为预测B型肝炎患者对于干扰素治疗的反应建立模型的方法及所建立的模型.pdf

本发明涉及一种为预测B型肝炎患者对于干扰素治疗的反应建立模型的方法及所建立的模型，本发明的方法藉由和蒙地卡罗估计结合的基因型分析，为预测B型肝炎患者对于干扰素治疗的反应建立一种模型，利用此模型，藉由选取短串联序列标记组合，B型肝炎患者被区分为三个群组，包含高反应比率、中反应比率及低反应比率，并且因此得以预测B型肝炎患者对于治疗的反应，特别是接受干扰素治疗的B型肝炎患者的反应。

1、  一种为预测B型肝炎患者对于干扰素治疗的反应建立模型的方法，包含下列步骤：
短串联序列的基因型定型；
藉蒙地卡罗估计将显著的短串联序列标记和干扰素治疗的反应关联在一起；
检定在显著的短串联序列标记上的等位基因；
将显著的等位基因转换为基因型信息；以及
基于该基因型信息产生一方程式。

2、  如权利要求1所述的方法，其中所述短串联序列的基因型定型的步骤包括：
从基因组DNA扩增短串联序列标记的片段；以及
检测及分析短串联序列的多态性。

3、  如权利要求1所述的方法，其中所述将显著的短串联序列标记和干扰素治疗的反应关联在一起的步骤包含取得和药物反应有关联的位置。

4、  如权利要求1所述的方法，其中所述检定等位基因的步骤包含分析一关联表。

5、  如权利要求1所述的方法，其中所述转换显著的等位基因成为基因型信息的步骤包含建立一基因型关联表。

6、  如权利要求1所述的方法，其中所述产生一方程式的步骤包含转换该基因型信息成为二进制资料集。

7、  如权利要求6所述的方法，其中所述产生一方程式的步骤是藉逻辑回归实施。

8、  如权利要求1所述的方法，其中所述检定等位基因的步骤包含一等位基因频率差异检测。

9、  如权利要求1所述的方法，其中所述转换显著的等位基因成为基因型信息的步骤包含基因型频率差异检测。

10、  如权利要求1所述的方法，其中还包括为所述方程式的产生选择许多短串联序列标记形成一组合。

11、  如权利要求10所述的方法，其中还包括为所述组合估计一误差比率而选择许多第二短串联序列标记形成第二组合。

12、  如权利要求10所述的方法，其中所述许多短串联序列标记包含五个短串联序列标记。

13、  一种为预测B型肝炎患者对于干扰素治疗的反应建立的模型，包括：
从一短串联序列标记集合选出的许多短串联序列标记组成的组合；以及
藉蒙地卡罗估计从该组合推导的一方程式，指示该B型肝炎患者为高反应比率、中反应比率或低反应比率。

14、  如权利要求13所述的模型，其中所述组合包含五个短串联序列标记。

为预测B型肝炎患者对于干扰素治疗的反应 建立模型的方法及所建立的模型
技术领域
本发明涉及一种诊断B型肝炎患者在接受干扰素治疗时有反应或无反应的倾向的方法及其套件(kit)，特别是涉及一种方法，其包含揭示B型肝炎患者中存在或缺乏由数个短串联序列标记形成的异常变异组合形式，该异常变异形式与B型肝炎患者被施予干扰素治疗时具有增加或减少反应比率有关。
背景技术
尽管有疫苗的存在，慢性B型肝炎病毒(HBV)的感染仍是遍及全球的主要健康问题。干扰素疗法仅成功地控制一小部分慢性感染个体的感染，请参阅Delaney WE 4^th，Locarnini S，Shaw T(2001)Resistance of hepatitisB virus to antiviral drugs：current aspects and directions for future investigation，Antivir Chem Chemother 12(1)：1-35。以甲型干扰素治疗可以中断慢性B型肝炎患者三成到四成的病毒性复制，请参阅Heintges T，Petry W，KaldeweyM，Erhardt A，Wend UC，Gerlich WH，Niederau C，Haussinger D(2001)Combination therapy of active HBsAg vaccination and interferon-alpha ininterferon-alpha nonresponders with chronic hepatitis B，Dig Dis Sci 46(4)：901-906。然而，纵使是选择合适疗法的患者，六到十二个月的疗程的代价很高，而且因此而产生的许多副作用也会使患者的体力耗损，请参阅LiawYF(2002)therapy of chronic hepatitis B：current challenges and opportunities，J Viral Hepat 9(6)：393-399，Wai CT，Lok AS(2002)Treatment of hepatitis B，J Gastroenterol 37(10)：771-778，and Feld J，Locamini S(2002)Antiviraltherapy for hepatitis B virus infections：new targets and technical challenges.JClin Virol 25(3)267-283。这些不利的条件促使寻找对于治疗有反应和无反应的预测指标。类似的预测指标包含例如病毒的基因型、血清氨基转移酵素指数(ALT level)、血清B型肝炎病毒DNA、女性性别、肝脏切片组织的纤维化以及血清纤维网蛋白指数，请参阅Kao J.H.(2002)Hepatitis Bviral genotypes：clinical relevance and molecular characteristics，J.Gastroenterolhepatol 17(6)：643-650、Sakai T.，Shiraki K.，Inoue H.，Okano H.，Deguchi M.，Sugimoto K.，Ohmori S.，Murata k.，Nakano T.(2002)Efficacy of long-terminterferon therapy in chronic hepatitis B patients with HBV genotype C，Int.J.Mol.Med.10(2)：201-204、Kao J.H.，Wu N.H.，Chen P.J.，Lai M.Y.，Chen D.S.(2000)Hepatitis B genotypes and the response to interferon therapy，J.Hepatol33(6)：998-1002、Neudorf-Grauss R.，Bujanover Y.，Dinari G.，Broide E.，Neveh Y.，Zahavi I.，Reif S.(2000)Chronic hepatitis B virus in children inIsrael：clinical and epidemiological characteristics and response to interferontherapy，Isr.Med.Assoc.J.2(2)：164-168、以及Helvaci M.，Ozkaya B.，OzbalE.，Ozinel S.，Yaprak I.(1999)Efficacy of interferon therapy on serumfibronection levels in children with chronic hepatitis B infection，Pediatr.Int.41(3)：270-273。
将焦点放在宿主的基因背景的话，与疾病及药物反应有关的DNA多态性(包含STRP及SNP)成为种种疾病发生的原因。因此，由此类主题来深入探究或许可以获得B型肝炎患者对于疗效的重要预测指标，特别是对那些伴随干扰素疗法出现许多令人不愉快副作用的有关患者。
发明内容
本发明的目的之一，在于提供一种方法，从短串联序列标记为预测B型肝炎患者对于干扰素治疗的反应建立模型。
本发明的另一目的，在于提供一种模型，藉由分析来自B型肝炎患者的短串联序列标记预测B型肝炎患者对于干扰素治疗的反应。
根据本发明，在一种建立模型的方法中，结合蒙地卡罗(Monte-Carlo)估计的基因型分析被用来产生一利用逻辑回归的判别式。
藉本发明的方法建立的模型将B型肝炎患者区分为三个群组，他们分别为高反应比率、中反应比率及低反应比率，并且因此得以预测B型肝炎患者对于治疗的反应，特别是接受干扰素治疗的B型肝炎患者的反应。
附图说明
图1为显示一个为预测B型肝炎患者对于干扰素治疗的反应建立模型的流程示意图；
图2-1至图2-10为染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、17的位点曲线，通过图形表达显示了染色体在1、2、3、4、5、6、7、8、9和17上的等位相关性，其中X轴是在每一染色体从p端到q端上的短串联序列标记的基因位置，而Y轴为蒙地卡罗估计P值的自然对数值；
图3显示14个和干扰素治疗的持续反应有关的标记的综合信息；
图4显示对标记D1S2890、D5S406和D6S1581在逻辑回归中最大邻域估计值的分析；
图5显示藉由组合D1S2890、D5S406和D6S1581等标记而产生的预测指标模型；
图6显示D1S2890、D5S406和D6S1581三个标记组合的基因型逻辑回归分析；
图7显示对标记D3S1289、D7S515、D9S288和D17S785在逻辑回归中最大邻域估计值的分析；
图8显示藉由组合D3S1289、D7S515、D9S288和D17S785等标记而产生的预测指标模型；
图9显示D3S1289、D7S515、D9S288和D17S785四个标记组合的基因型逻辑回归分析；
图10显示藉由D2S319、D3S1289、D4S391、D7S515和D17S785等标记而产生的预测指标模型；
图11显示图10的预测指标的数值。
具体实施方式
为使本领域的技术人员对本发明的目的及优点能够更清楚地了解，现配合附图详细说明如下：
根据本发明，一种为预测B型肝炎患者对于干扰素治疗的有效反应的模型可以藉由和蒙地卡罗估计结合的基因型分析来建立，遵循如图1所示的程序。为建立此预测指针的模型，首先在步骤10对收集地样品执行藉短串联序列基因型定型法的全基因组筛检。在步骤20，藉蒙地卡罗估计作关联性研究以取得和药物反应相关的位置。执行步骤30是为了藉卡方独立性测试进行等位基因频率差异检定，以获得对治疗有反应及无反应之间具有显著的不同频率的等位基因(alleles)。然后根据显著的结果该等位基因的资料集在步骤40被转换为基因型资料，跟随着步骤50藉卡方独立性测试进行基因型频率差异检定。根据显著的结果该基因型分析资料集在步骤60被进一步地转换为二进制的资料集。最后，藉由逻辑回归该二进制的资料集被用来产生一判别式。
以下提供具体实施例，以更详细地显示本发明的方法。
临床样品的收集
从门诊病人的会诊中把104名具有B型肝炎的患者记录下来。每一血液样品皆为HBsAg(+)及HBeAg(+)，并且有六个月的血清氨转移酵素指数至少高于正常值两倍。每一患者皆被告知且取得其同意。若有符合下列所列准则的病患将被排除在接受干扰素的疗法以外：嗜中性白血球数量小于1,500cells/mm³、女性患者血红素小于12g/dL或男性患者血红素小于13g/dL或血小球数目小于90,000cells/mm³、具有控制不佳的甲状腺疾病的病史、以及血清肌氨酸酐高于正常水准1.5倍。大约三十名患者在治疗之前有接受肝脏切片来提供肝炎的证据或者将严重肝硬化的患者排除在外。合适的病患在四到六个月期间每星期三次服用5-10百万单位剂量的甲型干扰素(2a或2b)，随后进行超过一年对于治疗反应所做的临床、生化、以及血清学上的标记。对于慢性B型肝炎疾病的干扰素治疗有持续反应的病患被定义为在随访期间至少有一年的治疗后有HBeAg(+)至HBeAg(-)的转变。事先排除并发C型或D型肝炎的病患于此研究之外。此研究的拟订遵照1975年在赫尔辛基颁布的伦理准则，并经学会检阅委员会核准。
遍及基因组的基因型分析
从基因组DNA扩增短串联序列片段
基因型定型是利用美商应用生命系统公司(ABI)的商购PRISM连锁对照集组(Linkage Mapping Sets)MD-10(400个标记)来完成。这些标记被安排在MD-10集组以提供10cM平均分辨率(解析度)的人类基因组。每个标记组合包含经萤光标签过的正向引物(forward primer)与一加尾反向引物(tailing reverse primer)。藉由放置GTTTCTT序列在反向引物的5’端，反向引物加尾化学在扩增的期间被用来促进无模板导引的核酸加成反应，其导致前后一致的等位基因和更精确的资料输出。包含9.0mlTrue Allele公司的链聚合酶连锁反应(PCR)混合物(包含去氧核糖核酸(dNTP)、缓冲液、氯化镁、以及Tag DNA聚合酶)、3.8ml无菌的去离子水、1.0ml引物对(每一引物5mM)、1.2ml基因组DNA(50ng)的PCR反应在96孔微滴定盘上制备。扩增反应是在ABI公司的9700 PCR反应器上以如下的热循环执行：95℃、12分钟的一回合，94℃、15秒的十回合融解反应，55℃、15秒的粘合反应，72℃、30秒的延伸反应，89℃、15秒的二十回合融解反应，55℃、15秒的粘合反应、72℃、30秒的延伸反应、以及一回合的72℃、十分钟最终延伸反应。
短串联序列多态性检测与分析
在PCR反应之后，将产物以1∶1∶2的比例(FAM∶VIC∶NED)于标记的嵌板中静置。将0.5ml静置过的PCR产物混合9ml的formamide：size标准混合物，后者是以50ml的GeneScan-500 LIZ Size Standard及900ml的Hi-Di formamide制备。用个别的移液机器人(pipetting robots)去除DNA并静置PCR产物以确保快速及几乎无误的液体传递过程。PCR反应池被分配在ABI公司的3700DNA分析仪上，用GeneScan 500LIZ当做内部尺寸标准协助多态性片段长度找寻和允许更精确的等位基因找寻及清楚的资料比较。基因型以Genescan以及GenotyPer(ABI公司)的软件评分。
基因型藉由三位无先前表现型认知的研究者个别地查核。
统计分析
藉蒙地卡罗估计(SAS10.0，SAS公司)找到干扰素治疗的持续反应的关联性。图2是利用图形表达显示染色体在1、2、3、4、5、6、7、8、9和17上的等位相关性，这些图表的X轴是在每一染色体从p端到q端上的短串联序列标记的基因位置，而Y轴为蒙地卡罗估计p值的自然对数值，在Y＝3的地方差不多p＝0.05。藉由关联表的分析，在显著的标记上的等位基因做不平衡连锁的检验。显著的等位基因也藉由胜算比(oddratio)做危险因子的检验。基因型关联表是根据具有显著的p值及胜算比的特定等位基因而建立。具有意义的基因型是藉由卡方及显著的胜算比对基因型分析表的检验而产生。在收集显著的标记的基因型资料及转化这些数据至二进制的表示方式后，具有意义的基因型表示为“1”，而其它基因型则表示为“0”。图3显示14个与干扰素治疗的持续反应有关的标记的综合信息，其中包含受试者的总数、蒙地卡罗测试的p值、有意义的等位基因数、有意义的基因型数目及胜算比等。
预测指标是使用在前一步骤已转化成二进制的资料集以逻辑回归对不同的短串联序列标记组合执行。图4显示对标记D1S2890、D5S406和D6S1581在逻辑回归中最大邻域估计值的分析，图5显示藉由组合D1S2890、D5S406和D6S1581等标记而产生的预测指标模型，图6显示D1S2890、D5S406和D6S1581三个标记组合的基因型逻辑回归分析。根据这三个短串联序列的组合，99名受试者(46个反应者及53个无反应者)可以被下列的方程式区分成为九组：
logit P(R)＝0.2105-2.1671(D1S2890EE)
            -1.1377(D5S406Hy)+1.2904(D6S1581By)，
其中”y”代表任一等位基因。而有001符号的那一组具有最高的反应比率。
图7至图9为另一组合的情况。图7显示对标记D3S1289、D7S515、D9S288和D17S785在逻辑回归中最大邻域估计值的分析，图8显示藉由组合D3S1289、D7S515、D9S288和D17S785等标记而产生的预测指标模型，图9显示图7及图8基因型的逻辑回归分析。根据这四个短串联序列标记，患者可以被下列的方程式区分成为十六组：
logit P(R)＝-2.1114+2.0896(D3S1289Fy)
            +1.7561(D7S515Hy)+1.9955(D9S288Dy)
            +2.5142(D17S785Cy)
其中“y”代表任一等位基因。而有0000符号的那一组具有最高的无反应比率。
图10显示标记D2S319、D3S1289、D4S391、D7S515和D17S785组成的这一组合产生的预测指标模型，而这些预测指标的数值显示在图11中，根据这五个短串联序列标记的组合，患者可以被下列的方程式区分成为三组：
P(R)＜0.3；
0.3＜P(R)＜0.7；以及
P(R)＞0.7
跟随等式：
logit P(R)＝-3.3395+2.0239(D2S319Fy)
            +2.7922(D3S1289Fy)+1.5791(D4S391Dy)
            +2.4306(D7S515Hy)+2.5744(D17S785Cy)
其中“y”代表任一等位基因。
结果
藉215个短串联序列标记(平均间隔10cM)执行染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9和17的基因型定型，其中14个短串联序列标记的等位基因频率或/和基因型频率与干扰素治疗的持续反应有关。经过所有的分析之后，找到三个短串联序列组合可用来预测反应的比率，而另外四个短串联序列组合可用来预测无反应的比率。在没有经过预选、藉逻辑回归得到的五个短串联序列可以将患者分成三个群组，其为高反应比率、中反应比率及低反应比率。
以上对于本发明的优选实施例所作的叙述是为阐明的目的，而无意限定本发明的实施范围，基于以上的教导或从本发明的实施例学习而作修改或变化是可能的，实施例是为解说本发明的原理以及让熟习该项技术者以各种实施例利用本发明在实际应用上而选择及叙述，本发明的技术思想由权利要求书的保护范围及其均等来决定。