糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法.pdf

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1、10申请公布号CN104093832A43申请公布日20141008CN104093832A21申请号201280066298522申请日20121227FERMBP1150820110905201200167020120106JPC12N9/42200601C13K1/0220060171申请人本田技研工业株式会社地址日本东京都72发明人福浦麻衣子光泽茂信竹田汀荒武柴田大辅74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人谢顺星张晶54发明名称糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法57摘要本发明提供一种以较少的使用量即可获得优异的糖化性能的糖化酶组合物以及使用了该糖化。

2、酶组合物的糖化溶液的配制方法。糖化酶组合物对作为基质的木质纤维素类生物质进行糖化处理。糖化酶组合物含有不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的葡萄糖苷酶。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014070786PCT国际申请的申请数据PCT/JP2012/0839432012122787PCT国际申请的公布数据WO2013/103127JA2013071183生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书13页序列表5页PCT/RO/134表1页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书13页序列。

3、表5页PCT/RO/134表1页附图4页10申请公布号CN104093832ACN104093832A1/1页21一种糖化酶组合物，其对作为基质的木质纤维类生物质进行糖化处理，该糖化酶组合物的特征在于，含有不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的葡萄糖苷酶。2根据权利要求1所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述葡萄糖苷酶中含有的纤维素结合结构域由相对所述纤维二糖水解酶中含有的纤维素结合结构域的氨基酸序列、显示了70以上的同源性的氨基酸序列构成。3根据权利要求2所述的糖化酶组合物，其特征在于，该糖化酶组合物进一步含有木聚糖酶或木糖苷酶。4根据权。

4、利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述内切葡聚糖酶是由序列号1表示的氨基酸序列构成的糖化酶。5根据权利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述纤维二糖水解酶是由序列号2表示的氨基酸序列构成的糖化酶。6根据权利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述葡萄糖苷酶是由序列号3表示的氨基酸序列构成的糖化酶。7根据权利要求2或3所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述内切葡聚糖酶是由序列号1表示的氨基酸序列构成的糖化酶，所述纤维二糖水解酶是由序列号2表示的氨基酸序列构成的糖化酶，所述葡萄糖苷酶是由序列号3表示的氨基酸序列构成的糖化酶。8根据权利要求7所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述。

5、内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶的总含量相对所述糖化酶组合物的总质量为30质量80质量的范围。9根据权利要求8所述的糖化酶组合物，其特征在于，所述糖化酶组合物以022510225的质量比范围含有所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶。10一种糖化溶液的配制方法，在作为基质的木质纤维素类生物质中添加糖化酶，制成基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖化溶液，所述糖化溶液的配制方法的特征在于在所述基质中，至少同时添加作为所述糖化酶的不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的葡萄糖苷酶。。

6、11一种糖化溶液的配制方法，在作为基质的木质纤维素类生物质中添加糖化酶，制成基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖化溶液，所述糖化溶液的配制方法的特征在于在所述基质中，至少添加作为所述糖化酶的不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶后，至少添加含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的葡萄糖苷酶。权利要求书CN104093832A1/13页3糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法技术领域0001本发明涉及糖化酶组合物及使用该糖化酶组合物的糖化溶液的配制方法。背景技术0002近年来，人们正在研究将乙醇汽油ETHANOLGASOLINE混合燃料。

7、用作汽车燃料。人们认为在将通过植物性物质的发酵、蒸馏而得到的生物乙醇作为所述乙醇使用时，能够通过严密地进行土壤管理，获得所谓的碳中和效果，减轻二氧化碳的排出量，从而能够有助于防止地球温暖化。0003然而，当例如使用甘蔗SUGARCANE、玉米等农作物作为所述植物性物质时，由于该农作物作为乙醇的原料被大量消耗，因此存在食物或饲料的供应量减少的问题。因此，人们在研究采用不构成食用或饲料用途的木质纤维素类LIGNOCELLULOSETYPE生物质作为所述植物性物质来制造乙醇的技术。0004所述木质纤维素类生物质由于含有纤维素CELLULOSE，通过使用糖化酶对该纤维素进行糖化处理而分解成葡萄糖，使得。

8、到的葡萄糖发酵，能够获得乙醇。以往，作为这种糖化酶，例如已知有来自高纤维素分解酶生产菌ACREMONIUMCELLULOLYTICUS的纤维素酶CELLULASE例如参照专利文献1。0005由于所述糖化酶价格昂贵，在制造所述乙醇中，为了降低该糖化酶的使用量，将作为基质的木质纤维素类生物质调制成低浓度。但是，将所述基质调制成低浓度时，制得的糖化溶液也形成低浓度，进而对该糖化溶液进行发酵而得的乙醇也形成低浓度。其结果是，为了浓缩制得的乙醇而对其进行蒸馏时，存在蒸馏所需时间和热能增加的问题。0006为了解决上述问题，可以考虑采用以下方法通过将所述基质调制成高浓度并同时增加所述糖化酶的使用量，制成高浓。

9、度的乙醇，由此降低乙醇浓缩及蒸馏等所需的能量，从而提高整体的能量效率。然而，在这种情况下，由于所述糖化酶价格昂贵，增加其使用量时，存在成本上升的问题。0007因此，为了解决上述问题，人们希望在维持糖化效率的同时降低糖化酶的使用量。0008现有技术文献0009专利文献0010专利文献1日本专利公开2010148427号公报发明内容0011本发明要解决的技术问题0012但是，在仅仅是降低糖化酶总量的情况下，存在糖化效率与糖化酶的量成比例下降的缺陷。0013本发明的目的在于提供一种能够解决上述缺陷并在较少的使用量下即可获得优异糖化性能的糖化酶组合物。说明书CN104093832A2/13页40014。

10、另外，本发明的目的还在于提供一种使用了所述糖化酶组合物的糖化溶液的调制方法。0015解决技术问题的技术手段0016本发明的发明者们经研究发现从高纤维素分解酶生产菌中提取的纤维素酶CELLULASE是一种由各种纤维素酶构成的混合物，在木质纤维素类生物质的糖化中不显示优异效果的纤维素酶也包含其中。0017因此，仅仅是降低所述纤维素酶的混合物总量，在木质纤维素类生物质的糖化中显示出优异效果的纤维素酶以及不显示优异效果的纤维素酶一律减少，糖化效率与糖化酶的量成比例下降。0018本发明的发明者们对所述纤维素酶的混合物中含有的各纤维素酶针对木质纤维类生物质的糖化性能进行了各种研究。其结果是，发现由特定的纤。

11、维素酶的组合构成的糖化酶组合物在木质纤维类生物质的糖化中显示了优异的性能，从而完成了本发明。0019即，本发明的特征在于，在对作为基质的木质纤维类生物质进行糖化处理的糖化酶组合物中含有不含纤维素结合结构域CELLULOSEBINDINGDOMAIN的内切葡聚糖酶ENDOGLUCANASE、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶CELLOBIOHYDROLASE以及含纤维素结合结构域的葡萄糖苷酶GLUCOSIDASE。0020这里，所述内切葡聚糖酶是将纤维素从该纤维素的内部区域水解成较为短链的1,4葡聚糖的糖化酶。另外，所述纤维二糖水解酶是将纤维素或较为短链的1,4葡聚糖从该纤维素或较为短链的1,4。

12、葡聚糖的末端水解成纤维二糖CELLOBIOSE的糖化酶。另外，所述葡萄糖苷酶是将纤维二糖水解成葡萄糖GLUCOSE的糖化酶。纤维素结合结构域是指用于让糖化酶与纤维素的表面结合的结构。0021根据本发明的糖化酶组合物，首先，所述内切葡聚糖酶对木质纤维素类生物质产生作用。由于所述内切葡聚糖酶不含纤维素结合结构域，因而不与作为基质的木质纤维素类生物质中含有的纤维素的表面特定部位结合，而在所述纤维素的分子链的较大范围内与不特定部位接触，从而能够产生较为短链的1,4葡聚糖。0022另一方面，如果内切葡聚糖酶含有纤维素结合结构域，则该内切葡聚糖酶即使将纤维素水解成较为短链的1,4葡聚糖后，也只是停留在该水。

13、解的反应部位内。其结果是，内切葡聚糖酶与其他的纤维素接触的机会下降，导致生成较为短链的1,4葡聚糖的效率下降。0023由于所述纤维二糖水解酶含有纤维素结合结构域，因而该纤维二糖水解酶通常与纤维素结合，从纤维素的末端对该纤维素进行水解，生成纤维二糖。而当较为短链的1,4葡聚糖存在时，所述纤维二糖水解酶与较为短链的1,4葡聚糖也发生结合，从该1,4葡聚糖的末端进行水解，产生纤维二糖。因此，通过所述内切葡聚糖酶产生较为短链的1,4葡聚糖时，所述纤维二糖水解酶的反应开始点增大，该纤维二糖水解酶促进纤维二糖的生成。0024另外，由于所述葡萄糖苷酶也含有纤维素结合结构域，在所述纤维二糖水解酶生成纤维二糖时。

14、的反应部位中，该葡萄糖苷酶也存在。因此，能够通过葡萄糖苷酶将通过所述纤维二糖水解酶生成的纤维二糖快速地水解成葡萄糖。0025因此，根据本发明的糖化酶组合物，所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及说明书CN104093832A3/13页5所述葡萄糖苷酶共同协作，对作为基质的木质纤维素类生物质中含有的纤维素进行糖化，由此能够提高糖化效率，用较少的使用量即可获得优异的糖化性能。0026另外，本发明的糖化酶组合物的所述葡萄糖苷酶中含有的纤维素结合结构域，优选是相对所述纤维二糖水解酶中含有的纤维素结合结构域的氨基酸序列显示70以上的同源性的氨基酸序列构成。0027纤维素结合结构域的氨基酸序列的同源性越。

15、高，与纤维素或较为短链的1,4葡聚糖的表面结合时在同一部位上结合的几率越大。因此，当采用含有氨基酸序列具有70以上的同源性的纤维素结合结构域的所述纤维二糖水解酶及所述葡萄糖苷酶时，在该纤维二糖水解酶生成纤维二糖时，该葡萄糖苷酶存在于相同的反应部位中的几率增大。0028因此，根据本发明的糖化酶组合物，所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶共同协作，能够更为高效地进行糖化。0029另一方面，当所述同源性不足70时，所述纤维二糖水解酶和所述葡萄糖苷酶无法充分地存在于相同的反应部位。0030在本发明的糖化酶组合物中，优选是所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶相对该糖化。

16、酶组合物总质量的总含量是30质量80质量的范围。0031当所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶相对所述糖化酶组合物的总质量的总含量是80质量以上时，所述糖化酶组合物的糖化效率反而下降。因此，所述糖化酶组合物优选含有木聚糖酶XYLANASE等半纤维素酶HEMICELLULASE。另外，当所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶相对所述糖化酶组合物的总质量的总含量不足30质量时，该糖化酶组合物无法获得足够的糖化性能。0032作为本发明的糖化酶组合物的所述内切葡聚糖酶，例如可以举出通过由序列号1表示的氨基酸序列构成的糖化酶。另外，作为本发明的糖化酶组合物的所述纤维二糖。

17、水解酶，例如可以举出通过由序列号2表示的氨基酸序列构成的糖化酶。此外，作为本发明的糖化酶组合物的所述葡萄糖苷酶，例如可以举出通过由序列号3表示的氨基酸序列构成的糖化酶。0033另外，本发明的糖化酶组合物优选是以质量比022510225的范围含有所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶。0034当所述内切葡聚糖酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比不足02时，纤维素通过所述内切葡聚糖酶生成较为短链的1,4葡聚糖时的生成速度相对较为短链的1,4葡聚糖通过所述纤维二糖水解酶生成纤维素时的生成速度过小，无法获得足够的糖化效果。0035而另一方面，当所述内切葡聚糖酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比。

18、超过25时，纤维素通过所述内切葡聚糖酶生成较为短链的1,4葡聚糖时的生成速度相对较为短链的1,4葡聚糖通过所述纤维二糖水解酶生成纤维素时的生成速度过大，无法获得足够的糖化效果。0036另外，当所述葡萄糖苷酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比不足02时，纤维说明书CN104093832A4/13页6二糖通过所述葡萄糖苷酶生成葡萄糖时的生成速度相对较为短链的1,4葡聚糖通过所述纤维二糖水解酶生成纤维二糖时的生成速度过小，无法获得足够的糖化效果。0037而另一方面，当所述葡萄糖苷酶相对所述纤维二糖水解酶的质量比超过25时，纤维二糖通过所述葡萄糖苷酶生成葡萄糖时的生成速度相对较为短链的1,4葡聚糖通过所述。

19、纤维二糖水解酶生成纤维二糖时的生成速度过大，无法获得足够的糖化效果。0038另外，本发明的糖化酶组合物可以进一步含有木聚糖酶或木糖苷酶XYLOSIDASE。通过含有木聚糖酶或木糖苷酶，所述糖化酶组合物能够将作为基质的木质纤维素类生物质中含有的半纤维素糖化，从而获得木糖XYLOSE。因此，能够提升作为基质的木质纤维素类生物质的糖化率。0039另外，本发明的糖化溶液的配制方法是在作为基质的木质纤维素类生物质中添加糖化酶，制成基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖化溶液，该糖化溶液的配制方法的特征在于在所述基质中，至少同时添加作为所述糖化酶的不含纤维素结合结构域的内切葡。

20、聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的葡萄糖苷酶。0040像这样同时添加糖化酶时，首先所述内切葡聚糖酶与木质纤维素类生物质中含有的纤维素发生作用。由于所述内切葡聚糖酶不含纤维素结合结构域，在被添加到所述基质中时，不与所述纤维素的表面的特定部位结合，而在该纤维素的分子链的较大范围内与不特定部位接触，生成较为短链的1,4葡聚糖。0041由于所述纤维二糖水解酶含纤维素结合结构域，因而该纤维二糖水解酶通常与纤维素结合，对该纤维素从该纤维素的末端进行水解，从而生成纤维二糖。而当较为短链的1,4葡聚糖存在时，所述纤维二糖水解酶与较为短链的1,4葡聚糖也发生结合，从该1,4葡聚糖。

21、的末端进行水解，生成纤维二糖。因此，通过所述内切葡聚糖酶产生较为短链的1,4葡聚糖时，所述纤维二糖水解酶的反应开始点增大，该纤维二糖水解酶促进纤维二糖的生成。0042另外，由于葡萄糖苷酶也含纤维素结合结构域，在所述纤维二糖水解酶生成纤维二糖时的反应部位中，该葡萄糖苷酶也同时存在。所以，能够通过葡萄糖苷酶将通过所述纤维二糖水解酶生成的纤维二糖快速地水解成葡萄糖。0043根据本发明的糖化溶液的配制方法，由于所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶和所述葡萄糖苷酶共同协作，对木质纤维素类生物质中含有的纤维素进行糖化，因此能够高效地制得糖浓度较高的糖化溶液。0044另外，本发明的糖化溶液的配制方法是在作为。

22、基质的木质纤维素类生物质中添加糖化酶，制成基质和糖化酶混合物，对所述基质和糖化酶混合物进行糖化处理，从而制得糖化溶液，该糖化溶液的配制方法的特征在于在所述基质中至少添加作为所述糖化酶的不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶后，至少添加含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的葡萄糖苷酶。0045像这样在先添加所述内切葡聚糖酶时，所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶不存在于所述内切葡聚糖酶的反应部位中。因此，由于先被添加的所述内切葡聚糖酶相对纤维素的分子链能够高效地进行接触，能够优先对木质纤维素类生物质中含有的纤维说明书CN104093832A5/13页7素进行水解，从而生成较为短链。

23、的1,4葡聚糖。0046这样，与同时添加所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶的情形相比，在添加所述纤维二糖水解酶和所述葡萄糖苷酶时，较为短链的1,4葡聚糖的数量增加。因此，所述内切葡聚糖酶能够简单地将所述较为短链的1,4葡聚糖水解成纤维二糖。0047另外，所述葡萄糖苷酶因纤维素结合结构域的作用而存在于基于所述纤维二糖水解酶的水解的反应部位中，因此能够高效地对所述纤维二糖进行水解，从而生成葡萄糖。0048因此，根据本发明的糖化溶液，通过先添加所述内切葡聚糖酶，然后添加所述纤维二糖水解酶和所述葡萄糖苷酶，能够进一步高效地制成糖浓度高的糖化溶液。附图说明0049图1是表示本发明的糖。

24、化溶液的配制方法的一个实施方式的流程图。0050图2是表示能够提取本发明的糖化酶组合物的菌株的菌落直径和AZCL晕直径的图表。0051图3是表示能够提取本发明的糖化酶组合物的菌株的CMC分解活性的图表。0052图4是表示本发明的糖化酶的糖化性能的图表。0053图5是表示相对本发明的糖化酶组合物总质量的含量对葡萄糖生成产生的影响的研究结果的图表。0054图6是表示本发明的糖化酶组合物中的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶以及木糖苷酶XYLOSIDASE的质量比对糖生成产生的影响的研究结果的图表。具体实施方式0055接着，参照附图就本发明的实施方式进行进一步详细说明。0056图1中。

25、表示使用作为基质的木质纤维素类生物质制造乙醇时的糖化处理步骤。0057在上述糖化处理中，首先，对作为基质的木质纤维素类生物质中的一种的稻秆进行粗粉碎，将氨水混合到被粗粉碎的稻秆中，制成含稻秆和氨的基质混合物。这里，所述氨水的浓度范围是20质量/体积30质量/体积。所述基质混合物优选是相对所述氨水含有20质量70质量范围的稻秆。0058接着，在25100范围的温度下，将制成的所述基质混合物保持2小时200小时范围，实施糖化前处理。其结果是，木质素LIGNIN从作为所述基质的稻秆中解离或者稻秆湿润膨胀，从而获得含氨糖化前处理物。0059另外，在本实施方式中，解离是指与纤维素等结合的木质素的结合部位。

26、中，至少一部分结合被切断的现象。另外，湿润膨胀是指构成结晶性纤维素的纤维素等因液体侵入而产生空隙、或者在纤维素纤维内部产生空隙而膨胀的现象。0060然后，从所述含氨糖化前处理物中释放出氨，将氨分离，从而制得氨分离糖化前处理物。接着，将氨分离糖化前处理物的PH调整到糖化酶能够起作用的范围，例如PH3PH7的范围。说明书CN104093832A6/13页80061接着，向所述被调整了PH的所述氨分离糖化前处理物中添加糖化酶，调制基质和糖化酶混合物，并将该基质和糖化酶混合物在3060温度范围内保持50小时150小时，进行糖化处理。通过所述糖化处理，所述基质和糖化酶混合物中含有的纤维素因所述糖化酶的作。

27、用被水解。其结果是，能够得到含葡萄糖等糖的糖化溶液。0062这里，在本实施方式的糖化溶液的配制方法中，采用下述糖化酶组合物作为所述糖化酶。该糖化酶组合物含有不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的葡萄糖苷酶。0063本实施方式中使用的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶例如可以通过下述方法制得。0064首先，作为变异前培养步骤，将高纤维素分解酶生产菌ACREMONIUMCELLULOLYTICUSTN菌株独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号FERMBP685，以下简记作“TN菌株”植菌到具有表1中所示组成。

28、的培养液中，在30下培养一晚。接着，作为变异处理步骤，将上述培养后的TN菌株涂敷到具有表2中所示组成的固体培养基的表面上，通过照射紫外线，获得变异处理菌株。然后，作为变异后培养步骤，在30温度下培养所述变异处理菌株7天。0065表10066组成浓度质量/体积稻秆50KH2PO402NH42SO4014尿素04聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯01MGSO47H2O003ZNSO47H2O0007MNSO46H2O0001CUSO47H2O00050067表20068组成浓度质量/体积稻秆10说明书CN104093832A7/13页9AZCLHE纤维素002醋酸缓冲溶液PH420MM琼脂200069这里，。

29、作为所述固体培养基含有的生色底物的AZCLHECELLULOSE商品名称MEGAZYME公司制造是被糖化酶分解时生色成蓝色的物质。因此，所述变异处理菌株通过所述培养产生糖化酶时，AZCLHECELLULOSE被该糖化酶分解，在该变异处理菌株的菌落COLONY周围形成蓝色圆以下称“AZCL晕AZCLHALO”，该蓝色圆的大小对应该生成的糖化酶的量。0070因此，将所述AZCL晕的大小最大的菌落作为菌种，在再次重复所述变异前培养步骤、变异处理步骤及变异后培养步骤后，根据获得的菌落的大小及其周围形成的AZCL晕的大小选择多个所述菌落。0071接着，将前述选择的菌落的菌株及TN菌株植菌到新的所述固体培。

30、养基中，在30下培养7天。测定菌落直径及AZCL晕直径，同时计算出AZCL晕直径/菌落直径的数值。0072另外，将所述选择的菌落的菌株及TN菌株植菌到新的所述培养液中，在30下进行培养，在PH55及30的条件下开始培养，然后分别测定在第7天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天及第17天的羧甲基纤维素CMC的分解活性。所述CMC分解活性通过以下方式测定。0073首先，在10L的含糖化酶的水溶液试料中，加入190L的200MM的醋酸缓冲溶液PH55和200L的1质量/体积的CMCMERCK公司制造，型号1023310500水溶液，在30的温度下让其反应15分钟。0074然后，在所述反。

31、应后的溶液中加入400L的含有30质量/体积的酒石酸钠钾ROCHELLESALT、1质量/体积的二硝基水杨酸DINITROSALICYLICACID以及16质量/体积的氢氧化钠的水溶液,在100下处理5分钟。接着，测定制得的溶液相对波长540NM的光线的吸光度，将葡萄糖作为标准物质，计算出洗脱后的还原糖的浓度。这里，将1分钟释放出1MOL的还原糖的酶量设定为1U。0075并且，从所述挑选的菌落中选出所述计算出的AZCL晕直径/菌落直径的数值最大以及CMC分解活性的数值最大的菌落，作为高纤维素分解酶生产菌H1菌株独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号FERMP22164，以下简记。

32、作“H1菌株”，并作为本实施方式中用于提取糖化酶组合物的菌株。0076H1菌株及TN菌株的菌落的直径、AZCL晕直径以及AZCL晕直径/菌落直径的数值示于图2中。另外，将H1菌株和TN菌株的CMC分解活性值的历时变化示于图3中。0077从图2A中明显可知H1菌株的菌落与TN菌株的菌落相比，AZCL晕直径增大。因此，显然H1菌株与TN菌株相比生成较多糖化酶。0078另外，从图2B中明显可知H1菌株的菌落与TN菌株的菌落相比，AZCL晕直径/菌落直径的数值大约是两倍。因此，显然H1菌株相对TN菌株而言，每个菌株的糖化酶活性较高。0079另外，从图3中明显可知H1菌株与TN菌株相比，在培养期间的任一。

33、期间中，CMC说明书CN104093832A8/13页10分解活性明显增高。由于CMC分解活性是作为表示纤维素分解活性的指标使用的，因此H1菌株相对TN菌株而言，显然更能够生成优异的糖化酶。0080接着，对从H1菌株中提取在本实施方式中使用的作为糖化酶的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及葡萄糖苷酶的方法进行说明。0081首先，在具有表3中所示组成的培养液中植菌H1菌株，在30下培养14天。并且，用孔径02M的过滤器对实施了所述培养的培养液进行过滤。0082表30083组成浓度质量/体积氨分离糖化前处理物50NH42SO405尿素04KH2PO424MGSO47H2O012ZNSO47H2O000。

34、1MNSO46H2O0001CUSO47H2O0001聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯010084接着，通过填充了阴离子交换载体商品名称TOYOPEARLQAE550C，东曹公司TOSOHCORPORATION制造的第一分离柱SEPARATIONCOLUMN商品名称BIORAD层析柱ECONOCOLUMN，BIORADLABORATORIES株式会社制造，直径50CM长度500CM将获得的过滤液分离，对应洗脱时间获得馏分FRACTIONQ1Q12。0085然后，在50下对获得的所述馏分Q1加热处理24小时后，进行离心分离9460G，20分钟，用孔径02M的过滤器对获得的上清液过滤。用第二分离柱商品名称。

35、MONOS550L柱，GEHEALTHCAREJAPAN株式会社制造对获得的过滤液进行分离，对应洗脱时间获得馏分S1S9。然后，从所述馏分S3中获得不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶。所述内切葡聚糖酶是通过由序列号1表述的氨基酸序列构成的糖化酶。0086接着，用填充了疏水性载体商品名称TOYOPEARLBUTYL650M，东曹公司制造的第三分离柱商品名称XK26/20柱，GEHEALTHCAREJAPAN株式会社制造，直径26CM长度20CM对所述馏分Q3进行分离，对应洗脱时间获得馏分B1B8。0087然后，从所述馏分B7中获得含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶。所述纤维二糖水解酶是通过由序列。

36、号2表述的氨基酸序列构成的糖化酶。另外，从所述馏分B8中获得含纤维素结合结构域的葡萄糖苷酶。所述葡萄糖苷酶是通过由序列号3表述的氨说明书CN104093832A109/13页11基酸序列构成的糖化酶。0088通过上述方式得到的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶的氨基酸序列，使用PFAM数据库作为MOTIF文库MOTIFLIBRARY对纤维素结合结构域进行同源性检索。0089其结果，判明了所述纤维二糖水解酶的序列号2表述的氨基酸序列中第497号至第529号的氨基酸序列是纤维素结合结构域。并判明了所述葡萄糖苷酶的序列号3表述的氨基酸序列中第780号至第812号的氨基酸序列是纤维。

37、素结合结构域。判明所述内切葡聚糖酶不含纤维素结合结构域。0090接着，例如采用NCBINATIONALCENTERFORBIOTECHNOLOGYINFORMATION站点的BLAST检索对所述纤维二糖水解酶和所述葡萄糖苷酶的纤维素结合结构域的氨基酸序列进行同源性评价时，发现具有24/33、即727的同源性。0091氨基酸序列的同源性越高，纤维素结合结构域与纤维素或较为短链的1,4葡聚糖的表面结合时，在同一部位上结合的几率增大。因此，通过使用含有氨基酸序列具有727的同源性的纤维素结合结构域的所述纤维二糖水解酶和所述葡萄糖苷酶，在该纤维二糖水解酶生成纤维二糖时，该葡萄糖苷酶在相同的反应部位存在。

38、的几率增大。0092所以，根据本实施方式的糖化酶组合物，所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶能够共同协作，从而更为高效地进行糖化。0093本实施方式的糖化酶组合物被设定成通过所述方式制得的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶相对所述糖化酶组合物总质量的总含量是30质量80质量的范围。另外，本实施方式的糖化酶组合物采用通过所述方式制得的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶以质量比022510225的范围的组合。0094在本实施方式的糖化溶液的配制方法中，与构成所述糖化酶组合物的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶同时添加被调。

39、整了PH的所述氨分离糖化前处理物。0095通过采用这种方式，由于所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶及所述葡萄糖苷酶能够共同协作，对木质纤维素类生物质中含有的纤维素进行糖化，从而能够效率良好地制得葡萄糖等糖浓度高的糖化溶液。0096在本实施方式中，与构成所述糖化酶组合物的所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶及所述葡萄糖苷酶同时添加被调整了PH的所述氨分离糖化前处理物。但是，也可以先只将所述内切葡聚糖酶添加到被调整了PH的所述氨分离糖化前处理物中，在进行规定时间的酶糖化处理之后，再添加所述纤维二糖水解酶和所述葡萄糖苷酶。0097根据本发明的糖化溶液的配制方法，通过先添加所述内切葡聚糖酶，再添加所。

40、述纤维二糖水解酶和所述葡萄糖苷酶，能够进一步高效地制得糖浓度高的糖溶液。0098另外，本实施方式中，采用了仅由不含纤维素结合结构域的内切葡聚糖酶、含纤维素结合结构域的纤维二糖水解酶以及含纤维素结合结构域的葡萄糖苷酶构成的糖化酶组合物。但是，该糖化酶组合物还可以进一步含有木聚糖酶或木糖苷酶。0099通过含有木聚糖酶或木糖苷酶，由于能够将木质纤维素类生物质中含有的半纤维素酶糖化成木糖，能够提高木质纤维素类生物质的糖化率。说明书CN104093832A1110/13页120100接着，示出本发明的实施例及比较例。0101实施例0102实施例10103在本实施例中，首先在对作为基质的木质纤维素类生物质。

41、、即稻秆进行了细碎后的材料中，以质量比成为125的形式混合25质量的氨水，制得含有稻秆及氨的基质混合物。接着，在80温度下保持所述基质混合物8小时，进行糖化处理。然后，分离氨，并将PH调整成40。并且调整稻秆含量成为20体积，从而制成本实施例的糖化前处理物。0104接着，以031031007的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶、由序列号3表述的氨基酸序列构成的葡萄糖苷酶、木聚糖酶湿热子囊菌THERMOASCUSAURANTIACUS来源的内切1,4木聚糖酶ENDO1,4BETAXYLANASEA,GENBANKACCESSI。

42、ONNOAAF24127以及木糖苷酶海栖热袍杆菌THERMOTOGAMARITIMA来源的木糖苷酶XYLOSIDASE,株式会社耐热性酶研究所制造，调制成糖化酶组合物。将该糖化酶组合物加入到所述前处理物中，使得该糖化酶组合物的最终浓度成为2MG/1G稻秆。并在50温度下，糖化处理72小时，制成糖化处理物。这里，使用特定的菌来源的木聚糖酶以及木糖苷酶。但是，只要是具有内切木聚糖酶活性和木糖苷酶活性的糖化酶，可以使用任意一种糖化酶。接着，在95温度下对所述糖化溶液热处理5分钟后，在15,760G以及4温度下，离心分离5分钟后，将上清液移入新的15ML的微量离心管EPPENDORFTUBE中。在用孔。

43、径02M的过滤器进行过滤后，通过HPLC测定糖浓度。0105所述高效液相色谱HPLC采用隔离器SEPARATOR商品名称WATERS2695，日本WATERS株式会社制造、RI检测器商品名称WATERS2414，日本WATERS株式会社制造以及分离柱商品名称HPX87PCOLUMN，BIORADLABORATORIES株式会社制造，在柱温度85，检测器温度40的条件下，以超纯水为洗脱液ELUENT，并以06ML/MIN的流量测定糖浓度。结果示于图4。图4中将葡萄糖和木糖的总糖浓度作为糖浓度进行表示。0106比较例10107在本比较例中，除了使用市售的糖化酶商品名称高纤维素分解酶生产菌ACREM。

44、ONIUMCELLULOLYTICUS，MEIJISEIKAPHARMA株式会社制造以外，其余的以与实施例1完全相同的方式配制糖化溶液，测定该糖化溶液的葡萄糖浓度。结果示于图4中。0108如图4所示，使用由所述内切葡聚糖酶、所述纤维二糖水解酶以及所述葡萄糖苷酶构成的糖化酶组合物，制成的实施例中的糖化溶液的糖浓度是38质量/体积，使用所述高纤维素分解酶生产菌商品名称制成的比较例的糖化溶液的糖浓度是23质量/体积。0109所以，明显可知实施例的糖化酶组合物与比较例的糖化酶组合物相比，通过规定时间的酶糖化处理，制成的糖化溶液中的糖浓度能够增加到大约17倍。换言之，由于实施例中的糖化酶组合物相对比较例。

45、中的糖化酶的容量少17倍，能够制成同等糖浓度的糖化溶液，明显可知在较少的糖化酶使用量下，就能够获得优异的糖化性能。0110实施例20111接着，对本发明的酶的总含量进行了研究。说明书CN104093832A1211/13页130112实施例210113在本实施例中，以03103的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶以及由序列号3表述的氨基酸序列构成的葡萄糖苷酶，调制糖化酶组合物使得其相对整体酶质量是351，除此以外，通过与实施例1完全相同的方式进行糖化处理，制成糖化处理物，测定了葡萄糖浓度。结果示于图5中。0114实施例220。

46、115在本实施例中，将由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶以及由序列号3表述的氨基酸序列构成的葡萄糖苷酶，调制糖化酶组合物使得其相对整体酶质量是567，除此以外，通过与实施例21完全相同的方式进行糖化处理，制成糖化处理物，测定了葡萄糖浓度。结果示于图5中。0116实施例230117在本实施例中，将由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶以及由序列号3表述的氨基酸序列构成的葡萄糖苷酶，调制糖化酶组合物使得其相对整体酶质量是784，除此以外，通过与实施例21完全相同的方式进行糖化处理，制成糖。

47、化处理物，测定了葡萄糖浓度。结果示于图5中。0118比较例210119在本比较例中，将由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶以及由序列号3表述的氨基酸序列构成的葡萄糖苷酶，调制糖化酶组合物使得其相对整体酶质量是135，除此以外，通过与实施例21完全相同的方式进行糖化处理，制成糖化处理物，测定了葡萄糖浓度。结果示于图5中。0120比较例220121在本比较例中，将由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶以及由序列号3表述的氨基酸序列构成的葡萄糖苷酶，调制糖化酶组合物使得其相对整体酶质量是10。

48、0，除此以外，通过与实施例21完全相同的方式进行糖化处理，制成糖化处理物，测定了葡萄糖浓度。结果示于图5中。0122如图5和比较例21中所示，加入的本发明的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及葡萄糖苷酶的比率少至整体酶质量的135时，糖化处理物中的葡萄糖浓度示出的是数值较低的20。由于酶浓度低，认为糖化效率较差。0123另外，本发明的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及葡萄糖苷酶的合计含量并不是越高越好。如比较例22中所示，调制糖化酶组合物使其成为相对整体酶质量的100时，糖化处理物中的葡萄糖浓度反而降低到15。0124木质纤维素类生物质由纤维素和以覆盖纤维素表面的形式存在的半纤维素构成。可以认为因半纤维。

49、素的存在，半纤维素的分解得到促进，高效地进行糖化，能够在短时间内增加糖化处理物中的糖浓度。因此，由于不仅内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及葡萄糖苷酶存在，木聚糖酶等半纤维素酶也存在，从而能够高效地实施糖化处理。0125因此，本发明的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及葡萄糖苷酶的总含量优选是30质量80质量的范围。所述酶的总含量只要处于该范围内，糖化处理物中的葡萄糖浓度在大约24以上，效率良好。说明书CN104093832A1312/13页140126实施例30127以下，对糖化酶组合物的各酶的质量比进行了研究。0128实施例310129以021020202的质量比，混合由序列号1表述的氨基酸序列构成的内切葡聚糖酶、由序列号2表述的氨基酸序列构成的纤维二糖水解酶、由序列号3表述的氨基酸序列构成的葡萄糖苷酶、木聚糖酶以及木糖苷酶，调制糖化酶组合物。将该糖化酶组合物添加到所述前处理物中，使得该糖化。