pfu)及VTKgpe(106pfu)15天裸鼠死亡，接种VTKgpeΔB8R(107pfu)
裸鼠存活(表2)。胞内IFN-γ.染色流式细胞仪分析、T淋巴细胞增殖、
CTL检测显示B8R基因缺失显著提高表达HIV-1基因的天坛株重组痘苗病
毒特异性细胞免疫(图13，14，15)。
表2
Virus Dose(pfu) Number of death
VTT 102 0/4
103 1/4
104 4/4
VTKgpe 104 0/4
105 0/4
106 3/4
VTKgpeΔB8R 105 0/4
106 0/4
107 0/4
实施例五PCR扩增检测重组病毒VTKgpeΔB8R B8R基因缺失。Western
blot检测VTKgpeΔB8R传代15代插入外源基因gagpol env稳定表达：
提取重组病毒DNA为模板，以引物B8RLF、B8RRR进行PCR扩增。重组病
毒VTKgpeΔB8R由于B8R基因缺失，PCR扩增出1244bp片段，包括B8R
基因外左侧同源序列B8RL片段583bp、右侧同源序列B8RR片段661bp。
而对照VTTDNA为模板扩增出2Kb片段，包括B8R基因外左侧同源序列B8RL
片段583bp、B8R基因818bp、右侧同源序列B8RR片段661bp(图11)。
结果表明VTKgpeΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失。
Dot Blot检测病毒VTKgpeΔB8R基因组中B8R基因，提取痘苗病毒
VTT752-1DNA及重组病毒VTKgpeΔB8R传代15代DNA，以B8R基因地高
辛标记探针进行Dot Blot检测。VTT752-1Dot Blot结果显示杂交印迹
斑点，VTKgpeΔB8R传代15代Dot Blot结果未显示杂交印迹斑点，表明
VTKgpeΔB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失。见图12。
VTKgpeΔB8R感染CEF细胞，48小时后收获细胞和上清，以人多抗血清
(美国国立卫生研究院艾滋病研究和参比试剂项目提供)进行Western
Blot分析，出现了特异的反应条带(gp140，p55)说明所构建的疫苗可以
正确的表达目的基因(图16)。
实施例六、重组痘苗病毒艾滋病疫苗的效果实验：
本例中使用无菌饲养的6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠(体重19-
25克，购自中国药品生物制品检定所)检测本发明疫苗的效力。各DNA
疫苗用1×PBS制备成1mg/ml的注射液。每种免疫组含10只小鼠。免疫
前24小时每只小鼠左右后肢胫骨前肌各注射50ul 25％(w/v)蔗糖高渗
溶液以增加肌肉细胞的通透性，提高摄取质粒效率，同时，蔗糖还有一定
的佐剂的作用。蔗糖处理24小时后，胫骨前肌注射DNA 100ug/只(每后
肢50ug)。每间隔2周以同样剂量加强免疫3次。第6周时1，2组分别
用VTKgpeΔB8R、VTKgpe重组痘苗病毒加强，107pfu/鼠。第4，6周时3，4
组分别用VTKgpeΔB8R、VTKgpe重组痘苗病毒免疫，107pfu/鼠。在第9
周时取血清及脾淋巴细胞检测抗体以及细胞因子。对照使用pCDN A空载
体、不插入目的基因的痘苗病毒天坛株(天花疫苗，由北京生物制品所惠
赠)以及空白鼠对照(表3)。
表3
0 week
2 week
4 week
6 week
DNA+VTKgpeΔ
B8R
pcDNA-syng
ag，
pcDNA-ngp1
20
pcDNA-synga
g，
pcDNA-ngp12
0
pcDNA-synga
g，
pcDNA-ngp12
0
VTKgpeΔB8R
VTKgpeΔB8R
VTKgpeΔB8R
VTKgpeΔB8R
DNA+VTKgpe
pcDNA-syng
ag，
pcDNA-ngpl
20
pcDNA-synga
g，
pcDNA-ngp12
0
pcDNA-synga
g，
pcDNA-ngp12
0
VTKgpe
VTKgpe
VTKgpe
VTKgpe
VTT
VTT
VTT
DNA+VTT
pcDNA
pcDNA
pcDNA
VTT
相关实验及结果如下：
1、血清Gag特异性抗体IgG水平的检测
为检测不同重组痘苗病毒单独免疫和加强免疫所诱导的特异性体液
免疫水平，在第四次免疫后两周及取小鼠血清，用Gag P55抗原(美国国
立卫生研究院艾滋病研究和参比试剂项目惠赠)包被酶标板，间接ELISA
法进行Gag特异性IgG抗体水平的检测。各免疫组Gag特异性IgG抗体滴
度列于表4。
表4
DNA+
VTKgpe
DNA+
VTKgpΔB8R
VTKgΔB8R
VTKgpe
3 week
35481
31622
25600
21134
4 week
31622
51200
25600
25600
2、流式细胞仪检测体外抗原表位肽刺激后分泌IFN-γ的CD8+T淋巴
细胞
CD8+T淋巴细胞是一种最重要的抗病毒效应细胞，所以检测了免疫后
脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的HIV-1特异性CD8+T淋巴细胞。脾淋巴细胞
用MHC-I限制性HIV(gag p24(AMQILKDTI)，V3(SIRIGPGQTF YATGD)and
pol(NPDIVIYQYMDDLYVGSDL，YMDDLYVGSDLEIGQHRTK，KEPPFLWMGY
ELHPDKWTV)刺激12小时后，对细胞内IFN-γ和CD8，CD3分子进行染色，
流式细胞仪(贝克曼·库尔特公司产品)进行分析。DNA+VTKgpeΔB8R
免疫组小鼠脾细胞T淋巴细胞，分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞占脾脏总
CD8+T淋巴细胞的百分比数显著高于DNA+VTKgpe免疫组。VTKgpeΔB8R
免疫组小鼠脾细胞分泌IFN-γ.CD8百分比数显著高于VTKgpe免疫组。
实施例七、B8R基因缺失、表达乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的(B8R
基因缺失插入HBSAg抗原，TK区插入IL-2基因)的天坛株重组痘苗病
毒的乙型肝炎病疫苗的构建。
构建过程：将重组痘苗病毒VTKIL-2(TK区插入IL-2基因)与转移质粒
pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、
鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTKIL-2ΔB8RlacZ。
将HBSAg基因插入转移质粒PSKB8RPNeo中(PSKB8RPNeoSaLI酶切补平，
T4DNA连接酶连接HBSAg基因与PSKB8RPNeo)构建质粒PSKB8RPSNeo，HBSAg
基因置于转移质粒痘苗病毒启动子下。将VTKIL-2ΔB8RlacZ与
PSKB8RPSNeo共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、
鉴定获得B8R基因，缺失lacZ为HBSAg基因所取代的重组病毒VTKIL-2
ΔB8RS。
具体方法参见前述的方法。