脱乙酰壳多糖制备方法 本发明涉及制备脱乙酰壳多糖的方法，以及涉及用此方法生产的新颖脱乙酰壳多糖产品，它们的用途。
甲壳质是通式为(C8H73N5)n的天然含氮粘多糖，它存在于无脊椎动物的外骨骼之中，也存在于霉菌之中。具体地说，它是甲壳纲动物例如小河虾、蟹、对虾及龙虾的外骨骼的主要成分。更具体地说，甲壳质是聚N-乙酰基-D-葡糖胺，因此，甲壳质由(1→4)相连的2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcNac；A单元)组成。甲壳质的物理结构是高度有序的，其最丰富的形式是α-甲壳质，它以来自壳类食品工业的废物而获得。在α-甲壳质中，链是反向平行的，大量被氢键合。另一形式是β-甲壳质，它能从例如枪乌贼属鱿鱼的羽状壳和河生的海链藻属硅藻的脊骨分离出。在β-甲壳质中，链是平行的，与α-甲壳质相比，这些链较少被氢键合。
甚至在酸性pH值下，甲壳质也不溶于水中，不溶大多数有机溶剂中。这限制了它的应用。
甲壳质的N-乙酰基能被断裂开，生成称作脱乙酰壳多糖的产物。脱乙酰壳多糖有很多已知地用途，例如用在药物和化妆品组合物中，及用作填料、吸附剂、载液及载体。
脱乙酰壳多糖可认为是由(1→4)连接的A单元和2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GLcN；D-单元)组成的水溶多糖家庭，其相对丰度不同，顺序不同。
甲壳质与脱乙酰壳多糖之间的区别是基于甲壳质在稀酸溶中的不溶性以及脱乙酰壳多糖在相同稀酸溶液中的可溶性(见Roberts，G.A.F.，″ChitinChemistry″(1991)，6-7页)。
在Roberts书的第6页(见上)所给出的完全水溶脱乙酰壳多糖的定义与下面事实相关：脱乙酰壳多糖通常仅当D-单元的游离氨基被质子化时，才溶在水中。这种质子化可通过加入控制数量的酸如乙酸而做到。但是，脱乙酰壳多糖也可以制成不同的盐，即在D-单元中带有质子化氨基及带负电的相反离子(如甲酸根、乙酸根、氯根及别的负离子)，它们使它溶于水而不需加入酸。制备这类脱乙酰壳多糖盐类的方法在参考文献(例如见Draget等人，Biomaterials 13：635-638(1992)，Varum等人，Carbohydrate polymers28：187-193(1995)，及US-A-5,599,916)之中已有描述。
用于表征脱乙酰壳多糖的一个参数是FA，即糖的A单元而不是D单元的相对分数。
为解释脱乙酰壳多糖的结构，给出了下列的三种不同脱乙酰壳多糖的化学结构示意表示式，这些脱乙酰壳多糖带有不同组成的A单元和D单元：
DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD
完全N-脱乙酰化脱乙酰壳多糖分子的部分(FA＝0.00)；
DDDADDADDDDDAADDADDDDDADADDDDAADDDDADDDD
部分N-脱乙酰化脱乙酰壳多糖分子的部分(FA＝0.25)；
DAAADDADDDDAAAADADDADDADDDDADAAAADDAADAA
部分N-脱乙酰化脱乙酰壳多糖分子的部分(FA＝0.50)。
在双元杂多糖这类脱乙酰壳多糖中，分子的化学结构不能仅用化学组成的数据(即FA)来完全表征。必须知道链中两种单体的顺序和分布以便完全表征其化学结构。表征链中两种单体单体顺序的一种方法是测定这两种单体单元的最相邻频率，该频率与从统计模式得到的值进行比较。NMR研究已经表明，均相地或不均相地制备的水溶脱乙酰壳多糖，其乙酰化的和脱乙酰化的单元沿着链具有无规分布(见Varum等人，Carbohydr.Res.211：17-23(1991)及217：19-27(1991))。
存在带亲水和可质子化氨基的一种单体残基和存在带疏水乙酰基的另一种单体残基(这两种单体的相对数量可变)，能影响脱乙酰壳多糖在溶液中和在凝胶态及固态时的物理性能，以及它与别的分子、细胞及别的生物和非生物的相互作用。然而，部分因为缺少大规模制备其他脱乙酰壳多糖的廉价方法，以及部分因为对具较高FA脱乙酰壳多糖的官能性能只有有限的科学了解，所以脱乙酰壳多糖的商业用途迄今只限于具有低乙酰化单元级分(FA＜0.15)的脱乙酰壳多糖样品。
应该指出，除了脱乙酰化反应之外，在从甲壳质生产脱乙酰壳多糖的过程中，解聚反应也会发生，可生成具有宽乙酰化度和宽分子量范围的脱乙酰壳多糖。然而，通常商业供应的脱乙酰壳多糖存在的一个问题是它在生理pH值时不溶解。
从甲壳质生产脱乙酰壳多糖通常在均相反应中或在非均相反应中进行。在均相反应中，将甲壳质悬浮在碱中，把悬浮液用冰冷却，将甲壳质带进溶液中；在非均相反应中，则把颗粒状甲壳质分散进热碱溶液通常是氢氧化钠之中。在均相反应中，所得脱乙酰壳多糖的FA通常为0.3-0.7。在非均相反应中，所得脱乙酰壳多糖的FA通常在0-0.15的范围内。在需要脱乙酰壳多糖具有不同乙酰化度的场合，需要将脱乙酰壳多糖再乙酰化。在均相反应的情况下，剩余的N-乙酰基通常无规地沿着脱乙酰壳多糖产物的聚合物主链定位。在非均相反应的情况下，小级分的不溶甲壳质类物质最常与酸溶级分一起存在于产品之中，此酸溶级分的乙酰基沿着聚合物主链具有接近无规的分布。
现有技术中有关脱乙酰化方法的描述可见于：US-A-4195175；Varum等人，″Advances in chitin chemistry″，127-136页，编辑C.J.Brine，1992，Ottoy等人，Carbohydrate Polymers 29：17-24(1996)；Sannan等人，Macromol.Chem.176：1191-1195(1975)；Sannan等人，Macromol.Chem.177：3589-3600(1976)；Kurita等人，Chemistry Letters 1597-1598(1989)；及CA-A-2101079。
迄今，若干应用中已发现更高乙酰化脱乙酰壳多糖级分的高的功能(见Smidsrod等人，″Chitin and Chitosan-Chitin and Chitosan in Life Science″，1-11页；编辑T.Uragami等人，Kodansha Scientific，Japan(2001)(ISDN4-906464-13-0)。在中性pH下大的溶解度是重要的，用溶菌酶获得的可控降解速度是重要的，与疏水表面(例如脂肪颗粒和细胞表面)的强相互作用是重要的，这种相互作用导致高的脂肪粘结性和絮凝性，在水包油型乳液上的高去稳定作用以及在众多化妆品、营养品及生物医药应用中的广泛用途。
更高乙酰化脱乙酰壳多糖近来也显示对细菌细胞更有效的絮凝效果(见Strand等人，Biomacromolecules 2：126-133(2001))。
但是，公知的制备更高乙酰化脱乙酰壳多糖的方法具有缺点，此缺点使得它们不适于放大规模的工业生产。
因此，例如对没有膨胀的非均相脱乙酰化方法来说，必须用酸去萃取产品，以便从水溶脱乙酰壳多糖中分离出来反应的甲壳质；这包括除了降低高乙酰化脱乙酰壳多糖产物的产率之外还包括要除去水。
除了脱乙酰化步骤之外，高乙酰化脱乙酰壳多糖的再乙酰化包括将脱乙酰壳多糖溶解，使用有机化学品如乙酐和甲醇，以及将最终产品分离。
均相脱乙酰化方法包括通过加冰而使甲壳质溶解，以及从溶液中分离脱乙酰壳多糖。此外，为避免甲壳质溶液具有太高的粘度，在反应介质中需要大量含水碱液。因此这一均相脱乙酰化方法导致其产品与不均相脱乙酰化方法的产品相比，价格更昂贵。
我们现在已惊人地发现，如果在非均相脱乙酰化反应中使甲壳质首先受到长期低温碱性溶胀，则可以获得残留N-乙酰基沿着聚合物链更无规分布的脱乙酰壳多糖产品，其脱乙酰化程度可以如希望那样或低或高，其聚合度可以如希望那样比通常产品低，而且如果希望，其在生理pH值下具有高的水溶性。
因此，从本发明的一个方面看，本发明提供了一种制备脱乙酰壳多糖的方法，该方法包括在低于30℃的温度下用水溶液优选用碱水溶液将颗粒状甲壳质溶胀至少36小时，随后在高温下使所得的已溶胀的颗粒状甲壳质与碱溶液反应，由此引起脱乙酰化的发生，例如得到预定的期望的FA值，而且如果希望则使之生成完全水溶的脱乙酰壳多糖。
本发明方法所用的甲壳质优选从无脊椎动物外骨骼萃取而得的甲壳质，优选用脱蛋白质法和脱矿物质法。因此该甲壳质优选是α-甲壳质。特别优选的是此甲壳质萃取自甲壳纲动物外骨骼，特别是小河虾、磷虾、龙虾或蟹的外骨骼以及蛤的壳。术语小河虾在这里用于既指对虾又指小河虾以及相似种类如scampi。术语龙虾在这里用于既指龙虾又指相似种类例如小龙虾和langoustine。来自北极对虾(Pandalus borealis)的外骨骼是特别优选的。这类甲壳纲动物外骨骼以食品生产工业的废物得到。然而，虽然用作原料的甲壳质优选分离自甲壳纲动物的壳(例如小河虾、蛤、磷虾、蟹和龙虾的壳)，但是其他甲壳质来源也可用于本发明的方法中，例如来自如枪乌贼羽状壳和硅藻源的β-甲壳质。此外，其他的甲壳质如γ-甲壳质也可使用。甲壳质原料可以是粗的或已预处理状态，例如任选是已干燥的和再经机械和/或化学改性的。但是，此甲壳质优选为片状或粉状，例如其外形粒径为5～1000μm，优选为50～500μm。希望这种粉末在粒径实际上是均匀的。
颗粒状甲壳质在含水溶液优选在碱性溶液(例如至少为10N的碱溶液)和/或在含溶解的电解质/盐(它们能破坏甲壳质中的结晶结构)的溶液中被溶胀。此溶液优选含有极性溶剂或质子溶剂，例如水、醇(例如甲醇)、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或乙腈。此碱水溶液特别优选使用对环境冲击小的那种。所用的碱可以是任何能使甲壳质脱乙酰基的碱，但优选无机碱，特别是碱金氢氧化物或碱土金属氢氧化物，例如氢氧化钾但尤其是氢氧化钠。因此这种碱优选是所谓强碱。特别优选使用碱液。期望此碱溶液的pH相当于或大于10M NaOH水溶液的pH，更优选相当于或大于15M NaOH的pH。典型的是将使用至少为15M氢氧化钠，特别是至少为18M氢氧化钠例如15～25M，更优选为18～22M。碱溶液的用量相对于颗粒状甲壳质通常为重量比100∶1至1∶1，优选为50∶1至4∶1，更优选为30∶1至8∶1。
在一种优选实施方案中，甲壳质与含有能溶解甲壳质的有机溶剂的液体接触。此液体可含有作为助溶剂的水，而且水可加到甲壳质液体混合物中以便将溶解的甲壳质以溶胀的无定形颗粒沉淀出来。希望这一液体是碱，但可含有别的已溶组分例如电解质/盐，这些电解质/盐能破坏甲壳质中的结晶结构。可用于这方面的这种液体是氯化钙的含水甲醇溶液。
本发明方法的溶胀阶段优选在高达30℃，例如-6～30℃，更优选在0～30℃，特别是在15～25℃，具体在高达20℃的温度下进行。尽管在通常均相脱乙酰化反应中通过冷至冰的温度而将甲壳质带入溶液中，但在根据本发明方法的溶胀在5℃或更低的温度下进行时，溶胀在甲壳质溶解之前中止，而在高温下被进行碱性脱乙酰化的材料是颗粒状未溶解的已溶胀的甲壳质。
溶胀阶段优选进行至少48小时(例如48-75小时)，更优选进行至少54小时，具体在60-120小时，更具体在65-75小时。随着溶胀时间延长，生成的酸溶脱乙酰壳多糖在随后的脱乙酰化的百分产率将提高；若超过75小时，则产率的再提高将是小的。通常，对β-甲壳质来说其所需溶胀时间将小于对于α-甲壳质的时间。
在溶胀时通过将甲壳质处于压力或辐射之下，例如通过压碎或挤出潮湿的甲壳质或者通过用微波或超声辐射，可以加述甲壳质的溶胀。这是关于甲壳质转变为脱乙酰壳多糖的新颖情况。因此从本发明的另一方面看，本发明提供了一种制备脱乙酰壳多糖的方法，此方法包括：在低于30℃下用含水溶液(优选碱溶液)将颗粒状甲壳质溶胀，并用压力或辐射来加速溶胀，随后在高温下使所得的已溶胀的颗粒状甲壳质与碱溶液反应，由此引起脱乙酰化反应的发生。
希望如此选择溶胀时间，使得此时间足以使甲壳质变成已溶胀的无定形甲壳质，即实际上已没有结晶区域的甲壳质。这可以用x-射线衍射法进行实验检验。通常，当甲壳质在蒸馏水中其体积溶胀为甲壳质体积的至少1.4倍，优选至少1.5倍时，则甲壳质处于已溶胀的无定形状态。
无定形甲壳质的碱性脱乙酰化本身是新颖的，并构成本发明的又一方面，从本发明的这一方面看，提供了一种制备脱乙酰壳多糖的方法，此方法包括在高温例如高于30℃优选高于40℃之下，用含水的碱溶液与颗粒状无定形甲壳质，优选用含水的碱溶液与已溶胀的甲壳质反应。用于本方法的无定形甲壳质可以通过如这里描述过的方法进行溶胀，或通过将已溶解的甲壳质进行沉淀而生产。
溶胀之后，在此溶胀阶段所用温度更高的温度下，例如至少高5℃优选至少高25℃的温度下进行碱性脱乙酰化。在脱乙酰化阶段的典型温度是至少40℃直到溶液的沸点(例如高达130℃)，优选至少45℃，例如45-120℃的范围，更具体是50-70℃，特别是55-65℃。提高温度的效果是缩短了产生所希望脱乙酰化程度所需要的时间。因为本发明的方法优选进行以便生成具有预定FA值的脱乙酰壳多糖，所以此方法通常将包括在高的脱乙酰化温度下进行预定时间。一般来说，脱乙酰化反应将进行30分钟至10小时，优选为45分钟至4小时。
在脱乙酰化阶段所用的碱溶液与在溶胀阶段所用的溶液相同，任选再加一些碱或把一些过量的碱除去。作为替代办法，可以将已溶胀的甲壳质回收并与新鲜碱液接触。这另外的或新鲜的碱液可以如上述溶胀阶段所用的。基于方便和经济的理由，脱乙酰化阶段通常使用与溶胀阶段相同的碱液，也可以再加入另外的碱液。
将脱乙酰化优选进行，以便给出FA为0.2-0.7特别是0.45-0.6的脱乙酰壳多糖产品。
脱乙酰化之后，通常将脱乙酰壳多糖产品洗涤，任选干燥及研磨，例如像通常脱乙酰壳多糖生产方法那样。如果希望，可以用酸萃取法或沉淀法把它从任何残留的甲壳质中分离出来。这也可像通常脱乙酰壳多糖生产方法那样进行。
脱乙酰壳多糖产品的洗涤典型地用热水(例如30-70℃)进行而且连续进行直到洗涤溶液达到pH中性为止。用冷水洗涤通常应避免，因为会生成凝胶。
因此在本发明的一个优选实施方案中，此方法是一种通过溶胀和随后脱乙酰化制备具有预定乙酰化氨基分数(FA)的完全水溶脱乙酰壳多糖的方法，其特征在于该方法包括：
a)在低于30℃的温度下，在大于10M的浓碱液中，将甲壳质深入溶胀至少36小时，
b)通过提高温度至高于45℃一段预定时间，将已溶胀的甲壳质脱乙酰化，及
c)通过用水洗涤来自步骤(b)的脱乙酰化甲壳质，直到洗涤溶液变为中性而把脱乙酰壳多糖分离出来，任选将脱乙酰壳多糖产品进行干燥和研磨。
本发明方法与现有技术中所述的非均相方法的主要不同之处是深度溶胀步骤的履行。本发明的方法与现有技术中所述的均相脱乙酰化方法之间的区别是很清楚的，它包括取消下列步骤：
a)因粘度导致的在浓度方面受到限制的甲壳质溶解，
b)脱乙酰壳多糖产品(具有从高到低乙酰化单元分数的)的沉淀。
与现有技术中的均相脱乙酰化方法相比，在脱乙酰化步骤中工作体积的明显减少以及不必为了分离产品而设一个沉淀步骤，是本发明方法的明显优点，因为它使本方法适于工业化。
关于前面提到的不均相脱乙酰化方法，本发明明显与之区别的主要特征是，可以生产完全水溶的产品，不必需要用酸萃取产品，以便从水溶脱乙酰壳多糖中分离出未反应的甲壳质。
这里所采用的“完全水溶脱乙酰壳多糖”是指能完全溶解的脱乙酰壳多糖，即多于97％重量溶解在稀酸溶液中，例如在1％w/v乙酸中的1％w/v脱乙酰壳多糖溶液。
对一种给定的碱溶液来说，为生成具有所要脱乙酰程度的脱乙酰壳多糖而需要的温度、溶胀及脱乙酰化阶段的持续时间，可以用常规实验来确定。例如使用20M NaOH，在20℃将得自Pandalus borealis的α-甲壳质溶胀66-100小时，随后在50℃脱乙酰化3小时或在60℃1小时，生成其FA约为0.5的脱乙酰壳多糖。
因此本发明的方法典型地包括在预定温度下溶胀预定的时间，随后在预定的温度下脱乙酰化预定的时间，生成具有所需FA的产物。但是，作为替代办法，时间和温度可以在反馈控制系统中进行调节，此系统包括监控反应介质的性能，例如取样和检测。
我们还惊异地发现，如果碱溶液溶胀进行明显延长的时间，例如65小时或更长，则甲壳质的脱乙酰化甚至在没有进行随后的高温处理的情况下，也会发生。脱乙酰化的程度取决于延长溶胀的时间，而且能从这一方法中溶胀了65-1000小时、优选70-400小时，更优选100-300小时的甲壳质中回收有用的脱乙酰壳多糖产品。这构成了本发明的又一方面。从这一方面看，本发明提供了一种制造脱乙酰壳多糖的方法，此方法包括在低于30℃的温度下用碱溶液将颗粒状甲壳质溶胀至少65-1000小时，以及随后从反应混合物中萃取脱乙酰壳多糖。
低温溶胀将甲壳质从其含有被无定形区域隔开的结晶区域的天然状态，变为甲壳质是实际上完全无定形的一种状态。这种转变，例如在10-25N碱溶液(例如20M NaOH)中于10-25℃之下，通常需约30-80小时。这一过程可通过监控甲壳质的溶胀或通过x-射线衍射而进行。当溶胀结束时，脱乙酰化开始。通常，一旦溶胀结束，为使FA达到0.5，约需90多小时，为使FA达到0.3，约需250小时，而为使FA到0.05，约需600小时。因此，可简单地通过选择pH、温度和碱处理持续时间而进行此过程，获得所需的脱乙酰化程度。在本方法中所生成的作为中间体的实际上无定形甲壳质本身是新颖的，并构成本发明的又一方面。从这一方面看，本发明提供无定形(即非结晶形)甲壳质，特别是已溶胀的无定形甲壳质。从再一方面看，本发明提供一种生产脱乙酰壳多糖的方法，包括用含水碱与无定形甲壳质反应。
用本发明的方法以这种方式制得的中等范围脱乙酰化程度脱乙酰壳多糖，在生理或接近生理的pH下具有高的水溶性，并构成本发明的又一方面。这种脱乙酰壳多糖可以与用通常方法制得的产物区别，区别的方法是将它们与浓酸的水解产物进行粒度排阻色谱法分析。这在附图1和2中作了解释，其中图1是用均相脱乙酰化法制得的脱乙酰壳多糖的水解产物的粒度排阻色谱图，而图2是用本发明方法制得的脱乙酰壳多糖的水解产物的粒度排阻色谱图。正如能够看出的，对现有技术产品来说，相应于单体、二聚体、三聚体等的峰值，粒度逐渐降低。与之相反，根据本发明的产品呈现组式图形。因此，从这另一方面看，本发明提供了一种其乙酰化程度为0.45-0.7的脱乙酰壳多糖，它在40℃用12MHCl酸解9小时产生单体及低聚物混合物，它在粒度排阻色谱法中不显示相应于单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体及六聚体的逐渐变小的峰的图谱。
用本发明方法生产的脱乙酰壳多糖可以如生产时所希望那样使用，也可以再进行化学改性或物理改性，例如解聚、脱乙酰化、乙酰化、成盐或其他化学衍变、研磨、形成凝胶、形成溶液、分级、酸萃取，等等。脱乙酰壳多糖衍变的典型例子广泛描述在科学文献和专利文献之中。转变为盐例如用通常的方法，是优选的生产后处理。
然后可以将脱乙酰壳多糖产品或改性产品用于任何先前为脱乙酰壳多糖建议使用的领域，例如用于制备工艺产品、农产品、食品(包括人用食品及动物饲料或饲料添加剂)、营养品、药品、生物药品、兽医药品及化妆品。但是它特别适于用作药物组合物或兽药组合物，食品或化妆品添加剂。
因此，从本发明的又一方看，本发明提供了本发明方法的脱乙酰壳多糖产品在制备工艺产品、农产品、食品、营养品、药品、生物药品、兽医药品及化妆品方面的用途。从本发明的再一方面看，本发明提供了含有本发明方法生产的脱乙酰壳多糖产品的工艺产品、农产品、食品、营养品、药品、生物药品、兽医药品及化妆品。
这里所参考过的出版物均被收作参考文献。
现在将参考下面非限制性实施例对本发明进一步描述。
实施例1
生产具有作为溶胀时间函数的乙酰化
单元分数约为0.5的水溶脱乙酰壳多糖
将分离自北极小河虾壳并得自Primex Ingredients ASA(Haugesund，挪威)的甲壳质用作原料。制造过程进行如下：
1.往2.5g细磨的甲壳质(在锤式磨中磨成小于1毫米的颗粒)加至43ml20M NaOH中。然后让甲壳质在20℃溶胀0-95小时。
2.将已溶胀的甲壳质在用于溶胀的氢氧化钠中于60℃下脱乙酰化1小时。
3.把此分散液转移到玻璃烧结器中并用热水(50-80℃)洗涤至中性pH。
4.将脱乙酰壳多糖干燥、称重并如Ottoy等人(见上)所描述那样分析其酸溶脱乙酰壳多糖含量。此外，此酸溶级分的化学组成(FA)用质子nmr谱仪进行测定。酸溶级分的特性粘度，如Draget等人(见上)所述那样在pH4.5和0.1M离子强度下进行测定。
结果列干下表1中
表1 溶胀时间 (小时) ％酸溶脱乙酰壳多糖 FA 在pH4.5及离子强度0.1M 下的特性粘度(ml/g) 0 42 0.56 500 36 88 0.55 650 45 93 0.54 710 55 95 0.53 920 66 98 0.51 810 95 100 0.48 710
如所能看出的，其产率(以％酸溶级分测出)从不溶胀时的42％增加至溶胀66小时的98％。
实施例2
生产具有高乙酰化单元分数(FA)的完全水溶的脱乙酰壳多糖
甲壳质与实施例1中所用的相同，并如实施例1所述在20℃下溶胀66小时。
在50℃将已溶胀的甲壳质脱乙酰化，脱乙酰化的时间从1小时变至7小时。测定酸溶脱乙酰壳多糖的含量(即在1％w/v乙酸中)、酸溶级分的FA，及酸溶级分的特性粘度。结果列于下表2中。
表2 脱乙酰化时间 (小时) ％酸溶脱乙酰壳多糖 FA 在pH4.5及离子强度0.1M 下的特性粘度(ml/g) 1 80 0.54 680 3 99 0.48 640 5 99 0.37 590 7 100 0.29 620
如所能看到的，可以通过控制脱乙酰化的时间来控制脱乙酰壳多糖的化学组成(FA)，而且当脱乙酰化的时间足以获约0.5或更小的FA时，此产物是实际上完全水溶的。
重复实验，但脱乙酰化温度升至60℃，脱乙酰化时间为1，2和3小时。测定酸溶脱乙酰壳多糖的含量、酸溶级分的FA及酸溶级分的特性粘度。结果示于下表3中。
表3 脱乙酰化时间 (小时) ％酸溶脱乙酰壳多糖 FA 在pH4.5及离子强度0.1M 下的特性粘度(ml/g) 1 100 0.51 610 2 100 0.35 520 3 100 0.28 490
如所能看到的，脱乙酰化时间为1小时(与之相比在50℃下时需3小时)能获得高度脱乙酰化(FA＝0.51)的完全水溶的脱乙酰壳多糖。
实施例3
生产低脱乙酰化程度的完全水溶的脱乙酰壳多糖
选择供工业生产脱乙酰壳多糖用的由Primex Ingredients(Finnsnes，挪威)供应的甲壳质片作为原料。所用甲壳质为片状颗粒，面积为1-2cm2，片厚度变化为20-200μm。甲壳质片的干物含量为20％重量，由于含有NaOH(含水)其水相的pH为12。
生产过程进行如下：
1.将甲壳质片加到22℃的50％(w/w)NaOH(含水)之中，甲壳质∶NaOH(含水)的比例为1∶8，在22-27℃(当加入具有比50％(w/w)低的较低碱浓度的甲壳质时温度应升高)溶胀70小时。
2.在60℃下于相同的碱中将已溶胀的甲壳质脱乙酰化1小时。
3.把此分散液转移到筛子中，并用热水(50-80℃)洗涤至中性pH。
4.将脱乙酰壳多糖干燥，用1H-NMR谱仪测定酸溶级分的FA。如Draget等人(见上)所述在pH4.5和0.1M离子强度下测定酸溶级分的特性粘度。
结果给于下列表4中。
表4 溶胀时间 (小时) ％酸溶脱乙酰壳多糖 FA 在pH4.5及离子强度0.1M 下的特性粘度(ml/g) 70 96％ 0.53 1600
实施例4
生产具有高脱乙酰化程度的完全水溶脱乙酰壳多糖
甲壳质片原料与实施例1中所用的相同。
1.将甲壳质片加至20℃的50％(w/w)NaOH(含水)之中，甲壳质∶NaOH(含水)的比值为1∶8。把碱挤去使甲壳质∶NaOH(含水)的比值为1∶4。
2.将甲壳质/碱溶胀91小时。
3.通过将已预溶胀的甲壳质/碱加至50％(w/w)NaOH(含水)中，比值为1∶8，使已溶胀的甲壳质在60℃脱乙酰化1小时。
4.将所得分散液转移到一筛子中，用热水(50-80℃)洗涤至中性pH。
5.将脱乙酰壳多糖干燥，用1H-NMR谱仪测定酸溶级分的FA。如Draget等人(见上)所述在pH4.5和0.1M离子强度下测定酸溶级分的特性粘度。
结果给出在下表5中
表5 溶胀时间 (小时) ％酸溶脱乙酰壳多糖 FA 在pH4.5及离子强度0.1M 下的特性粘度(ml/g) 91 95％ 0.48 1000
实施例5
生产具有低乙酰化程度的完全水溶脱乙酰壳多糖
此实施例用于说明本发明的方法能用于生产可与用通常方法制得的脱乙酰壳多糖相比较的脱乙酰壳多糖。
将甲壳质(如实施例1中所用的)如实施例1那样在20℃溶胀66小时。然后在20M NaOH(如实施例1那样)中于70，90及120℃下将已溶胀的和未溶胀的甲壳质脱乙酰化。
结果给出在下列表6-8中。
表6
溶胀：[NaOH]＝20M，温度＝20℃
时间＝66小时
脱乙酰化：[NaOH]＝20M，温度＝70℃，
时间＝2-17小时
溶胀 脱乙酰化 脱乙酰壳多糖 [NaOH] (M) 温度 (℃) 时间 (小时) [NaOH] (M) 温度 (℃) 时间 (小时) FA (酸溶级分) [η]* (ml/g) 酸溶级 分(％) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 66 66 66 66 20 20 20 20 20 20 20 20 70 70 70 70 70 70 70 70 2 4 8 17 2 4 8 17 0.26 0.20 0.17 0.13 0.25 0.20 0.16 0.13 - 940 950 800 980 - 980 990 100 100 100 100 100 100 100 100
*在pH4.5及离子强度0.1M之下的特性粘度
表7
溶胀：[NaOH]＝20M，温度＝20℃，
时间＝66小时
脱乙酰化：[NaOH]＝20M，温度＝90℃
时间＝1.5小时 溶胀 脱乙酰化 脱乙酰壳多糖 [NaOH] (M) 温度 (℃) 时间 (小时) [NaOH] (M) 温度 (℃) 时间 (小时) FA (酸溶级分) [η]* (ml/g) 酸溶级 分(％) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 66 66 66 66 20 20 20 20 20 20 20 20 90 70 90 90 90 90 90 90 1 2 3.5 5 1 2 3.5 5 0.23 0.18 0.16 0.12 0.21 0.16 0.14 0.14 - - 870 800 - - 710 910 100 100 100 100 100 100 100 100
*在pH4.5及离子强度0.1M之下的特性粘度
表8
溶胀：[NaOH]＝20M，温度＝20℃，
时间＝66小时
脱乙酰化：[NaOH]＝20M，温度＝120℃，
时间＝15小时 溶胀 脱乙酰化 脱乙酰壳多糖 [NaOH] (M) 温度 (℃) 时间 (小时) [NaOH] (M) 温度 (℃) 时间 (小时) FA (酸溶级分) [η]* (ml/g) 酸溶级 分(％) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 66 66 66 66 20 20 20 20 20 20 20 20 120 120 120 120 120 120 120 120 1 2 3.5 5 1 2 3.5 5 0.22 0.11 0.09 0.08 0.25 0.12 0.08 0.07 320 660 640 600 410 620 560 320 100 100 100 100 100 100 100 100
*在pH4.5及离子强度0.1M之下的特性粘度
实施例6
水解产物的粒度排阻色谱
将以Sannan等人Macromol.Chem.177：3589-3600(1976)的均相脱乙酰化方法生产的FA0.43的脱乙酰壳多糖以及按实施例1-4生产的FA0.46的脱乙酰壳多糖在12M HCl中于40℃下水解6-11小时。然后将水解产物进行粒度排阻色谱法分析(如Tommeraas等人Carbohydrate Res.333：137-144(2001)所述)。结果示于图1和2之中，结果显示，在相应于从单糖到多聚己糖的片段的各个峰的整个范围内，在峰高方面存在明显不同的图谱。以1，2，3，4，5及6标出的峰分别相应于从单糖到多聚己糖的片段。