毛囊重建系统及其载体动物 【技术领域】
本发明涉及承载毛囊重建系统的实验动物、制备该系统的细胞系以及该系统的应用。
背景技术
可使针对特定目的的动物反应稳定再现的多种多样的嵌合动物或转基因动物主要是作为特定疾病的模型、或者为了阐明特定疾病的病因而开发的。例如为了测定毛发的重建，开发了一起移植了毛芽(作为特殊的角质形成细胞簇存在于新生幼小鼠皮肤中的毛囊前身细胞)和毛发诱生性毛乳头细胞(来自大鼠的须毛)的裸鼠(Lichti等，J.InvestDermatol 101：124-129，1993)。
在移植了来自新生幼小鼠毛芽的培养角质形成细胞和毛乳头细胞的小鼠中，通过对其移植区域的组织学分析，检测出完全组织化了的上皮以及毛囊地重建(Kamimura等，J.Invest Dermatol 109：534-540，1997)。显示所述重建毛囊可用于对体内诱生毛发可信性的功能性测定。
另一方面，与诱生毛发可以相提并论的有毛色。多数情况下，毛色被视为由黑素导致，该黑素由存在于毛母质附近的黑素细胞产生、再转运到形成毛的细胞中。变成白发的主要原因可能是上述黑素细胞不再产生黑素，或即使产生黑素也只是极少量，或者黑素细胞减少甚至消失。但是，考虑到毛发周期，经过过渡期(毛生长停止，毛囊缩短以及形成杵状毛)和休止期，毛囊中剧减或消失的黑素细胞在下一个生长期如何补充并恢复毛色(来自哪里)等问题尚未明确。
因此，提供评价恢复毛色的手段，换言之，提供对某种特定的手段能否发挥防止白发或抗白发作用的体内评价系统，这是有价值的。本发明的目的就在于提供所述评价系统。本说明书中所述“抗白发性”或“抗白发作用”是可对例如以选自促进黑素细胞生长、促进游走能力、促进分化能力、增进生存能力、黑素产生能力等中的一种以上活性来评价的白发化进行抑制的特性，是通过毛色显示这些活性的性质。
发明的公开
本发明人为了实现上述目的进行了研究，证实上述毛囊得到重建，并发现：所述重建的毛囊加入同种或不同种任意的外源黑素细胞都可重建，且这样重建的毛囊的黑素细胞可保持活性状态。
从而，本发明提供用于重建毛囊的系统，所述毛囊由毛乳头细胞和表皮细胞、以及相对于这些细胞的外源黑素细胞组合构成。
本发明的一个实施形式可提供：将上述系统移植到受体动物，使其承载上述重建毛囊的嵌合动物。
本发明的另一个实施形式还提供某种特定手段活化黑素细胞的能力进行评价的方法，其特征在于：以上述嵌合动物为受试动物，将该受试动物用某种特定手段处理，监测这样处理过的受试动物重建毛囊中黑素细胞的活性，将相对于未经处理的对象的该活性变化程度与该手段活化黑素细胞的能力之间建立相关关系。
附图简述
图1是显示例II-2中制备的嵌合小鼠的背部状态的照片，以该照片作为附图。图中的数字分别表示试验编号。
图2表示在例III的几种因子作用下，本发明的嵌合小鼠的再生毛中黑素含量变化的图表。
实施发明的最佳形式
本说明书中，“毛乳头细胞(真皮乳头dermal papillae)”(以下可称为DP)只要遵循本发明的目的，可作为表示包含毛囊最下部的毛乳头细胞及其周围的细胞和组织的广泛概念的细胞使用。这样的组织有含有毛乳头细胞的真皮。以来自小鼠的细胞为例，将多能聚糖启动子的下游连接适当的报道基因(例如LacZ基因、绿色荧光蛋白(GFP)的结构基因)构成表达载体，导入小鼠，生成转基因小鼠(Ver-LacZ)，该转基因小鼠生出的新生幼小鼠(在出生后4天以内使用)中，以报道基因的表达为标志可获得上述细胞。另外按照常规方法从皮肤中获得的真皮通常含有毛乳头细胞，因此含有毛乳头细胞的真皮可直接作为本发明的毛乳头细胞使用。但并不局限于此。
而“表皮细胞”是构成皮肤的表皮或上皮的大部分的细胞，由邻接真皮的一层基底细胞产生。以小鼠为例，所述表皮细胞可优选使用来自新生幼鼠(或胎鼠)的表皮细胞，也可以是角质形成细胞形式的细胞培养物。所述细胞可以按照公知的方法由所需供体动物的皮肤制备。
上述毛乳头细胞或含毛乳头细胞的真皮细胞和表皮细胞只要可移植到受体动物上即可，无关供体动物的种类，均可使用，但优选来自与受体动物同种的动物。受体动物为小鼠时，上述两种细胞可以均来自小鼠，也可来自不相同的小鼠系，对此并无特别限定。因此，毛乳头细胞或含有毛乳头细胞的真皮细胞可以由容易确认的上述任意的转基因小鼠(Ver-LacZ系统)中获得，而表皮细胞可使用从例如选自具白化病(具有酪氨酸酶遗传性缺陷)性质的ICR系和黑素细胞缺损系(例如Wsh/Wsh小鼠)的小鼠中获得的细胞。根据本发明，由于使用来自所述具白化或黑素细胞缺损性的动物的表皮细胞，可更容易地监测后述的外源黑素细胞的动向，因而优选。另外，上述转基因小鼠也可以是来自选自ICR系和黑素细胞缺损系的小鼠。
本说明书的“外源黑素细胞”中的“外源”是指来源与毛乳头细胞或表皮细胞的来源不同。因此，黑素细胞不仅包含来自与毛乳头细胞或表皮细胞的来源不同的不同种动物的细胞，还包含即使是同种同系，但来自与采集毛乳头细胞或表皮细胞的个体不同的个体的细胞。这意味着，即使毛乳头细胞或表皮细胞制备物中混有原有的黑素细胞，在该黑素细胞以外追加的黑素细胞必须包含在目标系中。
但是，毛乳头细胞或表皮细胞来自小鼠时，黑素细胞优选小鼠以外的动物，例如来自人，但并不局限于此。使用上述优选的组合，则可以在重建毛囊中无关黑素细胞的分化状态而追踪黑素细胞的分布(例如使用抗人黑素细胞抗体或人的特异性抗体或人的特异性基因序列或人黑素细胞的特异性基因序列)。本发明的特征在于：在由毛乳头细胞(小鼠)、表皮细胞(小鼠)和黑素细胞(人)构成的所谓嵌合重建毛囊中，黑素细胞可保持其活性(例如黑素产生活性)。另外，本发明还具备的特征是：在后述的评价方法中，可对可作用于人黑素细胞的手段进行研究。
本发明中可使用的黑素细胞只要是遵循本发明的目的，具有黑色素产生能力即可，可以是来自任意种的动物，但如上所述，为了发挥上述特征，优选来自人的黑素细胞。黑素细胞可以按照公知的方法从适当的组织例如表皮、包皮等中制备。还可以使用市售的商品细胞。例如来自人的培养黑素细胞可以从Cascade公司或kurabo公司购入NHEM细胞。
如上所述，上述毛乳头细胞和表皮细胞优选来自与受体动物同种的动物，可达到本发明目的的所述动物具体有小鼠、大鼠。
本发明的“用于重建毛囊的系统”由上述毛乳头细胞和表皮细胞以及外源黑素细胞组合构成。所述“组合构成的……系统”不仅指含有全套上述各细胞的情况，也包含以今后成套使用为目的、各细胞分别保存的情况，例如分别装入不同容器的形式。因此只要是为了重建上述系统的目的而使用，均在本发明的范围内。另外，“重建毛囊”是指在受体动物中，可作为支持生毛或育毛的器官发挥作用的重建毛囊(或嵌合毛囊)。这样的器官包含毛乳头细胞、毛母细胞、毛囊上皮类细胞·组织(例如根鞘)、脂腺、包被毛囊的结缔组织等。
本发明可提供将上述系统移植到适当的受体动物时承载重建毛囊的嵌合动物。由于所述嵌合动物的毛囊内具有活性的(优选来自不同种动物)的黑素细胞，因此可用于对影响黑素细胞的机能或黑素细胞的活性的手段(包括药物和环境等)进行评价。受体动物的来源并不局限于移植到该动物的系统中所含各细胞的来源，优选免疫系统受到抑制的动物。另外，只要是可用作实验动物的种，并遵循本发明的目的，可以是任何动物，优选小鼠、大鼠等。上述动物中，以小鼠为例，免疫系统受到抑制的动物有如裸鼠那样具有胸腺缺损特征的小鼠。如果考虑本发明的目的，特别优选的受体动物有市售的裸鼠(例如Balb-c nu/nu系)、严重联合免疫缺陷小鼠(スキッドマウス)(例如Balb/c-SCID)、裸大鼠(例如F344/N Jcl-rnu)。由于使用这样的受体动物，再使用来自具有白化病性质的小鼠(例如ICR系)或黑素细胞缺损小鼠(例如Wsh/Wsh)的表皮细胞而得到的重建毛囊，容易跟踪该毛囊中包含的黑素细胞的活性，因此特别优选。
根据本发明，即使上述黑素细胞来自人，通过使用上述特别优选的受体动物、表皮细胞，也可以使含有黑色素的毛从重建毛囊中诱生出来并发育。另外在毛囊的周围区域也可观察到黑色素的产生。进一步通过立体显微镜观察移植后第6周的毛，观察到其间毛色并不由例如灰色变为白色，产生黑素的黑素细胞长时间地存在于重建毛囊。移植时，来自人的黑素细胞的混合量越多，则通常可见毛色越深，由此可认为再生的毛色依赖于毛乳头细胞周围来自人的黑素细胞产生黑素的量。
所述将本发明的用于重建毛囊的系统移植到受体动物的方法可以采用公知的移植方法。例如将该系统移植到裸鼠的背部时，相对于其背部直径约1cm的圆，可使用约50万-1000万个毛乳头细胞，优选约100万-约400万个；使用约100万-4000万个小鼠表皮细胞，优选约1000万-约2000万个；使用约50万-1000万个人培养黑素细胞(深色)，优选约100万-500万个。
承载上述重建毛囊的嵌合动物可长期地从重建毛囊诱生含有黑素的毛，并使其发育，因此可视为与毛的生长和使毛色变深有关的细胞或组织或器官例如黑素细胞、毛乳头、毛母细胞等正常发挥功能。因此本发明的嵌合动物可用于：
1)筛选通过活化黑素起到使毛色变深作用的药物；
2)筛选通过活化毛乳头起到促进毛的生长，使毛整体颜色变深作用的药物；
3)筛选通过刺激毛母细胞起到促进毛的生长、使毛整体颜色变深作用的药物；
4)筛选通过刺激毛乳头起到活化毛囊内黑素细胞、使毛色变深作用的药物；
5)筛选通过刺激毛母细胞起到活化毛囊内的黑素细胞、使毛色变深作用的药物；
6)筛选通过上述作用中的任一项或全体的组合起到使毛色变深作用的药物以及具有上述组合作用的药物等。本发明的活化黑素细胞的药物或化学物质的范围中包含下述的药物和物质：所述药物具有通过刺激并活化黑素细胞的生长、分化、增殖、存活、运动能力中的任意一项或任意活性中几项或全部使毛色变深的作用，所述药物或化学物质通过毛色显示其活性。
涉及上述使用形式的发明的一个形式有包含下述步骤的黑素细胞活化能力的评价方法：
(A)以上述嵌合动物作为受试动物的步骤；
(B)将该受试动物以某种特定的手段处理，监测这样处理的受试动物的重建毛囊中黑素细胞的活性的步骤；
(C)将相对于未处理对象(例如未进行步骤(B)处理的受试动物重建毛囊中黑素细胞的活性)的步骤(B)的活性变化程度与通过该手段获得的黑素细胞的活化能力建立相关关系的步骤。
在上述评价方法中，可以由重建毛囊生出的毛的黑色素的多少评价黑素细胞的活化能力。另外，也可以通过生毛和毛的生长程度，评价步骤(B)的手段是如何影响毛乳头、毛母细胞其中之一或两者的。所述手段有：受试动物所处环境例如应激环境、创造的与此相对的松弛环境等、以及涂布于受试动物的重建毛囊系统或皮下注射的药物、或预先对黑素细胞进行处理的药物、或经口给予的药物。可以在制备承载重建毛囊的嵌合动物时，将药物加入用于重建上述毛囊的系统中。
在使用来自人的黑素细胞建立重建毛囊时，可以使用公知的测试技术，对黑素生物合成途径中任意的酶或编码这些酶的DNA、mRNA等进行检测，从而对上述黑素细胞活性进行监测。也可以在拔去或剪去嵌合动物的毛后，测定新生出或生长起来的毛、或因毛发周期重复而新产生的毛中的黑素含量。
以下例举具体例子更具体地说明本发明，但这些说明的目的在于便于理解本发明，并不限定本发明的范围。
I.各种细胞的制备例
例1：来自小鼠的毛乳头细胞
(1-1)将多能聚糖启动子下游连接适当的标志蛋白(例如LacZ)的结构基因构成的表达载体，导入小鼠生成转基因小鼠，从该小鼠生产的新生幼鼠(在出生后4天内使用)中筛选LacZ阳性个体。
(1-2)用乙醇和适当的洗涤液(例如磷酸缓冲生理盐水，称为PBS)洗涤各个体后，将背部皮肤剥离，在0.25％胰蛋白酶/PBS中、在4℃下静置过夜。
(1-3)第二天，用镊子等将表皮与真皮分离，用0.35％胶原酶/DMEM(Dulbecco改良的Eagle’s基本培养基，以下称为DMEM。)等在37℃下对真皮处理约1小时。
(1-4)小心地对(1-3)进行悬浮操作，之后将其通过70μm孔径的细胞筛(セルストレ-ナ-)，然后通过离心仪收集细胞。
(1-5)使用适当的细胞分选仪，从收集的细胞中只回收LacZ基因表达的细胞，在适当的培养液(例如DMEM中加入10％胎牛血清(称为FBS))培养，或在通常的细胞冷冻溶液中冷冻保存，直至使用前一天。
(1-6)将细胞置于适当的培养条件(例如在DMEM+10％中、在5％CO2存在下、在37℃下等)，直至使用前一天，第二天手术之前用胰蛋白酶等制备。
例2：来自小鼠的表皮细胞
(2-1)手术前一天，按照(1-1)、(1-2)同样的方法用胰蛋白酶处理来自具有白化病性质的小鼠(例如ICR系)新生幼鼠的皮肤。
(2-2)用镊子等只将表皮部分剥离，切碎后在适当的培养液中(例如角质形成细胞用培养液，以下称为KGM。)、在4℃下悬浮处理约1小时。
(2-3)将通过70μm孔径细胞筛的(2-2)装入离心仪，回收表皮细胞。
(2-4)对每只受体动物使用相当于来自2只新生幼小鼠的表皮细胞进行手术。将相当量的细胞悬浮于KGM中，静置于冰上，直至使用。另外也可将回收的细胞冷冻保存，然后在使用前解冻使用。
例3：来自小鼠的真皮细胞
(3-1)手术前一天，按照(1-1)、(1-2)同样的方法用胰蛋白酶处理来自具白化病性质的小鼠(例如ICR系)新生幼鼠的皮肤。
(3-2)用镊子等将表皮部分剥离，将留下的真皮切碎后，在含0.35％胶原酶的适当的培养液中(例如DMEM+10％FBS等)中、在37℃下悬浮处理约1小时。
(3-3)将通过具100μm孔径细胞筛的(2-2)装入离心仪，回收真皮细胞。
对每只受体动物使用相当于来自2只新生幼小鼠的真皮细胞进行手术。不要将其与分离的毛乳头细胞同时使用。将相当量的细胞悬浮于DMEM+10％FBS等中，静置于冰上或将细胞冷冻保存，直至使用。
例4：来自人的培养黑素细胞
(4-1)将市售的来自包皮的黑素细胞(例如Cascade公司销售的NHEM细胞等)在黑素细胞培养液(例如Cascade公司的M154s培养基等)中培养。使其在手术当天之前增殖到每只受体动物相当于50万-1000万个细胞的量。
(4-2)在使用前，经0.05％胰蛋白酶处理，将细胞从培养器中分离并悬浮于培养液中，置于冰上，直至使用。
例5：来自小鼠的黑素细胞
(5-1)手术之前一周以上，按照(1-1)、(1-2)的方法，从新生幼小鼠(实施例中使用C57 Black/6系)中分离皮肤，用胰蛋白酶处理。
(5-2)剥离表皮后，使剥离的表皮悬浮于含有0.02％EDTA的PBS中。
(5-3)稳定混合后，在37℃振荡约8分钟。
(5-4)通过70μm细胞筛后，通过离心仪回收细胞，在黑素细胞用培养液中培养。培养条件根据细胞状态的不同而不同。
(5-5)使用前，经0.05％胰蛋白酶处理，将细胞从培养器中分离并悬浮于培养液中，置于冰上或将细胞冷冻保存，直至使用。
II.毛囊重建方法(对动物的移植方法)
例II-1：使用来自小鼠的毛乳头细胞的场合
要准备的材料：
将适当量的下述II-(1-1)、(1-2)、(1-3)混合，作为“重建毛囊制备步骤”中的“细胞悬浮液”使用。
II-(1-1)将多能聚糖启动子的下游连接适当的标志蛋白(例如LacZ)的结构基因，构成表达载体，导入小鼠生成转基因小鼠，从该小鼠的新生幼鼠的真皮中制备毛乳头细胞(真皮乳头；以下称为DP)。该制备要在施行重建手术的前一天之前进行，在手术当天通过胰蛋白酶处理进行回收。
II-(1-2)来自小鼠的表皮细胞。手术前一天，从具白化病性质的小鼠(例如ICR系)的新生幼鼠中采集皮肤，在手术当天通过胰蛋白酶处理进行制备。这样制备的细胞可在冷冻保存后使用。
II-(1-3)培养黑素细胞。(使用A或B)
A.来自人的黑素细胞。将来自市售包皮的黑素细胞传代培养获得的细胞(例如Cascade公司销售的NHEM细胞等)。在手术当天通过胰蛋白酶处理来制备。这样制备的细胞可冷冻保存后使用。
B.来自小鼠的黑素细胞。手术之前一周以上，从新生幼小鼠(实施例中使用C57 Black/6系)中分离，移到培养系统上传代培养而获得的细胞。在手术当天通过胰蛋白酶处理来制备。这样制备的细胞可冷冻保存后使用。
例II-2：使用小鼠真皮的场合
取代上述II-(1-1)，在手术前一天从具白化病性质的小鼠(例如ICR系)的新生幼鼠上采集皮肤，在手术当天，使用经胶原酶处理而制备的细胞制备“细胞悬浮液”。这样制备的细胞悬浮液可冷冻保存后使用。
<重建毛囊的制备步骤>
要准备的材料：
受体动物(例如Balb-c nu/un系裸鼠。5周龄以上)、
硅胶制直径约1厘米的圆弧状罩(以下称为瓣膜)、
麻醉药、
手术用剪刀、镊子、缝合器、
微量加液器
“细胞悬浮液”：由黑素细胞、表皮细胞、真皮细胞或毛乳头细胞构成。各细胞的制备方法参照上面所述。使用悬浮于约150μl培养液(DMEM+10％FBS等)并静置于冰上的细胞或冷冻保存的细胞，在手术之前制备。
<步骤>
(i)麻醉裸鼠。
(ii)切取约直径1厘米的背部皮肤。
(iii)将瓣膜插入伤口，用缝合器固定。
(iv)用加液器将细胞悬浮液注入瓣膜内。
(v)就这样培养约1周，移去瓣膜。
(vi)1-2周后，沿着疮痂脱落的痕迹可观察到重建毛囊的生长，将黑素细胞中加入悬浮液时，可观察到原本白化病的纯白毛色变为灰色。
(vii)通过组织学观察可以明确：该毛色来自黑色素。
结果
以上，将上述各细胞和依照上述步骤制备的重建毛囊载体动物的具体条件(用于重建毛囊的系统；+表示含有的细胞)以及毛色和移植皮肤颜色汇总为下表-1。另外还附有表示试验编号2、5、6、7、8和10中制备的动物背部的状态的照片，作为图1。
表-1
试验编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12人皮肤培养色素细胞(深色皮肤) - - - - - + + - - + +人皮肤培养色素细胞(浅色皮肤) - - - - - - - + - -来自人毛囊的培养色素细胞(亚洲人种) - - - - - - - - + - +小鼠皮肤培养色素细胞(C57/黑) - - - - + - - - - -真皮细胞(ICR白化小鼠) - + - - - - + + - -表皮细胞(ICR白化小鼠) - + - + + + + + + -真皮细胞(Wsh/Wsh小鼠) - - + - - - - - - +表皮细胞(Wsh/Wsh小鼠) - - + - - - - - - + + +小鼠分离毛乳头细胞 + - - + + + - - + - + +重建毛的毛色 无毛 白色毛 白色毛 白色毛 灰色毛 灰色毛 灰色毛 灰色毛 灰色毛 灰色毛 灰色毛 灰色毛
例III抗白发性药物的评价
依照例II-2的<步骤>，将试验编号7的用于重建毛囊的系统移植到裸鼠上，约3-4周后拔掉重建的毛。拔去后，分别将含有干细胞因子(以下简称为SCF)、α-黑素细胞促激素(以下简称为MSH)和p-氨基苯甲酸(以下简称为PABA)的溶液(1g动物体重分别为30ng SCF、1pmolMSH和50ng PABA)或磷酸缓冲溶液(PBS：对照)每天注射到动物的皮下，持续1周。
之后，待再生的毛再次充分生长后(约3周后)，用剪刀剪掉并收集再生毛。溶解毛后，通过吸光度对黑色素含量进行定量。结果如图2所示。从图中可知：通过加入各种因子，再生毛中黑素含量显著增加。因此本发明的嵌合动物至少可用于抗白发性药物的筛选。
产业上的利用可能性
本发明可提供：适合筛选抗白发性药物、具有稳定表现型的嵌合动物。因此本发明可用于实验动物供应产业；使用该动物例如开发有效的抗白发性药物的医疗行业；化妆品制造业等。