一种高效几丁质降解菌豚鼠气单胞菌及其产生的几丁质酶系 技术领域：
本发明涉及一种筛选得到了一株高效几丁质降解菌-豚鼠气单胞菌，该菌株分泌一个至少由4种几丁质酶组成的几丁质酶系，降解几丁质得到几丁寡糖。
背景技术：
几丁质为N-乙酰葡萄糖胺以β-1，4-糖苷键连接而成的直链聚合物，是自然界除纤维素外含量居第二位的多糖，主要存在于虾、蟹外壳，真菌细胞壁以及昆虫外壳。几丁质酶(EC3.2.1.14)能够降解几丁质的β-1，4-糖苷键，可分为内切酶和外切酶。几丁内切酶对糖链随机切割，得到分子量不等的几丁寡糖；几丁外切酶从糖链非还原端以几丁二糖为单位逐单位切割，产生几丁二糖。许多微生物能够分泌几丁质酶，降解几丁质为生长提供所需碳源和氮源，微生物对几丁质的降解利用是几丁质在自然界循环的重要环节。
几丁寡糖主要指分子量在5000以下聚合度为2-20的多聚N-乙酰葡萄糖胺，尤指聚合度为2-6的的低分子量寡糖。低分子量寡糖具有多种生物活性，在口腔医学、人体免疫、抗癌领域有着广泛应用，它们是目前几丁质工业中仅有的高附加值产品。造成几丁寡糖高成本的原因是高分子几丁质降解度不易控制，化学裂解的产物分子量偏大且不均一。
发明内容：
本发明的目的是筛选得到了一株高效几丁质降解菌-豚鼠气单胞菌，该菌株分泌一几丁质酶系，降解几丁质得到几丁寡糖。
我们从厦门海域采集的不同泥样和水样中，分离到几十株具有较高几丁质酶活性的细菌和放线菌。将这些初筛得到的菌株接种到以胶体几丁质为唯一碳源和氮源的基本培养基上，复筛得到一株酶活力大于0.68U/mg地细菌CB101(图1)，经鉴定该菌株为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)。该豚鼠气单胞菌已在武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M201040。
CB101在无几丁质的诱导的情况下能组成型分泌少量几丁质酶，在培养基中添加胶体几丁质诱导物后几丁质酶表达量大幅增加(诱导后酶最高表达量约为组成型表达的十倍)，添加葡萄糖则抑制其表达。CB101接种于MM-Chitin培养基摇瓶培养三天后离心取发酵液，硫酸铵沉淀总蛋白后进行蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，蛋白凝胶复性后酶活性染色显示在总蛋白中有四条几丁质酶活性带，分别约为85kDa，66kDa，60kDa和50kDa(图2)。总蛋白降解胶体几丁质为低分子量寡糖(主要为二糖、三糖以及少量四糖和五糖)和单糖(图3)。该酶系最适反应温度为50℃，pH从4-12相对平稳，在pH6时酶活力达最高峰(图4)。
根据GENEBANK中已有几丁质酶基因保守区，设计上下游引物，以Aeromonas caviae CB101的总DNA为模板，PCR扩增出一条约2.6kb的片段，基因及蛋白序列如下：附表1。
克隆的几丁质酶基因命名为chil，全长2598个碱基对，编码865个氨基酸，分子量为91.514kDa。Chil的N末端23aa有明显的革兰氏阴性菌的信号肽特征，包括一正电区(如Lys-5)，随后依次为一段α螺旋、一段稍长的疏水区(如6个Leu、、2个Ala和1个Val)及一个短的不带电荷的极性区(Thr、Ser)，另外-3与-1位置为Ala。此酶在野生菌株中属分泌蛋白，在培养液中为优势蛋白，从野生菌株培养液纯化出此蛋白后经N末端序列分析后证实其N末端残基为24-31。说明在该酶转膜外泌过程中，相关蛋白酶在Ala-23与Ala-24间进行剪切，因而实际只有842aa(对应于从总蛋白中检测出的约85kDa的几丁质酶，实际分子量为89.3kDa)。几丁质酶Chil降解几丁3-6糖主要得到几丁二糖，降解胶体几丁质主要产物为几丁二糖和几丁三糖，延长降解时间后其产物中单糖产量大大增加，表明该酶同时具有几丁外切和几丁内切功能，且其最小底物为几丁三糖。
附图说明：图1豚鼠气单胞菌CB101(Aeromonas caviae)在以胶体几丁质为唯一碳源和氮源的基本培养基上生长，降解胶体几丁质出现透明圈。图2豚鼠气单胞菌CB101发酵培养液中几丁质酶的检测，1，蛋白质分子量标准2，发酵液总蛋白的蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)3，发酵液总蛋白电泳后复性，影印到糖几丁质凝胶板上，几丁质酶降解糖几丁质后染色可显示几丁质酶带所在位置。图3、4为豚鼠气单胞菌CB101几丁质酶系反应温度、pH与酶比活力关系。
本发明所述的几丁质酶基因，包括具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列或其功能等同物或变异体。
附表1(chil序列)
SEQ ID NO：1信息
1 ATGTTAAGTCCAAAACTTTCCCTGCTGGCGCTTCTGGTCGGGGGGCTTTGCACTACCTCCGCCTTCGCCGCTGCCCCGGGCAAACCCACC
1 M L S P K L S L L A L L V G G L C T T S A F A A A P G K P T
91 ATTGGCTCCGGCCCCACCAAGTTTGCCATCGTTGAAGTCAATCAGGCCGCTTCGGCCTACAACCAGCTGGTGACCGTCCACAAGGATGGC
31 I G S G P T K F A I V E V N Q A A S A Y N Q L V T V H K D G
181 GCTCCCGTCAGCGTGACCTGGAACCTTTGGTCCGGTGACGTCGGACAGACCGCCAAGGTACTGCTTGATGGCAAGGAGGTGTGGTCAGGC
61 A P V S V T W N L W S G D V G Q T A K V L L D G K E V W S G
271 CCGGCCTCCGCCGCGGGTACCGCCAACTTCAAGGTCACCAAGGGGGGGCGTTACCAGATGCAGGTGGCCCTGTGCAACGCCGACGGCTGC
91 P A S A A G T A N F K V T K G G R Y Q M Q V A L C N A D G C
361 ACCCTCTCCGACAAGAAGGAGCTGATGGTCGCCGATACCGACGGCAGCCACCTGGCGCCGCTCAATGCGCCCCTCAAGGAGAACAACAAG
121 T L S D K K E L M V A D T D G S H L A P L N A P L K E N N K
451 CCCTACGCCAACAAGTCCGGCAAGGTGGTGGGGGCCTACTACGTGGAGTGGGGAGTCTATGGTCGCAAGTTCACCGTGGACAAGATCCCG
151 P Y A N K S G K V V G A Y Y V E W G V Y G R K F T V D K I P
541 GCCCAGAACCTGACCCATATCCTCTACGGCTTCACCCCCATCTGCGGTGGCAACGGCATCAACGACAGCCTCAAAGAGATCTCCGGCAGC
181 A Q N L T H I L Y G F T P I C G G N G I N D S L K E I S G S
631 TTCGAGGCGTTGCAGCGCTCCTGTGCGGGTCGCGAAGACTTCAAGGTCTCCATCCATGATCCCTGGGCGGCGATCCAGATGTCCCAAGGC
211 F E A L Q R S C A G R E D F K V S I H D P W A A I Q M S Q G
721 AACCTCAGCGCCTGGGATGAGCCCTACAAGGGCAACTTCGGCAACCTGATGGCCCTCAAACAGGCCCATCCGGACCTCAAGATCCTGCCG
241 N L S A W D E P Y K G N F G N L M A L K Q A H P D L K I L P
811 TCTGTCGGCGGATGGACCCTCTCAGATCCCTTTTACTTCCTGGGTGACAAGACCAAGCGCGATACCTTCGTCGCCTCGGTCAAAGAGTTC
271 S V G G W T L S D P F Y F L G D K T K R D T F V A S V K E F
901 CTGCAGACCTGGAAATTCTTCGACGGCGTGGACATCGACTGGGAGTTCCCGGGCGGACAGGGGGCCAACCCCAGCCTGGGCGGCCCGAAT
301 L Q T W K F F D G V D I D W E F P G G Q G A N P S L G G P N
991 GACGGCGCCACCTATGTGGTGCTGATGAAGGAGTTGCGAGCCATGCTCGATGAACTGGAAGCCGAGACCGGCCGCCAGTATGAGCTGACC
331 D G A T Y V V L M K E L R A M L D E L E A E T G R Q Y E L T
1081 TCGGCCATCAGCGCCGGCGGTGACAAGATTGCCAAGGTGGATTATCAGGCGGCCCAGCAGTACATGGACCACATCTTCCTGATGAGCTAC
361 S A I S A G G D K I A K V D Y Q A A Q Q Y M D H I F L M S Y
1171 GACTTCAGCGGCGCCTTCGACCTGACGAATCTGGCCCACCAGACCAACCTCTTTGCCTCCAGCTGGGATCCGGCCACCAAGTACACCACC
391 D F S G A F D L T N L A H Q T N L F A S S W D P A T K Y T T
1261 GACAAGGGCGTCAAGGCGCTGCTGGGTCAGGGGGTGACACCGGGCAAGATTGTGGTGGGGGCGGCCATGTATGGCCGTGGCTGGACCGGA
421 D K G V K A L L G Q G V T P G K I V V G A A M Y G R G W T G
1351 GTGAAGAACTACCAGGCCGGCAACCCCTTCACCGGCACCGCCACCGGACCGGTGAGCGGTACCTGGGAAAATGGCGTGGTGGATTACCGC
451 V K N Y Q A G N P F T G T A T G P V S G T W E N G V V D Y R
1441 GACATCGTCAACAACCGCATGGGCGCAGGCTGGGAGCAGGGCTATGACGAGTCGGCCGAGGCCCCCTATGTCTTCAAGGCCAGCAGTGGC
481 D I V N N R M G A G W E Q G Y D E S A E A P Y V F K A S S G
1531 GACCTCATCACCTTCGACAACGACCGCTCGGTCAAGGCCAAGGGGCAGTACGTGCTGGCGAACCAGCTCGGCGGTCTGTTCGCCTGGGAA
511 D L I T F D N D R S V K A K G Q Y V L A N Q L G G L F A W E
1621 ATTGATGCGGACAACGGCGACATCCTCAACGCCATGCACGAGGGGCTGGGCCACGGCGAGGGTACGCTGCCGCCGGTCAACAAGCCGCCG
541 I D A D N G D I L N A M H E G L G H G E G T L P P V N K P P
1711 GTTGCCAATGCCGGCAGCGATCTGAGTGCCACCGGCCCGGCCGAGGTGACCCTCAACGGCAGCGCCTCCCACGATCCGGAAAACGGGGCG
571 V A N A G S D L S A T G P A E V T L N G S A S H D P E N G A
1801 CTGACCTACAGCTGGAAACAGGTCTCCGGACCCCAGGCTAGCCTGCTGGATGCCACCCAGGCCAAGGCCCGTGTGGTACTGGATGCCGTC
601 L T Y S W K Q V S G P Q A S L L D A T Q A K A R V V L D A V
1891 AGCAGCGACATCAATCTGGTGTTCGAGCTGACCGTGACCGACGATCAGGGGCTCTCGGCCAAGGATCAGGTGGTGGTCACCAACAAGGCG
631 S S D I N L V F E L T V T D D Q G L S A K D Q V V V T N K A
1981 CCGCAGCCGAACCTGCCCCCCGTGGTCAGCGTACCGGCCAGTGCGACCGTCGAGGCCGGCAAGCAGGTGAGCATCAAGGCCACCGCTTCC
661 P Q P N L P P V V S V P A S A T V E A G K Q V S I K A T A S
2071 GACCCCAATGGTGATGCCCTGAGCTATCAGTGGACAGTGCCGGCCGGGCTCAGCGCCACCGGTCTGGACAGCGCGACCCTGGTGGTAACG
691 D P N G D A L S Y Q W T V P A G L S A T G L D S A T L V V T
2161 GGCTCGAACGTGACCAGTGATACGGCCTACGATCTGACCCTGGTGGTCACCGACGGGGCGCTGGATGCCACAGCCGTTACCCGCCTGACC
721 G S N V T S D T A Y D L T L V V T D G A L D A T A V T R L T
2251 GTCAAGCCGGCCAGTACAGGTGGTGGCTGCGAGGCCAGCGATCCGGATGCGGCCAACCATCCGGCCTGGAGTGCTGGTACCGTCTACAAC
751 V K P A S T G G G C E A S D P D A A N H P A W S A G T V Y N
2341 ACCAATGACAAGGTGAGCCACAAGCAACTGGTGTGGCAGGCCAAGTATTGGACCCAGGGCAACGAGCCGAGCCGCACCGCCGATCAGTGG
781 T N D K V S H K Q L V W Q A K Y W T Q G N E P S R T A D Q W
2431 AAACTGGTGAGCCAGGTGCAACTGGGTTGGGATGCCGGAGTGGTCTACAACGGCGGTGATGTCACCAGCCACAACGGCCGCAAGTGGAAG
811 K L V S Q V Q L G W D A G V V Y N G G D V T S H N G R K W K
2521 GCCCAGTACTGGACCAAGGGCGATGAGCCCGGCAAGGCCGCCGTCTGGGTCGATCAGGGCGCGGCGAGCTGCAACTGA
841 A Q Y W T K G D E P G K A A V W V D Q G A A S C N *