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利用小单孢菌将密实菌素羟基化为普伐他汀
技术领域
本发明涉及一种制备普伐他汀的新微生物方法。更具体地是，本发明涉及一种利用微生物由通式(II)的化合物制备式(I)的普伐他汀的微生物方法：

其中R代表一种碱金属或铵离子，其中所述微生物是一种属于小单孢菌属(Micromonospora)的原核生物，其能够在6β-位置上羟基化通式(II)的化合物。
背景技术
高胆固醇血症被认为是动脉粥样硬化疾病，尤其是冠心病的一种主要危险因素。在过去的二十年中，已经对作为胆固醇生物合成过程中的主要限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶EC.1.1.1.34)进行了广泛的研究。通过不同真菌菌种的选择菌株生物合成的美维诺林(Mevinolin)及其相关化合物被发现是该酶的竞争性抑制剂[Endo，A等，抗生素杂志(J.Antibiotics)29，1346-1348(1976)；Endo，A等，FEBS Lett.72，323-326(1976)；Kuo，C.H.等，有机化学杂志(J.Org.Chem.)48，1991-1998(1983)]。
普伐他汀也是HMG-CoA还原酶抑制剂家族中的一员。首先，在对密实菌素的代谢进行研究的过程中[Arai，M.等，Sankyo KenkyushoNempo，40，1-38(1988)]，发现普伐他汀是狗体内一种密实菌素的次要尿代谢物(Tanaka，M.等，未公开)。
作为密实菌素的羟基化产物的普伐他汀的主要特征是它的组织选择性。该药物强烈地抑制甾醇在肝内和肠内的合成，但在其它器官，抑制作用较弱。有利的是普伐他汀的毒性低于其它HMG-CoA还原酶抑制剂的毒性。
据报道通过属于多种不同真菌属的种的几种菌株，以及通过属于诺卡氏菌属(Nocardia)，马杜拉放线菌属(Actinomadura)和链霉菌属(Streptomyces)的放线菌种的菌株，尤其是玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)和嗜碳链霉菌(Streptomycescarbophilus)，可在不同程度上实现密实菌素的微生物羟基化(美国专利5179013，4448979，4346227，4537859，及日本专利58010572)。
利用真菌由密实菌素制备普伐他汀的过程中存在的问题是这些生物体通常耐受不了液体培养基中较高的密实菌素浓度，这大概是由于密实菌素具有抗真菌活性[Serizawa，N.等，抗生素杂志36，887-891(1983)]。在嗜碳链霉菌中，已表明细胞色素P450系统为密实菌素被羟基化为普伐他汀所必需的[Matsuoka，T.等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)184，707-713(1989)]。遗传改进这种酶羟基化能力的困难在于该酶是一种蛋白质复合体而不是单个蛋白质。
本发明的公开
我们的研究集中在寻找一种放线菌菌株，该菌株能由酸式密实菌素的盐产生普伐他汀，该菌株在生物转化中采用的底物浓度以及转化率比上述专利说明书中公开的那些高。
在筛选过程中，筛选包括了大约6000个放线菌菌株，大多是我们自己的分离物，但也包括来源于国际菌株保藏中心的可靠菌株，选出五个链霉菌菌株和五个小单孢菌菌株用于进一步的研究，因为它们被证明具有将酸式密实菌素的钠盐羟基化为普伐他汀的能力。我们实验室已在种的水平上对这十个放线菌菌株中的八个菌株进行了分类学鉴定，这十个放线菌菌株是：
紫色链霉菌(Streptomyces violaceus)(根据Kmpfer等，1991)，菌株号1/43；
娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)(Berger等，1949；Waksman和Lechevalier，1953)，菌株号1/41；
拒霉素链霉菌(Streptomyces resistomycificus)(Lindenbein等，1952)，菌株号1/44；
链霉菌属的种(Streptomyces sp.)，菌株号1/28；
羊毛链霉菌(Streptomyces lanatus)(Frommer，1959)，菌株号1/16；
小单孢菌属(Micromonospora sp.)，菌株号IDR-P₃；
绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea)(Luedemann和Brodsky，1964)，菌株号IDR-P₄；
棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)(Luedemann和Brodsky，1964)，菌株号IDR-P₅；
黑孢小单孢菌(Micromonospora megalomicea)(Weinstein等，1969)，菌株号IDR-P₆；
蔷薇小单孢菌(Micromonospora rosaria)(Horan和Brodsky，1986)，菌株号IDR-P₇。
迄今为止，还没有文献公开有关小单孢菌具有将酸式密实菌素的盐转化为普伐他汀的能力的数据，所以我们不仅全面地研究了该特定酶促能力，而且还研究了上面列出的小单孢菌属菌株的分类学位置。
，DR-P₃，IDR-P₄，IDR-P₅，IDR-P₆和IDR-P₇
在属水平上的分类学位置
所有这些菌株产生生长良好的菌丝体，该菌丝体由0.4-0.7μm直径的分支菌丝组成。不存在气生菌丝体或只存在微量的气生菌丝体。只在孢子体上长出不动孢子。基内菌丝体的菌丝是革兰氏阳性的并且不耐酸。菌株IDR P₃-P₇是需氧的，化能有机营养的并对低于6.0的pH敏感。壁含有内消旋-二氨基庚二酸。上面列出的鉴别特征-为关键特征-清楚地表明这些单孢放线菌菌株是小单孢菌属的典型成员。
小单孢菌属菌株IDR-P₃的分类学描述
微观形态学特征：基内菌丝体由生长良好的、略为弯曲的、单轴分支的细丝组成。孢子体上的孢子是单个的，大约1.8μm直径的球形体并且或多或少地均匀分布在菌丝上。孢子是无柄的(sessile)或位于短孢子体的端部。大概由于成熟孢子释放得非常快，所以在肉汤培养基中菌丝上没有观察到孢子。
培养的宏观形态学特性：
Czapek-蔗糖琼脂：中等生长，菌落微红色并覆盖点状黑色孢子形成区域。
葡萄糖-天冬酰胺琼脂：生长情况被记录为：点状和凸起地、红棕色或黑色菌落。可扩散性色素：微红。
营养琼脂：中等生长，凸起的、红棕色或黑色菌落。在培养基中产生红棕色外色素(exopigment)。
酵母抽提物-麦芽提取物琼脂(ISP Med.2)：生长良好的、凸起的和褶皱的褐色菌落，覆盖部分黑色孢子形成区域或“假气生菌丝体”(看上去象一种有限的发白的或浅灰色的花)。可溶性色素：呈褐色或呈棕红色。
无机盐-淀粉琼脂(ISP Med.4)：中等生长的、红棕色的、凸起的和褶皱的菌落。可溶性色素：浅红色。
甘油-天冬酰胺琼脂(ISP Med.5)：痕量生长，偏白或浅桔黄色的扁平菌落，可溶色素：浅玫瑰色。
碳源的利用：生长良好并且很好地利用L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、D-甘露糖醇、半乳糖醇、甘油和肌醇。利用L-鼠李糖、D-棉子糖和菊粉的生长比在阴性对照培养基上生长得略好些。
氮源的利用：利用酵母抽提物和NZ-胺生长良好，不利用或很少利用NaNO₃。
其它生理生化特征：水解纤维素和淀粉，对牛奶的消化性强。硝酸盐还原反应试验阴性。在不含碳酸钙(pH5.8-6.0)的马铃薯片上不生长。不产生类黑素。
从Balaton湖(匈牙利)的泥浆样本中分离了小单孢菌属的该菌株IDR-P₃。
分类学位置：为了弄清该菌株在小单孢菌属的种中的精确分类学位置，有必要进一步进行比较系统学研究。基于一定的特征基础，IDR-P₃代表小单孢菌属的一个新种似乎并不是不可能。
小单孢菌属菌株IDR-P₄、-P₅、-P₆和-P₇的鉴别特征的描述和鉴定
菌株IDR-P₄
在以上列出的鉴别培养基上，菌落通常生长良好，颜色由桔黄色到桔红色，红色，有时为微黄色或玫瑰色。不产生可溶性色素和气生菌丝体。单体孢子数较少。它们长在孢子体的末端。基内菌丝体由完全分支的菌丝组成。没有气生菌丝体存在。在D-蜜二糖、棉子糖、甘露糖醇、甘油、乳糖、L-鼠李糖上不生长，但是在D-阿拉伯糖、葡萄糖、D-木糖上生长良好，并且在D-半乳糖和D-果糖上生长微弱。基于这些常规的鉴别特征，我们将该菌株鉴定为绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea)(Luedemann和Brodsky，1964)菌种中的一员。
菌株IDR-P₅
该菌株主要产生单体孢子体和球形深褐色到黑色的孢子(0.8-1.5μm的直径)，直到成熟前，这些孢子牢固地附着在孢子体上。根据电子显微镜观察的结果，在这些孢子的表面上，能观察到疣状结构或旁枝(outgrowths)(在伯杰氏细菌分类手册(Bergey’s Manual ofSyst.Bact.)，Vol.4，1989，2448页中被称作“平端刺(bluntspines)”)，疣状结构是棘孢小单孢菌孢子非常典型的特征。另外，该菌株的培养形态学和生理学鉴别特征也与棘孢小单孢菌的那些非常相似。在标准鉴别培养基上生长良好的菌落的颜色是黄褐色或暗紫色。孢子形成层是黑色或略带紫色的黑色，光滑。没有气生菌丝体存在。不产生黑色素。牛奶消化型。在D-木糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖和蔗糖上生长良好，但在L-鼠李糖、棉子糖、D-半乳糖、D-果糖、D-蜜二糖和甘油上不生长。我们认为该菌株是一种典型的棘孢小单孢菌。
菌株IDR-P₆
在大多数鉴别培养基上生长由中等到薄弱。桔黄色或桔红色的菌落由分支的长丝(大约0.6μm的直径)和数量有限的单体、球形、深色的孢子(0.6-1.0μm的直径)组成。不产生气生菌丝体。在一些培养基中，形成浅红色或玫瑰色的可溶性色素。在酪氨酸琼脂上，不产生类黑素。在基础培养基上，该菌株利用下列碳源：D-木糖和D-果糖；只少量利用：D-蜜二糖、甘露糖醇和半乳糖，但利用甘油、L-鼠李糖、乳糖和棉子糖没有观察到生长或只观察到偶发的生长(还参见Kawamoto，I.等：农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)，47，203-215，1983)。菌株IDR-P₆表现出与黑孢小单孢菌种(Weinstein，1972)极大的相似性，因此我们认为该菌株是该种中的一员。
菌株IDR-P₇
在Bennett琼脂、Czapek蔗糖琼脂、葡萄糖-天冬酰胺琼脂、营养琼脂、燕麦片琼脂、马铃薯-葡萄糖琼脂等上生长良好至中度生长。营养菌丝体色素的颜色由红褐色至紫褐色。在一些培养基上形成了葡萄酒红色的可扩散色素。在菌落的表面常常产生黑斑点。营养菌丝(平均值经：0.5μm)大量分支。孢子(1.4-1.7μm的直径)单体生长，附着在或在短孢子体上并且沿着菌丝的长度生长。生长和孢子的形成是Luedemann的稀疏网状型(open web type)。下列化合物被该菌株利用作为培养基中的唯一的碳源：D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、L-鼠李糖、蔗糖和D-木糖。不利用半乳糖醇、甘油、D-蜜二糖和D-棉子糖。我们将菌株IDR-P₇鉴定为属于典型的蔷薇小单孢菌(Horan和Brodsky，1986)。
上述小单孢菌属菌株被保藏在匈牙利，布达佩斯，国立农业和工业微生物和细胞保藏中心(NCAIM)，其保藏号和保藏日期如下：
小单孢菌属的种(Micromonospora sp.)IDR-P₃的保藏号为NCAIM(P)B 001268，保藏日期为1998年10月13日；绛红小单孢菌IDR-P₄的保藏号为NCAIM(P)B 001271，保藏日期为1999年4月12日；棘孢小单孢菌棘孢亚种(Micromonospora echinospora ssp.echinospora)IDR-P₅的保藏号为NCAIM(P)B 001272，保藏日期为1999年4月12日；黑孢小单孢菌黑色亚种(Micromonosporamegalomicea ssp.nigra)IDR-P₆的保藏号为NCAIM(P)B 001273，保藏号为1999年4月12日；蔷薇小单孢菌IDR-P₇的保藏号为NCAIM(P)B001274，保藏日期为1999年4月12日。
基于上述内容，本发明涉及一种通过浸没培养在有氧发酵过程中能够对通式(II)化合物进行6β-羟基化的菌株并分离和纯化在生物转化过程中形成的式(I)化合物，由通式(II)化合物制备式(I)的普伐他汀的新的微生物方法，


其中R代表碱金属或铵离子，该方法包括以下步骤：
(a)在25-32℃下利用含有可同化的碳源和氮源以及无机盐的营养培养基培养属于小单孢菌属的种的菌株，该菌株能够在6β-位置上对通式(II)化合物进行羟基化，其中R如上所定义，然后
(b)将需要被转化的底物补加到生长好的培养物(developedculture)中，然后
(c)对底物进行羟基化直至完成生物转化，然后
(d)从培养液中分离式(I)化合物，如果需要，对该化合物进行纯化。
本发明的范围延伸到能够将酸式密实菌素的钠盐羟基化为普伐他汀的属于小单孢菌属菌种的野生型菌株和任何突变菌株。
根据本发明的优选实施方案，用选自小单孢菌属种IDR-P₃[NCAIM(P)B 001268]、绛红小单孢菌IDR-P₄[NCAIM(P)B001271]、棘孢小单孢菌IDR-P₅[NCAIM(P)B 001272]、黑孢小单孢菌IDR-P₆[NCAIM(P)B 001273]和蔷薇小单孢菌IDR-P₇[NCAIM(P)B001274]的小单孢菌属菌株制备普伐他汀。
根据本发明最优选的实施方案，用小单孢菌属种菌株IDR-P₃[NCAIM(P)B 001268]制备普伐他汀。
可以通过原位(insitu)发酵方法来实现本发明，即，通过生长旺盛的小单孢培养物的参与来实现羟基化。
当式(II)化合物被加到生长培养基中后，通过采用搅拌如振荡-摇瓶培养或在发酵罐中通气和搅拌来进行羟基化反应。这种情况下，可以加入消泡剂。通过采用含有可利用碳源和氮源、无机盐以及痕量元素的适当培养基能够使该菌株达到适当的培养密度。
例如，葡萄糖、甘油、糊精、淀粉、鼠李糖、木糖、蔗糖和可溶性淀粉被证明是可同化的碳源，而大豆粉、玉米浆、蛋白胨、酵母抽提物、肉膏、柠檬酸铵和硫酸铵为有利的氮源。可以将无机盐如碳酸钙、磷酸钠、磷酸钾等加到培养基中。用于该选定菌株生长的优选培养基是实施例中所述的那些培养基。
密实菌素向普伐他汀的生物转化可以通过不同的发酵技术，例如分批培养和补料分批培养来完成。优选地，采用一种搅拌式液体浸没培养。优选的培养温度是大约25℃至37℃，最优选地是大约25℃至32℃。
优选的pH是大约6.0至9.0，最优选地是大约7.0至8.5。优选的振荡条件是大约200rpm至400rpm，最优选地是大约250rpm。
本发明提供了一种将密实菌素酸钠盐转化为普伐他汀的方法。密实菌素酸钠盐能以任何将导致产生普伐他汀的浓度来加以利用。优选地，密实菌素的浓度是0.1至10g/升，更优选地是0.3至3.0g/升。
本发明旨在包括通过小单孢菌属种的菌株将密实菌素转化为普伐他汀的任何转化百分率，至少是30％，最优选地是至少约90％。
在发酵过程中，培养液的组分通过高效液相色谱(HPLC)方法来调控。根据HPLC方法，培养液样品用甲醇稀释两倍，离心后取上清液来进行分析。用于分析的HPLC系统的参数是：Waters分析用HPLC设备；柱填料：Waters Novapack C₁₈ 5μm；测量：在237nm；加样体积10μl；流速0.6-0.9ml/分钟线性梯度；采用梯度洗脱，洗脱液：溶剂A＝乙腈-0.1M NaH₂PO₄水溶液(25∶75)，溶剂B＝乙腈-水(用H₃PO₄将pH调到2)(70∶30)。
梯度洗脱参数：

时间(分钟)流速(ml/分钟)洗脱液A(％)洗脱剂B(％)    0    2    12    21    22    27    0.6    0.7    0.9    0.9    0.9    0.7    100    100    0    0    100    100    0    0    100    100    0    0
滞留时间：普伐他汀(钠盐)10.6分钟；密实菌素(酸钠盐)19.5分钟；普伐他汀(内酯形式)17.3分钟；密实菌素(内酯形式)23.5分钟。
任何已知的方法都可以被用于普伐他汀的分离，例如萃取-反复萃取，阴离子交换层析，沉淀。
为了从培养液中回收所述产物，有利地是要考虑这样一个事实，即在生物转化过程中，普伐他汀以其酸的形式形成，因此通过其与阴离子交换树脂柱的吸附可以从滤液中分离出普伐他汀。为了分离所述产物，有利地是采用强碱性阴离子交换树脂，该树脂是一种含有季铵活性基团的聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，例如Dowex AI 400(OH^-)，Dowex 1×2(OH^-)，Dowex 2×4(OH^-)，Amberlite IRA900(OH^-)树脂。利用含水乙酸或含氯化钠的丙酮-水混合物，优选地是利用含1％氯化钠的丙酮-水(1∶1)混合物，可以将吸附在离子交换树脂上的产物从柱上洗脱下来。将含有普伐他汀的分步收集液混合并真空蒸馏掉洗脱物中的丙酮。用15％的硫酸将浓缩物的pH调节到3.5-4.0的范围并且用乙酸乙酯提取酸化的水溶液。通过1/10和1/20体积比的5％碳酸氢钠或弱碱水溶液(pH7.5-8.0)从乙酸乙酯提取物中可以提取普伐他汀。经验告诉我们，通过利用非离子吸附树脂的柱层析从上述获得的碱性含水提取物中可以回收到纯的普伐他汀。一种有利的方法是，首先通过真空蒸馏从碱性含水提取物中除去溶解在水相中的乙酸乙酯，然后将含水提取物上样到Diaion HP-20柱上。采用含水丙酮洗脱纯化吸附在柱上的普伐他汀，其中含水丙酮中的丙酮含量逐渐增加，然后混合只含单一成分普伐他汀的色谱分步收集液并利用真空进行浓缩。用木炭对该浓缩物进行脱色并进行冻干，然后用乙醇-乙酸乙酯混合物进行结晶，以医药应用可接受的质量提供普伐他汀。
完成生物转化后，可以从发酵液中或从分离了菌丝团后获得的滤液中提取普伐他汀。菌丝团可以通过过滤或离心来除去，然而，特别是在工业规模上，进行全液提取是有利的。提取前，用无机酸，优选地用稀释的硫酸，将发酵液或发酵液的过滤液的pH调节到3.5-3.7。用含有2-4个碳原子的脂族醇的乙酸酯，优选地用乙酸乙酯或乙酸异丁酯进行提取。用水冲洗乙酸乙酯提取物并用无水硫酸钠进行干燥。然后由普伐他汀制备内酯衍生物。内酯环的闭合是在室温下的干燥乙酸乙酯溶液中，在不断的搅拌下通过利用催化量的三氟乙酸诱导内酯的形成来完成的。通过薄层层析分析(TLC)检测内酯环的闭合情况。内酯形成后，首先用5％的碳酸氢钠水溶液和然后用水冲洗所述乙酸乙酯溶液，并用无水硫酸钠进行干燥，然后进行真空蒸发。剩余物采用硅胶柱层析进行纯化，利用其中乙酸乙酯的含量逐渐增加的乙酸乙酯-正己烷混合物作洗脱剂。通过在室温下利用等量的氢氧化钠在丙酮中水解普伐他汀内酯来制备普伐他汀。当形成普伐他汀的钠盐后，用丙酮沉淀普伐他汀。然后，将沉淀过滤并用丙酮和正己烷冲洗并进行真空干燥，然后用乙醇-乙酸乙酯混合物进行结晶。
已发现，利用Sephadex LH-20凝胶进行层析对于纯化普伐他汀是有利的。通过采用该方法，能够制备出纯度超过99.5％(通过HPLC测定)的普伐他汀。
在我们的实验中，认为存在以下发明：利用仲胺从小单孢菌属的IDR-P₃菌株的培养液或过滤培养液的有机溶剂提取物中，优选乙酸乙酯或乙酸异丁酯提取物中，能够以结晶盐的形式将普伐他汀沉淀出来，所述菌株能够在6β-位置上对通式(II)的化合物进行羟基化。还发现，含有烷基、环烷基、芳烷基或芳香基取代基的几种仲胺适合于所述盐的形成。合适的非毒性仲胺选自，例如二辛胺、二环己基胺、二苄胺。有机仲胺盐中间体(例如二苄胺盐)的分离是通过加入相当于提取物中的普伐他汀含量1.5倍量的二苄胺来完成的，然后通过真空蒸馏将所述提取物浓缩到其初始体积的5％，然后，以相当0.2倍的量将另一部分二苄胺加到浓缩物中。二苄胺盐的结晶从浓缩物中沉淀出来。将结晶粗提物过滤并进行真空干燥，并且在甲醇或丙酮溶液中采用木炭进行脱色。然后利用丙酮对脱色产物进行重结晶从而可以获得色谱纯的普伐他汀二苄胺盐中间体。
通过氢氧化钠或醇钠(优选地是乙醇钠)可以将普伐他汀有机仲胺盐转化为普伐他汀。
通过仲胺盐中间体分离普伐他汀是一种比任何已知分离方法简单的方法。在该过程中不形成矫作物，并且可有利地解决从生物转化的副产物以及从羟基化微生物生物合成的多种代谢产物中分离普伐他汀的问题。
本发明的方法通过下列实施例进行说明。
实施例
实施例1
从7-10天龄的小单孢菌属的IDR-P₃[NCAIM(P)B 001268]菌株的可溶性淀粉琼脂(SM)斜面培养物表面中收集孢子并将孢子悬浮在5ml的无菌蒸馏水中。然后将该悬浮液接种到装在500ml锥形瓶中的100ml无菌TI接种培养基中。
SM培养基的组成
可溶性淀粉              10.0g
Na₂HPO₄                 1.15g
KH₂PO₄                  0.25g
KCl                       0.2g
MgSO₄×7H₂O             0.2g
琼酯                      15.0g
溶于1000ml的蒸馏水中
灭菌前将培养基的pH调到7.0并且在121℃下灭菌25分钟。
TI培养基的组成
可溶性淀粉               20.0g
酵母抽提物               10.0g
溶于1000ml的自来水中
灭菌前将培养基的pH调到7.0并且在121℃下灭菌25分钟。
生长培养物于32℃下在摇床(250rpm；振幅：2.5cm)上振荡培养3天，然后将5ml的各等分培养液分别接种到10个500ml的锥形瓶中，每一锥形瓶装有100ml的经121℃灭菌25分钟的TT培养基。
TT培养基的组成
马铃薯淀粉             30.0g
大豆粉                 30.0g
CaCO₃                 5.0g
CoCl₂×6H₂O          2.0mg
棕榈油                 2.0g
溶于1000ml的自来水中
加热灭菌前将培养基的pH调到7.0。
在32℃下培养72小时，然后将溶于蒸馏水中的50mg密实菌素酸钠盐加到每一个锥形瓶中，再培养96小时。通过HPLC测定密实菌素酸钠盐转化为普伐他汀的转化率为82％。
发酵结束后，合并所有培养物，按照下列步骤从所获得的合并的发酵液中分离普伐他汀，所述发酵液中含有410mg的普伐他汀：以2500rpm将所述发酵液离心20分钟。分离上清液和菌丝团，然后将菌丝团重新悬浮在250ml的水中并且将所得到的悬浮液搅拌1小时并过滤。用15％的硫酸将混合的离心液和滤液的pH调到4.0，然后采用3×300ml的乙酸乙酯对该酸性滤液进行提取。用300ml的水洗涤合并的乙酸乙酯提取物，用无水硫酸钠干燥该提取物并将其体积真空浓缩到100ml。然后，通过在室温下加入催化量的三氟乙酸并同时不停地搅拌来由普伐他汀制备普伐他汀内酯。普伐他汀内酯的形成由TLC方法调控：吸附剂：Kieselgel 60 F₂₅₄ DC(Merck)铝箔；展开剂：丙酮-苯-乙酸(50∶50∶1.5)混合物；检测：磷钼酸试剂。普伐他汀内酯的R_f值为0.7。所述内酯的形成后，用2×20ml的5％碳酸氢钠水溶液洗涤乙酸乙酯然后再用20ml的水洗涤，用无水硫酸钠干燥并进行真空蒸发。获得0.5g的脱水残留物，利用填充了10g的Kieselgel60吸附剂的柱(柱的直径：1.2cm，吸附床的高度：17cm)对所述残留物进行色谱分离。用乙酸乙酯-正己烷混合物进行洗脱，其中该混合物中的乙酸乙酯的含量逐渐增加。用60％的乙酸乙酯-40％的正己烷混合物从柱上洗脱普伐他汀内酯。将含有普伐他汀内酯的分步收集液合并起来并进行真空脱水。获得的含有230mg的普伐他汀内酯的残留物被溶解在5ml的丙酮中，然后在搅拌下加入1M乙醇溶液中的110摩尔％的氢氧化钠。在室温下对溶液的搅拌持续半小时。接着，将所述溶液体积浓缩到2ml并向该浓缩物中加入4ml的丙酮。该混合物在+5℃下过夜。沉淀进行过滤，用2ml的丙酮冲洗，然后再用2ml的正己烷冲洗并在室温下真空干燥。将得到的粗制普伐他汀溶解在乙醇中，通过木炭脱色，然后用乙醇-乙酸乙酯的混合物进行结晶。以这种方法获得了170mg的普伐他汀。
熔点170-173℃(裂解(decomp.))。
[α]_D²＝+156°(c＝0，5，水中)。
紫外吸收光谱(20μg/ml，在甲醇中)：λ_max＝231，237，245nm(logε＝4.263；4.311；4.136)。
红外吸收光谱(KBr)：νOH3415，νCH2965，νC＝O 1730，νCOO^-1575cm^-1。
¹H-NMR光谱(D₂O，δ，ppm)：0.86，d，3H(2-CH₃)；5.92，dd，J＝10.0和5.4Hz，1H(3-H)；5.99，d，J＝10.0Hz，1H(4-H)；5.52，br，1H(5-H)；4.24，m，1H(6-H)；5.34，br，1H(8-H)；4.06，m，1H(β-H)，3.65，m，1H(δ-H)；1.05，d，3H(2’-CH₃)；0.82，t，3H(4’-H₃)。
¹³C-NMR光谱(D₂O，δ，ppm)：15.3，q(2-CH₃)；139.5，d(C-3)，129.5，d(C-4)，138.1，s(C-4a)，127.7，d(C-5)；66.6，d(C-6)；70.1，d(C-8)；182.6，s(COO^-)；72.6，d(C-β)；73.0，d(C-δ)；182.0，s(C-1’)；18.8，q(2’-CH₃)；13.7，q(C-4’)。
正FAB质谱(特征离子)：[M+Na]⁺469；[M+H]⁺447。
负FAB质谱(特征离子)：[M-H]^-445；[M-Na]^-423，mlz 101[2-甲基-丁酸-H]^-。
实施例2
在10个含有100ml的无菌MT₁生物转化培养基的500ml锥形瓶中接种上实施例1中所制备的接种培养物，然后在28℃培养96小时并且将溶于蒸馏水中的50mg的密实菌素酸钠盐加到每个锥形瓶中，然后进行72小时的羟基化反应，将溶于蒸馏水中的50-50mg的另一部分底物加到培养物中后继续发酵72小时。
MT₁生物转化培养基的组成
马铃薯淀粉                 10.0g
葡萄糖                     20.0g
大豆粉                     10.0g
酵母抽提物                 10.0g
CaCO₃                     5.0g
向日葵油                   2.0g
溶于1000ml的自来水中
灭菌前将生物转化培养基的pH调到7.0。混合物在121℃下灭菌25分钟。
生物转化期结束后，合并所有培养物，按照下列方法从合并的发酵液中分离普伐他汀：将通过HPLC测定的含有750mg普伐他汀的合并发酵液以2500rpm离心20分钟。向分离的菌丝团中加入250ml水后搅拌1小时，然后过滤。将离心液和滤液混合后用15％的硫酸将所得溶液的pH调到3.5-4.0，然后采用3×300ml的乙酸乙酯对该溶液进行提取。将相对普伐他汀含量的150摩尔％的二苄胺加到乙酸乙酯提取物中。该乙酸乙酯提取物被蒸发浓缩到大约30ml的体积并且将该悬浮液保持在0-5℃下过夜。密实菌素酸二苄胺盐沉淀被过滤出来并在滤器上用冷却的乙酸乙酯和正己烷冲洗，最后进行真空干燥。将1.1g的粗制密实菌素酸二苄胺盐溶解在33ml的62-66℃的丙酮中，并用0.1g的木炭将该溶液脱色半小时。过滤除去溶液中的木炭。将从脱色液中沉淀出来的结晶在上述温度下再度溶解，然后该溶液被保持在+5℃下过夜。过滤出沉淀，并用冷却的丙酮和正己烷进行冲洗，然后真空干燥。得到的密实菌素酸二苄胺盐(0.7g)被悬浮在10ml的乙醇中，然后通过补加1M的水溶液向该溶液中加入110摩尔％的氢氧化钠。在室温下将该碱性溶液持续搅拌半小时。钠盐形成后加入30ml的水并中和该溶液的pH值，然后真空蒸发掉乙醇。利用填充了50ml的Diaion HP 20树脂的色谱柱(柱直径：1.5cm，树脂床高度：28cm)对含水浓缩物进行色谱分离。用丙酮-去离子水混合物洗脱柱子，其中混合物中的丙酮浓度以5％的梯度增加。用含有15％丙酮的丙酮-去离子水混合物能从柱中洗脱出普伐他汀。通过实施例1中给出的TLC方法分析分步收集液。普伐他汀的Rf值为0.5。将含有普伐他汀的分步收集液合并起来并真空蒸发掉丙酮成分。通过冻干含水的残留物，获得了390mg的色普纯普伐他汀。
实施例3
将实验室用发酵罐中的4.5升的TT/2培养基在121℃下灭菌45分钟，然后接种上500ml的如实施例1中制备的接种振荡培养物，然后在32℃下、以250l/h的流速通入无菌空气并通过扁平叶片搅拌器以300rpm进行搅拌。培养进行72小时并将2.5g的密实菌素酸钠盐加到培养物中。生物转化48小时后发酵液中的密实菌素底物被全部消耗，然后再向培养物中另外加入2.5g的密实菌素酸钠盐。第二次加入的密实菌素在24小时内被消耗。在生物转化过程中，密实菌素酸钠盐转化为普伐他汀的转化率大约为90％。
TT/2生物转化培养基的组成
葡萄糖                   75.0g
可溶性淀粉               50.0g
大豆粉                 50.0g
酵母抽提物             50.0g
蛋白胨                 5.0g
NaNO₃                 20.0g
CaCO₃                 25.0g
溶于4500ml的自来水中
实施例4
将实验室用发酵罐中的4.5升的TT/1培养基在121℃下灭菌45分钟，然后接种上500ml的如实施例1中制备的接种振荡培养物，然后在28℃下、以200l/h的流速通入无菌空气并通过扁平叶片搅拌器以400rpm进行搅拌。
TT/1生物转化培养基的组成
葡萄糖                   125.0g
马铃薯淀粉               25.0g
大豆粉                   50.0g
酵母抽提物(Gistex)       50.0g
蛋白胨                   50.0g
CoCl₂×6H₂O            10.0mg
向日葵油                 10.0g
溶于4500ml的自来水中
灭菌前将生物转化培养基的pH调到7.0。
培养在28℃下进行96小时。这时将溶解在过滤除菌水中的2.5g密实菌素酸钠盐加到培养物中。发酵的第5天，发酵液中的密实菌素酸钠盐被全部消耗。然后每天以2.5g/天的量重复补加底物，持续3天。密实菌素酸钠盐在4天内被逐渐消耗而完全转化为普伐他汀。根据HPLC测定的结果，发酵结束后由10g的密实菌素底物产生了9g的普伐他汀。
生物转化结束后，按照下面的方法分离形成的浓度为1800μg/ml的普伐他汀：
以2500rpm将5升的培养液离心20分钟。然后将2升的水加到分离的菌丝团中并将悬浮液搅拌1小时并过滤。合并这两种过滤液并以500ml/小时的流速通过填充了300g(540ml)的Dowex AI 400(OH^-)树脂的色谱柱(柱直径：4cm，树脂床高度：43cm)，然后用1升的去离子水冲洗树脂床。其后用含有10g的氯化钠的1升丙酮-水(1∶1)混合物洗脱柱子，以50ml的量分步收集洗脱液。采用实施例1中的TLC方法分析分步收集洗脱液。合并含有所述产物的分步收集洗脱液并真空蒸馏掉丙酮。用15％的硫酸将得到的浓缩物的pH调到3.5-4.0，然后通过3×250ml的乙酸乙酯进行提取。将40ml的去离子水加到合并的乙酸乙酯提取物中，然后用1M的氢氧化钠将pH调到7.5-8.0。搅拌15分钟后，水相和乙酸乙酯相被分开，然后按照上述方法用2×40ml的去离子水提取乙酸乙酯溶液。合并后的碱性水溶液被浓缩到50ml的体积并利用填充了600ml的Diaion HP 20(Mitsubishi Co.，日本)非离子吸附树脂的色谱柱(柱直径：3.8cm，树脂床高度：53cm)对该浓缩物进行色谱分离。用600ml去离子水冲洗该色谱柱，然后用丙酮-去离子水混合物洗脱柱子，其中丙酮的浓度以5％的梯度增加，以50ml的量分步收集洗脱液。通过实施例1中给出的TLC方法分析洗脱物。用含15％丙酮的丙酮-去离子水混合物将普伐他汀从柱子中洗脱出来。合并含有作为单一成分的普伐他汀的分步收集液并且将该溶液真空浓缩到150ml的体积。接下来，将0.6g的木炭加至该浓缩的水溶液中并在室温下将普伐他汀脱色1小时。然后过滤除去木炭并对滤液进行冻干。得到的6.5g的冻干普伐他汀用乙醇和乙酸乙酯的混合物结晶两次。过滤出沉淀并用20ml的乙酸乙酯和20ml的正己烷冲洗，并在室温下真空干燥。由此获得了4.6g的色谱纯普伐他汀。
实施例5
用5ml的无菌蒸馏水按照实施例1所述由10天龄的棘孢小单孢棘孢亚种IDR-P₅[NCAIM(P)B 001272]菌株的可溶性淀粉琼脂斜面培养物的表面制备孢子悬浮液，所述菌株能够对密实菌素酸钠盐进行6β-羟基化，然后将获得的孢子悬浮液接种到500ml锥形瓶中的100ml无菌TI接种培养基中。TI培养基的组成如实施例1所述。接种后的培养基在28℃下利用摇床振荡(250rpm，2.5cm振幅)培养3天，然后将长好的培养物以5ml的等分分别转移到500ml锥形瓶中的100-100ml无菌TT/1生物转化培养基中，该培养基已在121℃下灭菌25分钟。TT1培养基的组成如实施例4所述。锥形瓶在25℃下利用摇床振荡(250rpm，2.5cm振幅)培养3天，然后以无菌过滤水溶液的形式将10-10mg的密实菌素底物(密实菌素酸钠盐)加到所述培养物中，然后继续发酵培养168小时。
生物转化结束后，利用HPLC方法测定发酵液中的普伐他汀的含量。这时普伐他汀的平均浓度为40μg/ml。
实施例6
采用黑孢小单孢菌黑色亚种的IDR-P₆[NCAIM(P)B 001273]菌株按照实施例5所述的方法进行发酵、底物的添加以及生物转化。利用HPLC方法测定发酵液中的普伐他汀的含量。生物转化结束后，发酵液中的普伐他汀含量为50μg/ml。
实施例7
将按照实施例1的方法制备的绛红小单孢菌IDR-P₄[NCAIM(P)B001271]菌株接种培养物以5ml的等分量分别接种到500ml锥形瓶中经121℃下灭菌25分钟的100-100ml无菌TT/14培养基中。
TT/14培养基的组成
马铃薯淀粉              5.0g
葡萄糖                  25.0g
酵母抽提物(GISTEX)      15.0g
蛋白胨                  15.0g
CaCO₃                  1.0g
溶于1000ml的自来水中
灭菌前将生物转化培养基的pH调到7.0。
锥形瓶利用摇床振荡(250rpm，2.5cm振幅)培养3天。按照实施例5所述的方法进行底物的添加、生物转化以及普伐他汀含量的测定。生物转化结束后，发酵液中的普伐他汀含量为40μg/ml。
实施例8
按照实施例1的方法利用蔷薇小单孢菌的IDR-P₇[NCAIM(P)B001274]菌株进行发酵培养、底物的添加和生物转化。生物转化结束后，利用HPLC方法测得发酵液中的普伐他汀含量为350μg/ml。