喹诺酮羧酸衍生物或其盐.pdf

喹诺酮羧酸衍生物或其盐
技术领域
本发明涉及一种喹诺酮类药物，特别是涉及喹诺酮羧酸衍生物或它们的盐类。
背景技术
喹诺酮类药物是近年来迅速发展起来的抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌力强、结构简单、给药方便，与其它常用抗菌药物无交叉耐药性，合成方法生产、疗效价格比高等优势，因而愈来愈受到各国的重视，成为竞相生产和应用的热点药品。
在品种上，已上市的喹诺酮产品有几十个品种，是抗感染药物中开发最活跃的领域之一。随着药物化学的发展，现在人们可以推测许多侧链可能具有的某种药化性质，因而可以通过计算机优化结构及选定药物的发展方向，比如研究针对MRSA、铜绿假单胞菌或结核杆菌，甚至设计具有抗肿瘤作用的喹诺酮类化合物，其发展趋势将有可能超过β内酰胺类药物，成为21世纪的抗感染药物的主要品种。目前市场上销售的产品常见的是司帕沙星(Sparfloxacin Spara)，那氟沙星(NadifloxacinAcuatin)，左氧氟沙星(Levofloxacin Cravit)，格帕沙星(Grepafloxacin Vaxar)，曲伐沙星(Trovafloxacln Trovan)，阿拉沙星(AlatrafloxaclnTrovan IV)等等。
喹诺酮产品有希望占据抗感染药物的最大份额，因此有人预言21世纪将是喹诺酮时代。
在这些产品当中，左氧氟沙星自上市以来，以其高效、广谱、安全等特点，与当前国际喹诺酮类发展研究方向相吻合，得到广泛应用。据日本国内统计，1998年左氧氟沙星年销售240亿日元，位居所有处方药第四位，抗感染药物第一位，这是喹诺酮药物发展史上的一个里程碑。日本市场1996～1998年前十位药品销售排序。
自20世纪90年代后期开始研制，并已陆续进入临床试验，预计几年内即可正式上市的最新一代喹诺酮产品，这一阶段产品有些结构较前阶段的经典产品有很大的改进，而更重要的是其药理特性较以往又有了巨大的改善，有些产品的抗菌谱及抗菌力达到了新的高峰，对大部分致病菌来讲，已经达到或超过了抗菌药物的王牌β内酰胺类抗生素，甚至达到了“Tienam”的指标。从这一阶段开始，喹诺酮产品有希望占据抗感染药物的最大份额，有人预言21世纪将是喹诺酮时代。
这一阶段的产品包括加替沙星(gatifloxacin)，巴洛沙星(balofloxacin)，克林沙星(clinafloxacin)，帕珠沙星(Pazufloxacin)，普卢利沙星(prulifloxacin)，noxlfloxacin等等。
但是，喹诺酮类药物也存在副作用，以胃肠道反应和皮疹为多见，偶有肝、肾受损，头痛、失眠，诱发癫痫，影响骨发育等。美国曾对2829例使用环丙沙星的病人进行了药物不良反应发生率统计，其不良反应发生率：消化道7.8％、中柢神经系统3.3％，代谢怀营养方面2.8％，皮肤反应1.8％，血液与淋巴1.0％，心血管、呼吸系统异常感觉等均少于1％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的喹诺酮羧酸衍生物或其盐。
为了完成本发明的目的，本发明提供一种通式(I)的喹诺酮羧酸衍生物或其盐，

其中，
R₁代表氢原子或羧基保护基团；R₂代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基；A代表氮原子或C-Y，其中Y为卤原子，低级烷基，低级烷氧基或被卤原子取代的低级烷氧基；R₃代表含氮螺环或双环化合物；R₄代表氢原子或卤原子。
通式(I)中，R₄代表卤原子时优选为氟原子。
在上述的通式(I)的喹诺酮羧酸衍生物或其盐中，R₃可优选如下基团：

其中
n代表1-4；该基团可以为混旋或纯立体异构构型存在；或

其中
n代表1-2；该基团可以为混旋或纯立体异构构型存在。
本发明还提供了通式(I)所述的喹诺酮羧酸衍生物或其盐制备方法。

其中
R₁代表氢原子或羧基保护基团；R₂代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基；A代表氮原子或C-Y，其中Y为卤原子，低级烷基，低级烷氧基或被卤原子取代的低级烷氧基；R₃代表含氮螺环或双环化合物；R₄代表氢原子或卤原子。
在通式(I)中，R₄代表卤原子时优选为氟原子。
更具体地说，本发明的具体的优选化合物包括：
化合物(1)：7-(7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-甲氧基-6-氟-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
化合物(2)：(+)-7-(7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-甲氧基-6-氟-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
化合物(3)：(-)-7-(7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-甲氧基-6-氟-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
化合物(4)：7-(7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-二氟甲氧基-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
化合物(5)：(+)-7-(7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-二氟甲氧基-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
化合物(6)：(-)-7-(7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-二氟甲氧基-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
化合物(7)：1-环丙基-7-(2，8-二氮杂双环[4.3.0]壬-8-基)-8-二氟甲氧基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
化合物(8)：1-环丙基-7-([R，R]-2，8-二氮杂双环[4.3.0]壬-8-基)-8-二氟甲氧基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
化合物(9)：1-环丙基-7-([S，S]-2，8-二氮杂双环[4.3.0]壬-8-基)-8-二氟甲氧基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
化合物(10)：7-(2，8-二氮杂双环[4.3.0]壬-8-基)-6-氟-8-甲氧基-1-(1，2-顺式-2-氟代环丙基)-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
化合物(11)：7-([S，S]-2，8-二氮杂双环[4.3.0]壬-8-基)-6-氟-8-甲氧基-1-(1，2-顺式-2-氟代环丙基)-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
化合物(12)：7-([R，R]-2，8-二氮杂双环[4.3.0]壬-8-基)-6-氟-8-甲氧基-1-(1，2-顺式-2-氟代环丙基)-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸；
以及它们的盐。
本发明因此还涉及含有作为活性成份的有效剂量的至少一种通式(I)化合物和/或其立体异构体以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物，特别是一种含有药物有效剂量的通式(I)化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-90重量％的通式(I)化合物和/或其生理上可接受的盐。
药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将通式(I)化合物和/或立体异构体与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明的通式(I)化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等，可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分通式(I)化合物或其立体异构体与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分通式(I)化合物或其立体异构体制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化地异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
本发明通式(I)化合物或其立体异构体的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体化合物，给药途径及给药次数等。本发明的化合物可以参照公知的同类化合物的用药剂量。使用剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。
本发明获得的化合物突出的特点是具有良好的抗菌活性，并且具有较低的毒性。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
实施例一
下面对式(II)化合物的合成作如下说明(以7-叔丁氧羰基氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷为例)：

其中

这种化合物也可以拆分得到纯立体异构体。
乙酰乙酸乙酯的羰基的保护用生成缩酮的办法，反应用苯或甲苯作为溶剂，用乙二醇或乙二硫醇作为保护基，同时加入路易斯酸(对甲苯磺酸，五氯化磷等)作为催化剂，回流分水，产率一般很高。酯的胺解一般用醇作为溶剂在甲醇钠或乙醇钠的作用下即可。缩酮经酸水解得到相应的酮。乙酰乙酸苄酰胺和1，2-二溴乙烷在碱(无水碳酸钠，无水碳酸钾，氢氧化钠，氢氧化钾，醇钠，醇钾等)的作用下，用N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜作为溶剂可得到三元环化合物。肟用锂铝氢还原直接得到伯胺，同时酰胺的羰基直接还原到烷基。
实施例二
7-(7-叔丁氧羰基氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-甲氧基-6-氟-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸根-硼-二乙酸酐的制备
1-环丙基-6，7-二氟-8-甲氧基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸根-硼-二乙酸酐4.27g(0.01mol)，乙腈43ml，7-叔丁氧羰基氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷2.544g(0.012mol)，三乙胺3ml，混合物室温搅拌至反应完全，浓缩反应液至干，加入二氯甲烷50ml、水20ml，搅拌后分出有机层，饱和食盐水洗涤，干燥有机层，浓缩有机层得橘黄色泡状固体。
实施例三
7-(7-叔丁氧羰基氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-甲氧基-6-氟-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸的制备
7-(7-叔丁氧羰基氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-甲氧基-6-氟-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸根-硼-二乙酸酐5g(8.08mmol)，乙醇50ml，水13ml，三乙胺10ml，混合物回流反应6小时，浓缩，用乙醇带干三乙胺，得到黄色固体，直接投入下步反应。
实施例四
7-(7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-甲氧基-6-氟-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸盐酸盐的制备
7-(7-叔丁氧羰基氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-甲氧基-6-氟-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸3.6g(7.17mmol)，加入5ml乙醇和5ml盐酸(6mol/l)，回流2小时，浓缩，用乙醇带干，残留物中加乙醇搅拌析晶，过滤，洗涤，得黄色固体，此固体用95％乙醇重结晶，得纯度99％以上黄色晶体(熔点：221-225℃)。即7-(7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-甲氧基-6-氟-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸盐酸盐，化合物(1)。
IR(KBr)：3480，1726，1634，1570，1506，1446，1366，1332，1242，1154，1052，798cm^-1。
实施例五
采用同实施例四相同的步骤，同样可以得到7-(7-(S)-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-甲氧基-6-氟-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸盐酸盐，不同的是采用的反应物或反应物的剂量有些不同等等。
实施例六
采用同实施例四相同的步骤，同样可以得到7-(7-(R)-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-甲氧基-6-氟-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸盐酸盐，化合物(2)不同的是采用的反应物或反应物的剂量有些不同。
实施例七
采用同实施例四相同的步骤，同样可以得到7-(7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-二氟甲氧基-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸盐酸盐，即化合物(4)不同的是采用的反应物或反应物的剂量有些不同等等。
实施例八
采用同实施例四相同的步骤，同样可以得到(+)-7-(7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-二氟甲氧基-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸盐酸盐，不同的是采用的反应物或反应物的剂量有些不同等等。
实施例九
采用同实施例四相同的步骤，同样可以得到(-)-7-(7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-5-基)-8-二氟甲氧基-1-环丙基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸盐酸盐，不同的是根据本领域技术人员对本发明的理解，采用的反应物或反应物的剂量有些不同等等。
实施例十
2，4，5-三氟-3-羟基苯甲酰胺的制备
将150ml亚硫酰氯加到溶有50g(0.26mol)2，4，5-三氟-3-羟基苯甲酸的200ml苯的溶液中，混合物回流反应3小时。减压蒸除溶剂和过量的亚硫酰氯，用苯带尽亚硫酰氯，残留物滴入冷却搅拌下的750ml浓氨水中，滴完后在室温搅拌过夜，稀盐酸酸化，乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸钠干燥有机层，浓缩有机层，残留物用乙醚洗滤，得到43.7g白色固体，熔点：137-142.5℃。
实施例十一
3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰胺的制备
40g(0.208mol)2，4，5-三氟-3-羟基苯甲酰胺溶于200ml DMF中，加入粉状碳酸钾38g(0.275mol)，再加入溶有100g氯二氟甲烷的DMF溶液500ml混合物在高压釜中95-110℃搅拌3-5小时，出料后过滤，滤液中加入水1500ml，用乙醚300ml×3萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机层，浓缩有机层，残留物用正己烷搅拌析晶，得类白色晶体38.7g，熔点：108-111℃。
实施例十二
3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酸的制备
16.4g(0.239mol)亚硝酸钠溶于75ml水中，形成的溶液慢慢滴入搅拌和冰冷下的溶有38.5g 3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰胺的50ml浓硫酸中。加完后回流0.5小时，冷至室温，加入冷水100ml，用二氯甲烷100ml×3萃取，水洗，无水硫酸镁干燥有机层，浓缩有机层，残留物用二氯甲烷/正己烷搅拌析晶，得类白色晶体32.6g，熔点：68.5-71℃。
实施例十三
3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰氯的制备
3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酸50g(0.21mol)，亚硫酰氯250ml混合回流3小时，浓缩，用甲苯带尽亚硫酰氯，得油状物，密封备用。
实施例十四
3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰丙二酸二乙酯的制备
将丙二酸二乙酯35g，乙醇20ml，甲苯80ml混合形成的溶液缓慢滴入搅拌下的5g新鲜镁片、20ml无水乙醇、2ml四氯化碳形成的混合物中，调节滴加速度使反应自发进行。滴完后，加热回流2小时。冷冻至-5-0℃，滴加3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰氯(上步全量)溶于20ml甲苯形成的溶液，滴完后，在-5-0℃反应1小时，恢复至室温反应2小时，用1N硫酸调pH＝3左右，加入100ml甲苯，充分搅拌，分出有机层，水层用甲苯100ml×2萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机层，浓缩得油状3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰丙二酸二乙酯。
实施例十五
3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰乙酸乙酯的制备
将全部3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰丙二酸二乙酯加水80ml，再加入一水合对甲苯磺酸0.5g，混合物搅拌回流9小时，冷却，用二氯甲烷100ml×3萃取，水洗，无水硫酸镁干燥有机层，浓缩得油状物54.5g。
实施例十六
3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰丙烯酸乙酯的制备
3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰乙酸乙酯54.5g，加入乙酸酐40ml，原甲酸三乙酯80ml，混合物回流8小时。减压浓缩干，得油状产物。
实施例十七
3-环丙基氨基-2-(3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰基)丙烯酸乙酯的制备
3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰丙烯酸乙酯全量，溶于无水乙醇90ml中，冷水浴下滴加15ml环丙基氨，加完后室温反应2小时。浓缩反应液，得油状物(久置后固化)。
实施例十八
1-环丙基-8-二氟甲氧基-6，7-二氟-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸乙酯的制备
3-环丙基氨基-2-(3-二氟甲氧基-2，4，5-三氟苯甲酰基)丙烯酸乙酯全量，溶于150ml DMSO，加入粉状无水碳酸钾，90℃反应2小时。反应液倾入冰水中，搅拌30分钟，过滤，水洗至中性，抽干，烘干滤饼得浅黄色固体46g，熔点：217-224℃.TLC检测为一个点(展开剂：乙酸乙酯)。
实施例十九
1-环丙基-6，7-二氟-8-二氟甲氧基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸根-硼-二乙酸酐的制备
向硼酸13g和无水氯化锌0.3g的混合物中加入乙酸酐70ml，110℃反应1.5小时，向反应混合物中加入乙酸92ml，同温继续反应1小时。冷却，在50-60℃加入1-环丙基-8-二氟甲氧基-6，7-二氟-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸乙酯46g，再加入乙酸46ml，反应5小时，减压蒸干，加入冰水500ml，充分搅拌，过滤，滤饼以200ml水打浆，过滤，干燥得类白色固体58.5g。
实施例二十
1-环丙基-7-(2，8-二氮杂双环[4.3.0]壬-8-基)-8-二氟甲氧基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸盐酸盐的制备
1-环丙基-6，7-二氟-8-二氟甲氧基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸根-硼-二乙酸酐38.5g(0.083mol)溶于90ml乙腈，加入8-叔丁氧羰基-2，8-二氮杂双环[4.3.0]壬烷22.5g(0.10mol)，三乙胺15ml，室温反应过夜，浓缩干得泡状固体。
在此固体中加入乙醇600ml，水150ml，三乙胺60ml，搅拌回流6小时，浓缩干，乙醇带尽残留的三乙胺。
残留物中加入乙醇100ml，6N盐酸100ml，回流2小时，浓缩干，乙醇带干，以乙醇搅拌析晶，过滤，滤饼以乙醇/水(5∶1)重结晶，得目标化合物纯品。熔点：270-274℃。即1-环丙基-7-(2，8-二氮杂双环[4.3.0]壬-8-基)-8-二氟甲氧基-1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸盐酸盐(化合物7)
IR(KBr)：3328，2968，2896，2532，1704，1628，1516，1462，1374，1356，1320，1196，1146，1118，1082，1036，990，882，804cm^-1。
参考实施例一
7-叔丁氧羰基氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷的制备(II)
(1)乙酰乙酸乙酯乙二醇缩酮的制备(i)
取新蒸乙酰乙酸乙酯(31.20g，0.24mol)于1000ml三口瓶中，加对甲苯磺酸(2.50g，13.16mmol)、乙二醇(18ml)、无水苯(150ml)、装上水分离器和回流冷凝管，再在水分离器中加满甲苯(约30ml)，回流脱水3h。用饱和碳酸钠洗涤，苯反提一次，合并再用饱和食盐水洗涤至中性，用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，得化合物i粗品，为浅黄色油状液体(41.70g，100％)，无须提纯，直接用于下一步反应。参考沸点为bp110～116℃/25mmHg。
(2)乙酰乙酸苄酰胺的制备(ii)
在1000ml三口瓶中，加无水乙醇(150ml)、金属钠(5.75g，0.25mol)，回流反应，待钠全部溶解后，向反应瓶内加i(41.70g，0.24mol)及苄氨(25.70g，0.24mol)，继续回流反应5h后，再蒸出约130ml溶剂，加水(100ml)、滴加浓盐酸(45ml)，再回流反应1h后，再蒸出约100ml溶剂，降至室温，用二氯甲烷(100ml×3)萃取，合并有机层，用饱和食盐水洗涤至中性，用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，用乙醚洗滤出白色结晶，，得标题产物(ii)(21.30g，46.5％以乙酰乙酸乙酯计)，mp97～98℃。
¹HNMR(CDCl₃)：2.28(3H，S，-CH₃)，3.48(2H，S-CH₂-)，4.46-4.48(2H，d，j＝6.0Hz，-N-CH₂-ph)，7.20-7.40(5H，m，ph-H)
(3)1-乙酰基苄氨基羰环丙烷的制备(iii)
取化合物ii(28.65g，0.15mol)于500ml三口瓶中、加二溴乙烷(33.84g，0.18mol)、无水二甲基甲酰胺(140ml)、粉状无水碳酸钾(70.40g，0.51mol)水浴控制反应温度在室温(15-35℃)搅拌反应24h，加入冰水(400ml)，用乙醚(300ml×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤至中性，用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂加乙醚少许析出结晶，过滤得标题物(iii)(24.12g)。析晶母液用油泵蒸干溶剂(DMF)，加少量乙酸乙酯再析晶，可得iii(3.18g)。总收率83.9％，mp66～67℃。
¹HNMR(CDCl₃)：1.51-1.92(4H，2×m.环丙基两个-CH₂-)，1.96(3H，S，-CH₃)，4.48-4.51(2H，d，j＝5.4Hz，-CH₂-)，7.23-7.36(5H，m，ph-H)，9.22-9.28(1H，brs，NH).
(4)1-苄氨基羰基-1-(1，1-乙撑二氧乙基)环丙烷的制备(iv)
取化合物iii(21.70g，0.10mol)，乙二醇(30.00g，0.50mol)、无水甲苯(100-130ml)于500ml三口瓶中，加对甲苯磺酸(1.10g，5.79mmol)，回流脱水10h，降至室温，补加甲苯(200ml)，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，反提一次，用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后得标题物(iv)，为浅黄色油状液体(24.00g，100％)，无须提纯，直接用于下一步反应。
¹HNMR(CDCl₃)：0.86～1.16(4H，2×m，环丙基两个-CH₂-)，1.51(4H，s，乙撑二氧乙基两个-CH₂-)，3.95(3H，s，-CH₃)，4.47～4.50(2H，d，j＝5.4Hz，-CH₂-ph)，7.20～7.40(5H，m，ph-H)，7.60～7.80(1H，brs，NH).
(5)1-苄氨基羰基-1-(2-氯-1，1-乙撑二氧乙基)环丙烷的制备(v)
取化合物iv(20.88g，0.08mol)于500ml三口瓶中，加二氯甲烷(130ml)，室温下，滴加氯化硫酰(11.88g，0.088mol)，于室温下搅拌反应5h，倾入冰水(100ml)，用氢氧化钠水溶液调反应液的pH为6～7，用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂得标题物(v)，为无色油状物液体(23.64g，100％)，无须精制，直接用于下一步反应中。
¹HNMR(CDCl₃)：0.91～1.21(4H，2×m，环丙基两个-CH₂-)，3.84(2H，s，Cl-CH₂)4.02～4.22(4H，m，乙撑二氧乙基两个-CH₂-)，4.47～4.51(2H，d，j＝10.2Hz，N-CH₂-)，7.20～7.40(5H，m，ph-H)，7.60～7.80(1H，brs，NH).
(6)5-苄基-7，7-乙撑二氧-4-氧代-5-氮杂螺[2，4]庚烷的制备(vi)
取化合物v(22.16g，0.075mol)于1000ml三口瓶中，加1，2-二氯乙烷(120ml)，25％氢氧化钠(120ml)，四正丁基溴化胺(8.50g)，于70℃搅拌反应5h，再向反应瓶中加入1，2-二氯乙烷(120ml)，加水(200ml)，搅拌10min分出有机层，用水洗至近中性，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂得标题物(vi)，为棕色油状物，柱层析，乙酸乙酯∶石油醚1∶3洗脱，浓缩得18.07g。(93％)。
¹HNMR(CDCl₃)：1.07～1.23(4H，2×m，环丙基两个-CH₂-)，3.36(2H，s，C₆-H)，3.82(4H，m，乙撑二氧乙基两个-CH₂-)，4.57(2H，s，-CH₂-ph)，7.20～7.40(5H，m，ph-H).
(7)5-苄基-4，7-二氧代-5-氮杂螺[2，4]庚烷的制备(vii)
取化合物vi(59.48g，0.23mol)，加丙酮(500ml)，1N盐酸(50ml)，回流反应15h，蒸除丙酮用氢氧化钠溶液调反应液的pH为6～7，用二氯甲烷萃取残留物用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂得无色油状液体(42.92g，86.9％)，加少许乙醚析晶，母液回收用硅胶柱分离(环己烷、乙酸乙酯梯度洗脱)，共得标题物(vii)，为浅黄色结晶(30.70g，71.5％，mp90～93℃)。
¹HNMR(CDCl₃)：1.60～1.77(4H，m，环丙基两个-CH₂-)，3.80(2H，s，C₆-H)，4.69(2H，s，-CH₂-ph)，7.20～7.40(5H，m，ph-H).
(8)4-氧代-5-苄基-7-肟-5-氮杂螺[2，4]庚烷的制备(viii)
取化合物vii(50g，0.233mol)于1000ml三口瓶中，加吡啶(200ml)，盐酸羟胺(48.5g，0.698mol)，室温下搅拌2小时，冲入500ml水中，搅拌0.5小时，过滤，水洗，烘干得viii，为白色结晶(51.5g，96.1％)，mp199.5-202℃。
(9)5-苄基-7-氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷的制备(ix)
取锂铝氢(13.5g，0.355mol)加入搅拌冷冻下的无水THF(200ml)中，-10℃-10℃缓慢滴加viii(20g，0.087mol)溶于100mlTHF形成的溶液，加完后室温下搅拌30min，逐渐升温至回流，反应5小时。冷冻下依次加入13.5ml水，13.5ml NaOH(15％)，40.5ml水，室温下搅拌30min，过滤，THF洗涤滤饼，合并滤液和洗涤液，浓缩，加二氯甲烷(200ml)，水50ml，充分振摇，分去水层，有机层以饱和食盐水洗涤，有机层无水硫酸镁干燥，浓缩干得ix(浅黄色油状物，17.5g，99.6％)。TLC展开剂：乙酸乙酯/甲醇/氨水(9∶1∶0.1)。
(10)7-叔丁氧羰基氨基-5-苄基-5-氮杂螺[2，4]庚烷的制备(x)
取化合物ix(17.5g，0.0866mol)，加二氧六环/水(300ml，2∶1)，搅拌下，滴加叔丁氧羰基二碳酸酯(22.7g，0.104mol)，室温搅拌2小时，减压浓缩，加二氯甲烷(200ml)，以饱和食盐水洗涤，有机层无水硫酸镁干燥，浓缩干得油状物，加入正己烷50ml搅拌析晶，得x(类白色结晶，24.6g，94.1％)，mp99.5-101.5℃。
(11)7-叔丁氧羰基氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷的制备(II)
取化合物x(20g，0.066mol)，加甲醇200ml，10％钯炭1.0g，室温加氢过夜，过滤，滤液浓缩干得II(11.8g，84.3％)。
参考实施例二
7-叔丁氧羰基氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷纯的立体异构体的制备
取D-(-)-酒石酸(30g，0.2mol)，加乙醇(300ml)加热至回流，溶清后，加入化合物ix(20.2g，0.1mol)，搅拌回流，逐渐析出白色晶体，2小时后，放室温过夜，过滤，乙醇洗，滤饼以乙醇/水(200ml)重结晶，得(+)-7-氨基-5-苄基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-D-(-)-酒石酸盐(白色结晶，16.1g，91.5％)，mp196.5-198℃，[α]²⁰_D-41.7°(C＝1，水)。
(+)-7-氨基-5-苄基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-D-(-)-酒石酸盐15g，加水50ml溶清，加入二氯甲烷200ml，1N氢氧化钠调pH9左右，充分搅拌，分去水层，有机层无水硫酸镁干燥，浓缩干得(+)-7-氨基-5-苄基-5-氮杂螺[2，4]庚烷(油状物9.1g，98.5％)。
拆分及精制母液，浓缩干，用L-(+)-酒石酸成盐、精制、游离得(-)-7-氨基-5-苄基-5-氮杂螺[2，4]庚烷(油状物8.4g，90.9％)。其中(-)-7-氨基-5-苄基-5-氮杂螺[2，4]庚烷-L-(+)-酒石酸盐(白色结晶，mp194.5-197℃，[α]²⁰_D+43.6°(C＝1，水)。
参照参考实施例一的方法分别可以得到
(+)-7-叔丁氧羰基氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷
(-)-7-叔丁氧羰基氨基-5-氮杂螺[2，4]庚烷
实验例一  本发明系列药物的体外抗菌作用
本实验经由四川省成都市四川抗菌素工业研究所完成。
实验材料：
1.试验药物
(1)发明化合物1样品；(2)化合物2样品；(3)化合物3样品；(4)化合物4样品；(5)化合物5样品；(6)化合物6样品；(7)化合物7样品；(8)化合物8样品；(9)化合物9样品；(10)左旋氧氟沙星：含量：89.8％。
以下将采用上述的序列号分别表示各试验化合物的效果。
以上样品均由江苏恒瑞医药股份有限公司提供。用无菌水溶解稀释，药物终浓度为128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L、0.06mg/L、0.03mg/L、0.015mg/L。
2.细菌
(1)临床分离菌株：试验所用菌株均为2001～2002年年从四川、北京地区收集的临床分离致病菌，所有菌种在收集分离的单位(华西医科大学检验科及重庆医科大学传染科细菌室)均经鉴定后，再经本室用API系统重新鉴定后使用。
金黄色葡萄球菌4株、表皮葡萄球菌4株、大肠埃希菌4株、肺炎克雷伯菌4株、绿脓4株株，共20株。
(2)标准质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC29213是四川抗菌素工业研究所药理室保存菌株。
3、培养基
M-H培养基：中国药品生物制品检定所产品，M-H肉汤培养基：称取25g加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌，116℃ 20分钟。M-H固体培养基：称取36g，加1000ml蒸馏水，高压灭菌，116℃ 20分钟，用于革兰阳性、阴性需氧菌的药敏试验。
试验方法：
1.最低抑菌浓度的测定：
采用琼脂二倍稀释法测定本发明系列药物的最低抑菌浓度(MIC)。用多点接种仪(Denley A400)将细菌接种于含不同药物浓度的琼脂平皿表面，每点含菌量约为10⁶CFU/ml，37℃孵育18～24小时观察结果，以无菌生长平皿培养基中所含药物最低浓度为药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC值)。
实验结果：
本发明系列药物体外抗菌试验结果见表1、表2，由表中可知，
1.本发明系列药物对所试革兰阳性菌的体外抗菌作用较强，对所试金黄色葡萄球菌MIC50值在0.125-128mg/ml范围内，对表皮葡萄球菌抗菌活性尤其强，其MIC50值在0.015-2mg/ml范围内；
2.本发明系列药物对所试革兰阴性菌中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌MIC50值分别在2-128mg/ml、0.06-16mg/ml和64-128mg/ml范围内。
3.本发明系列药物对所试革兰阳性菌的体外抗菌作用较强，优于对所试革兰阴性菌。
4.本发明化合物1的抗菌活性优于阳性对照药-左旋氧氟沙星，但无显著性差异(P＞0.05)，本发明化合物6和本发明化合物7的抗菌活性比左旋氧氟沙星差，有显著性差异(P＜0.05)，其他本发明系列药物的抗菌活性与左旋氧氟沙星无显著性差异(P＞0.05)。
四、结论
以上试验结果表明：提供的本发明系列药物体外对临床分离常见革兰阳性、阴性致病菌均具有抗菌作用，对革兰阳性菌中的金葡球菌和表葡球菌的抗菌作用强于对革兰阴性菌的抗菌活性；本发明化合物1的抗菌活性优于阳性对照药-左旋氧氟沙星。
                         表1  本发明药物的体外抗菌活性

  细菌  左氧沙星  化合物9  化合物3  化合物4  化合物5  化合物6  化合物7  化合物8  化合物1  化合物10  金葡29213  0.03  0.06  0.03  0.015  0.125  0.5  1  0.25  0.015  0.015  金葡0210  4  4  8  8  16  32  128  8  1  16  金葡0211  16  8  8  16  32  32  128  8  1  16  金葡0212  4  4  8  8  16  32  128  8  0.25  8  表葡02-1  0.015  0.125  0.03  0.03  0.125  0.5  1  0.25  0.015  0.015  表葡02-2  0.06  0.06  0.03  0.03  0.25  0.5  2  0.25  0.015  0.06  表葡02-3  0.5  1  2  2  1  2  16  4  0.125  2  表葡02-4  16  16  8  8  16  4  16  4  4  8  大肠02-20  0.5  0.5  8  2  2  4  16  2  0.5  2  大肠02-21  1  8  32  16  32  128  128  32  4  2  大肠02-22  16  16  64  64  128  ＞128  ＞128  ＞128  8  32  大肠02-23  32  32  128  64  128  ＞128  ＞128  ＞128  8  64  肺克02-16  16  16  64  64  64  ＞128  ＞128  128  16  64  肺克02-17  32  64  128  128  ＞128  ＞128  ＞128  ＞128  32  64  肺克02-18  0.015  0.06  0.06  0.03  0.25  1  0.5  0.5  0.015  0.015  肺克02-19  0.015  0.25  2  1  4  8  16  4  0.25  0.06  绿脓02-3  0.015  0.03  0.015  0.015  0.125  0.03  0.06  0.015  0.015  0.015  绿脓02-4  64  128  ＞128  ＞128  ＞128  ＞128  ＞128  ＞128  128  ＞128  绿脓02-6  64  128  ＞128  ＞128  ＞128  ＞128  ＞128  ＞128  64  ＞128  绿脓02-7  128  ＞128  ＞128  ＞128  ＞128  ＞128  ＞128  ＞128  64  ＞128
         表2  本发明系列化合物对20株细菌MIC50、MIC90的比较
细菌(菌号)      药物           MIC50         MIC90       MIC范围
                化合物2        4             8           0.06-8
                化合物3        8             8           0.03-8
                化合物4        8             16          0.015-16
                化合物5        16            32          0.125-32
金葡球菌        化合物6        32            32          0.5-32
(4株)           化合物7        128           128         1-128
                化合物8        8             8           0.25-8
                化合物1        0.25          1           0.015-1
                化合物10       8             16          0.015-16
                左氧沙星       4             16          0.03-16
                化合物2        0.125         16          0.06-16
                化合物3        0.03          8           0.03-8
                化合物4        0.03          8           0.03-8
                化合物5        0.25          16          0.125-16
表葡球菌        化合物6        0.5           4           0.5-4
(4株)           化合物7        2             16          1-16
                化合物8        0.25          4           0.25-4
                化合物1        0.015         4           0.015-4
                化合物10       0.06          8           0.015-8
                左氧沙星       0.06          16          0.015-16
                化合物2        8             32          0.5-32
                化合物3        32            128         8-128
                化合物4        16            64          2-64
                化合物5        322           128         2-128
大肠杆菌        化合物6        128           ＞128       4-＞128
(4株)           化合物7        128           ＞128       16-＞128
                化合物8        32            ＞128       2-＞128
                化合物1        4             8           0.5-8
                化合物10       2             64          2-64
                左氧沙星       1             32          0.5-32
                化合物2        0.25          64          0.06-64
                化合物3        2             128         0.06-128
                化合物4        1             128         0.03-128
                化合物5        4             ＞128       0.25-＞128
肺克杆菌        化合物6        8             ＞128       1-＞128
(4株)           化合物7        16            ＞128       0.5-＞128
                化合物8        4             ＞128       0.5-＞128
                化合物1        0.25          32          0.015-32
                化合物10       0.06          64          0.015-64
                左氧沙星       0.015         32          0.015-32
绿脓杆菌        化合物2        128           ＞128       0.03-＞128
(4株)           化合物3        ＞128         ＞128       0.015-＞128
                化合物4        ＞128         ＞128       0.015-＞128
                化合物5        ＞128        ＞128       0.125-＞128
                化合物6        ＞128        ＞128       0.03-＞128
                化合物7        ＞128        ＞128       0.06-＞128
                化合物8        ＞128        ＞128       0.015-＞128
                化合物1        64           128         0.015-128
                化合物10       ＞128        ＞128       0.015-＞128
                左氧沙星       64           128         0.015-128
                化合物2        4            128         0.03-＞128
                化合物3        8            ＞128       0.015-＞128
                化合物4        8            ＞128       0.015-＞128
                化合物5        16           ＞128       0.125-＞128
所有细菌        化合物6        32           ＞128       0.03-＞128
(20株)          化合物7        128          ＞128       0.06-＞128
                化合物8        8            ＞128       0.015-＞128
                化合物1        1            64          0.015-128
                化合物10       8            ＞128       0.015-＞128
                左氧沙星       4            64          0.015-128
实验例二  本发明系列化合物的进一步体外抗菌作用
本实验经由四川省成都市四川抗菌素工业研究所完成。
实验材料：实验药物采用化合物1、化合物2、化合物11、化合物12、左氧氟沙星、加替沙星。以上样品均由江苏恒瑞医药股份有限公司提供。用无菌水溶解稀释，药物终浓度是128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L、0.06mg/L、0.03mg/L、0.15mg/l。
细菌：
(1)临床分离菌株：实验所用菌株均为2001～2002年从四川、北京地区收集的临床分离致病菌，所用菌种在收集分离的单位(华西医科大学检验科、重庆医科大学传染科及北京医院细菌室)均经自动细菌检测仪鉴定后，在经本室用API重新鉴定后使用。
金黄色葡萄球菌8株、肠球菌4株，溶血性链球菌1株，肺炎链球菌7株，表葡菌5株，大肠埃希菌5株，铜绿假单孢菌5株，肺炎克雷伯菌5株，ESBL大肠埃希菌20株，ESBL肺炎克雷伯菌20株。
(2)标准质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC29213，是四川抗菌素工业研究所药理室保存菌株。
3.培养基
M-H培养基：中国药品生物制品检定所产品。
M-H肉汤培养基：称取25g加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌，116℃20分钟。
M-H固体培养基：称取36g，加1000ml蒸馏水，高压灭菌，116℃20分钟用于革兰氏阳性、阴性需氧菌的药敏实验。
实验方法：
1.最低抑菌浓度的测定：
采取琼脂二倍稀释法测定KNT系列药物的最低抑菌浓度(MIC)。用多点接种仪(Denley A400)将细菌接种于含不同药物浓度的琼脂平皿表面，每点接种菌量约为10⁶CFU/ml，37℃孵育18-24小时观察结果，以无菌生长的平皿培养基中所含药物最低浓度为药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC值)。
实验结果：
本发明系列药物的体外抗菌实验结果见表3至表10，由表中可知：
1.本发明系列药物化合物对所实验的革兰氏阳性菌的体外抗菌作用较强，对所试金黄色葡萄球菌的体外抗菌作用尤其强，其MIC₅₀值在0.008-0.125mg/ml范围内，对肠球菌的MIC值在0.03-0.5mg/ml范围内，对溶血性链球菌的MIC值在0.03-0.25mg/ml范围内，对肺炎链球菌的MIC值在0.06-2mg/ml范围内，对表葡菌MIC值在0.015-0.5mg/ml范围内。
2.本发明系列药物化合物对所实验的革兰氏阴性菌中所试的ESBL大肠埃希菌(产超广谱β-内酰胺酶)抗菌作用较强，MIC值在0.008-2mg/ml范围内。对普通大肠埃希菌的MIC₅₀值在2-＞128mg/ml范围内，对铜绿假单孢菌的MIC值在8-＞128mg/ml范围内，对肺炎克雷伯菌的MIC值在2-32mg/ml范围内，对ESBL肺炎克雷伯菌(产超广谱β-内酰胺酶)MIC值在4-＞128mg/ml范围内。
3.本发明系列药物化合物对所实验的革兰氏阳性菌的体外抗菌作用较强，优于所试的革兰氏阴性菌。
4.对于ESBL细菌：
(1)化合物1与化合物2的抗菌活性均优于阳性对照药左氧氟沙星，但均无显著性差异(P＞0.05)。化合物11的抗菌活性比阳性对照药左氧氟沙星差，无显著性差异(P＞0.05)。化合物12的抗菌活性比阳性对照药左氧氟沙星差，有显著性差异(P＜0.05)。
(2)化合物1与化合物2的抗菌活性均优于阳性对照药加替沙星，但均无显著性差异(P＞0.05)。化合物11和化合物12的抗菌活性比阳性对照药加替沙星差，有显著性差异(P＜0.05)。
5.对于非ESBL细菌：
(1)化合物1的抗菌活性优于阳性对照药左氧氟沙星，但均无显著性差异(P＞0.05)。化合物2的抗菌活性优于阳性对照药左氧氟沙星，有显著性差异(P＜0.05)。化合物11和化合物12的抗菌活性比阳性对照药左氧氟沙星差，均无显著性差异(P＞0.05)。
(2)化合物1与化合物2的抗菌活性均优于阳性对照药加替沙星，但均无显著性差异(P＞0.05)。化合物11的抗菌活性比阳性对照药加替沙星差，无显著性差异(P＞0.05)。化合物12的抗菌活性比阳性对照药加替沙星差，有显著性差异(P＜0.05)。
结论
以上实验表明：江苏恒瑞医药股份有限公司提供的本发明药物对临床分离常见的革兰氏阳性、阴性菌均有较强的抗菌作用。对所试革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌的体外抗菌作用最强；对所实验的革兰氏阴性菌中的ESBL大肠埃希菌抗菌作用次之。其中化合物1与化合物2的抗菌活性优于化合物11和化合物12，且均优于阳性对照药左氧氟沙星和加替沙星，但无显著性差异(P＞0.05)。化合物2的抗菌活性略强于化合物1。
表3              本发明化合物的体外抗菌活性筛选实验
             化合物1      化合物2      化合物      化合物     左氧氟     加替
                                       11          12         沙星       沙星
^**金葡菌     ＜0.001      ＜0.001      0.03        0.015      0.008      0.008
29213
^**金葡菌     ＜0.001      ＜0.001      0.06        0.125      0.008      0.015
MSSA22
^*金葡菌      1            0.25         4           2          4          2
02-19-7
^*金葡菌      1            0.25         4           2          4          2
02-19-38
^*金葡菌      ＜0.001      ＜0.001      0.03        0.06       0.008      0.008
02-19-42
^*金葡菌      0.25         0.25         0.125       2          4          1
02-19-11
金葡菌       0.008        0.002        0.125       0.125      0.015      0.03
25923
金葡菌       0.015        0.015        0.03        0.015      0.06       0.03
02-19-12
肠球菌       0.125        0.03         0.25        0.5        0.25       0.06
02-17-7
肠球菌       0.125        0.03         0.25        0.5        0.25       0.06
02-17-8
肠球菌       0.03         0.06         0.125       0.25       0.03       0.03
02-17-9
肠球菌       0.25         0.015        0.25        1          0.25       0.06
02-17-10
溶血性链球菌 0.06         0.03         0.125       0.25       0.03       0.06
01-25
肺炎链球菌   0.125        0.06         0.5         2          0.5        0.06
02-18-2
肺炎链球菌    0.125       0.03         0.5         2          0.125      0.06
02-18-3
肺炎链球菌     0.125       0.06        1        2        1         0.06
8247
肺炎链球菌     4           1           16       16       4         16
01-18-3
^*肺炎链球菌    0.125       0.03        0.25     0.5      0.25      0.06
01-18-1
肺炎链球菌     4           1           16       16       4         16
01-18-2
肺炎链球菌     0.25        0.06        0.5      2        0.5       0.06
01-18-7
表4
               化合物1      化合物2      化合物11      化合物12       左氧氟     加替
                                                                      沙星       沙星
表葡菌         0.002        0.004        0.015         ＜0.001        0.002      0.002
02-20-1
表葡菌         8            4            16            128            32         16
02-20-2
表葡菌         16           4            16            128            32         16
02-20-3
表葡菌         0.06         0.008        0.25          0.5            0.125      0.25
02-20-4
表葡菌         0.125        0.015        0.25          0.5            0.5        0.25
02-20-7
大肠埃希菌     0.002        ＜0.001      0.015         0.125          ＜0.001    ＜0.001
ATCC
大肠埃希菌     0.5          0.25         1             4              1          0.5
02-1-25
^*大肠埃希菌    16           4            32            ＞128          16         8
02-1-24
^*大肠埃希菌    4            2            8             32             4          4
02-1-21
大肠埃希菌     16           8            32            ＞128          32         16
02-1-22
^**铜绿假单胞菌 16           8            32            ＞128          32         32
02-2-41
^**铜绿假单胞菌 16           8            32            ＞128          32         32
02-2-42
^**铜绿假单胞菌 32           8            32            ＞128          32         32
02-2-43
^**铜绿假单胞菌 32           16           64            ＞128          32         32
02-2-45
^**铜绿假单胞菌 32           16           64            ＞128          32         64
02-2-46
肺炎克雷伯菌   16           8            128           0.5            32         32
02-6-17
^**肺炎克雷伯菌 0.015        0.008        0.008         2              ＜0.001    0.002
02-6-18
^**肺炎克雷伯菌 0.25         0.25         0.5           ＞128          0.125      0.25
02-6-19
^**肺炎克雷伯菌 8            4            32            ＜0.001        32         8
02-6-20
肺炎克雷伯菌    8          4            32            ＞128         32          8
02-6-21
表5
               化合物1     化合物2      化合物11      化合物12      左氧氟      加替
                                                                    沙星        沙星
ESBL大肠       0.008       0.008        0.06          0.125         0.008       0.008
03-1-1
ESBL大肠       0.004       0.008        0.25          0.125         0.008       0.004
03-1-2
ESBL大肠       0.002       0.008        0.125         1             0.06        0.015
03-1-3
ESBL大肠       0.008       0.015        0.06          0.25          0.015       0.015
03-1-4
ESBL大肠       0.002       0.008        0.06          0.25          0.008       0.008
03-1-5
ESBL大肠       0.004       0.004        0.06          8             0.008       0.004
03-1-6
ESBL大肠       0.06        0.03         2             2             0.125       0.001
03-1-7
ESBL大肠       0.002       0.002        0.015         0.25          0.004       ＜0.001
03-1-8
ESBL大肠       0.008       0.008        0.03          0.25          0.008       0.008
03-1-9
ESBL大肠       0.25        0.125        1             2             0.125       1
03-1-10
ESBL大肠       8           2            32            ＞128         32          8
03-1-11
ESBL大肠       8           4            64            ＞128         8           8
03-1-12
ESBL大肠       0.002       0.004        0.03          0.25          0.008       0.004
03-1-13
ESBL大肠       0.06        0.125        0.25          2             0.125       0.125
03-1-14
ESBL大肠       8           4            64            128           8           8
03-1-15
ESBL大肠       32          16           128           ＞128         64          32
03-1-16
ESBL大肠       1           0.5          4             16            2           2
03-1-17
ESBL大肠       0.25        0.25         0.5           32            1           1
03-1-18
ESBL大肠       1           0.25         8             32            4           4
03-1-19
ESBL大肠       0.002       0.008        0.03          0.125         0.008       0.004
03-1-20
表6
               化合物1        化合物2       化合物11       化合物12      左氧氟      加替
                                                                         沙星        沙星
ESBL肺克       4              4              32            ＞128         16          16
03-1-1
ESBL肺克       16             8              64            ＞128         32          16
03-1-2
ESBL肺克       8              4              32            ＞128         16          8
03-1-3
ESBL肺克       4              2              32            ＞128         16          8
03-1-4
ESBL肺克       8              4              64            ＞128         16          8
03-1-5
ESBL肺克       16             4              64            ＞128         32          16
03-1-6
ESBL肺克       4              2              32            128           32          16
03-1-7
ESBL肺克       16             4              128           ＞128         32          16
03-1-8
ESBL肺克       16             8              64            ＞128         16          32
03-1-9
ESBL肺克       8              4              32            128           8           8
03-1-10
ESBL肺克       16             8              64            ＞128         32          32
03-1-11
ESBL肺克       8              4              32            128           16          8
03-1-12
ESBL肺克       0.25           0.125          0.25          2             0.5         4
03-1-13
ESBL肺克       16             4              64            ＞128         16          16
03-1-14
ESBL肺克       0.008          0.008          0.06          0.25          0.015       0.015
03-1-15
ESBL肺克       16             4              128           ＞128         64          16
03-1-16
ESBL肺克       2              1              16            64            16          8
03-1-17
ESBL肺克       2              1              4             16            4           4
03-1-18
ESBL肺克       0.002          ＜0.001        0.004         0.06          0.002       ＜0.001
03-1-19
ESBL肺克       16             8              64            ＞128         16          16
03-1-20
表7  本发明化合物对不同菌株的MIC₅₀、MIC₉₀的比较
细菌(菌号)     药物           MIC₅₀      MIC₉₀       MIC范围
               化合物1        0.008       1            0.001-1
               化合物2        0.02        0.25         0.001-0.25
金葡菌         化合物11       0.06        4            0.03-4
(8株)          化合物12       0.125       2            0.125-2
              左氧沙星        0.015        4           0.008-4
              加替沙星        0.03         2           0.008-2
              化合物1         0.125        0.25        0.03-0.25
              化合物2         0.03         0.06        0.015-0.06
肠球菌        化合物11        0.25         0.25        0.125-0.25
(4株)         化合物12        0.5          1           0.25-1
              左氧沙星        0.25         0.25        0.03-0.25
              加替沙星        0.06         0.06        0.03-0.06
              化合物1         0.06         0.06        0.06-0.06
              化合物2         0.03         0.03        0.03-0.03
溶血性        化合物11        0.125        0.125       0.125-0.125
链球菌        化合物12        0.25         0.25        0.25-0.25
(1株)         左氧沙星        0.03         0.03        0.03-0.03
              加替沙星        0.06         0.06        0.06-0.06
              化合物1         0.125        4           0.125-4
              化合物2         0.06         1           0.06-1
肺炎链球菌    化合物11        0.5          16          0.25-16
(7株)         化合物12        2            16          0.5-16
              左氧沙星        0.5          4           0.125-4
              加替沙星        0.006        16          0.006-16
              化合物1         0.125        16          0.02-16
              化合物2         0.015        4           0.004-4
表葡菌        化合物11        0.25         16          0.015-16
(5株)         化合物12        0.5          128         ＜0.001-128
              左氧沙星        0.5          32          0.002-32
              加替沙星        0.25         16          0.002-16
表8
细菌(菌号)    药物            MIC₅₀       MIC₉₀      MIC范围
              化合物1         4            16          0.002-16
              化合物2         2            8           ＜0.001-8
大肠埃希菌    化合物11        32           64          32-64
(5株)         化合物12        ＞128        ＞128       ＞128
              左氧沙星        32           32          32
              加替沙星        32           64          32-64
                    化合物1           32         32        16-32
                    化合物2           8          16        8-16
  铜绿假单孢菌      化合物11          32         64        32-64
  (5株)             化合物12          ＞128      ＞128     ＞128
                    左氧沙星          32         32        32
                    加替沙星          32         64        32-64
                    化合物1           8          16        0.015-16
                    化合物2           4          8         0.008-8
  肺炎克雷伯菌      化合物11          32         128       0.008-128
  (5株)             化合物12          2          128       ＜0.001-＞128
                    左氧沙星          32         32        ＜0.001-32
                    加替沙星          8          32        0.002-32
                    化合物1           0.008      8         0.002-32
  ESBL大肠          化合物2           0.015      4         0.002-128
  埃希菌            化合物11          0.25       64        0.015-128
  (20株)            化合物12          2          ＞128     0.125-＞128
                    左氧沙星          0.06       8         0.004-64
                    加替沙星          0.015      8         ＜0.001-32
                    化合物1           8          16        0.002-16
  ESBL肺炎          化合物2           4          8         ＜0.001-8
  克雷伯菌          化合物11          32         64        0.004-128
  (20株)            化合物12          ＞128      ＞128     0.06＞128
                    左氧沙星          16         32        0.002-64
                    加替沙星          8          16        ＜0.001-32
  本发明化合物体外抗菌活性比较的t检验结果1
  表9
  细菌                                          P值
  (株数)
                    化合物      化合物2      化合物11      化合物12     左氧沙星     加替沙星
                    1
  ESBL细菌  化合物  --          0.597        0.14          ^**0.000     0.293        0.632
  (40株)    1
            化合物  0.597       --          ^**0.003       ^**0.000     0.115        0.314
            2
             化合物   ^*0.014   ^**0.003    --      0.37       0.153     0.046
             11
             化合物   ^**0.000  ^**0.000    0.37    --        ^**0.000  ^**0.000
             12
             左氧      0.293     0.115      0.153  ^**0.000    --        0.567
             沙星
             加替      0.632     0.314      0.46   ^**0.000    0.567      --
             沙星
注：ESBL细菌包括ESBL大肠埃希菌20株和ESBL肺炎克雷伯菌20株。
其中，P＜0.05有显著性差异；P＜0.01有极显著性差异；^*P＜0.05，^**P＜0.05。
                                 本发明化合物体外抗菌活性比较的t检验结果2
表10
细菌                                             P值
(株数)
                         KNT-1     (+)KNT-1     KNT-011      KNT-011(-)    左氧沙星       加替沙星
非ESBL         化合物    --        0.227        0.101       ^**0.009        0.370         0.715
细菌           1
(40株)
               化合物    0.227     --          ^**0.005     ^**0.000        0.036         0.116
               2
               化合物    0.101    ^**0.005      --            0.331         0.455         0.201
               11
               化合物    0.009    ^**0.000      0.331         --            0.086       ^*0.025
               12
               左氧      0.370    ^*0.036       0.455        0.086          --            0.595
               沙星
               加替      0.715      0.116       0.201       ^*0.025        0.595          --
               沙星
注：非ESBL细菌包括金黄色葡萄球菌8株、肠球菌4株，溶血性链球菌1株，肺炎链球菌7株，表葡菌5株，大肠埃希菌5株，铜绿假单孢菌5株，肺炎克雷伯菌5株。其中，P＜0.05有显著性差异；P＜0.01有极显著性差异；^*P＜0.05；^**P＜0.05。