11段人消化道肿瘤血管特异性结合环肽GX系列.pdf

摘要
申请专利号：	CN200410026137.0	申请日：	2004.05.17
公开号：	CN1580075A	公开日：	2005.02.16
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效\|\|\|公开
IPC分类号：	C07K14/435	主分类号：	C07K14/435
申请人：	中国人民解放军第四军医大学
发明人：	吴开春; 郅敏; 董蕾; 郝志明; 乔泰东; 丁杰; 樊代明
地址：	710032陕西省西安市长乐西路17号
优先权：
专利代理机构：	西安通大专利代理有限责任公司	代理人：	李郑建
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内容摘要

本发明公开了11段人消化道肿瘤血管特异性结合环肽GX系列。本发明利用随机噬菌体环状7肽库及免疫抑制小鼠肾包膜下人转移瘤模型，成功的筛选出能与人食道鳞癌及人胃低分化腺癌血管高特异性结合的环状7肽GX1－GX11。经移植瘤组织噬斑滴定，移植瘤组织和人胃癌、食管癌组织免疫组化染色，GX1合成肽与GX1呈现噬菌体在体内的竞争抑制实验均显示该系列7肽与人消化道肿瘤组织血管结合的特异性。经测序后确认这些蛋白序列的惟一性。这些多肽序列在肿瘤血管靶向治疗，肿瘤血管特异性分子标志物试剂的研制方面将具有巨大的潜在价值。

权利要求书

1. 一种人消化道肿瘤血管特异性结合环肽GX系列，其特征在于，包含11段能够特异性结合于人消化道肿瘤血管内皮细胞上的环肽，具体氨基酸序列如下：
GX₁： Gly Asn Ser Asn Pro Lys Ser
GX₂： Pro His Asn Leu Thr Lys Leu
GX₃： Tyr Ser Phe Asn Ser Trp Met
GX₄： Pro Asn Pro Asn Asn Ser Thr
GX₅： Tyr Ser Ile Asn Asp Trp His
GX₆： Leu Phe Ala Met Pro Asn Ser
GX₇： Ser Thr Val Ala Thr Ser Gln
GX₈： Tyr Val Thr Pro Tyr Asp Ile
GX₉： Ser Pro Ala Asn Leu Phe Thr
GX₁₀：Pro Met Asn Ala Asp Asn Leu
GX₁₁：Ser Arg His Asp Leu Asn Ser

说明书

11段人消化道肿瘤血管特异性结合环肽GX系列
                         技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及体内筛选血管特异性结合肽，特别涉及11段人消化道肿瘤血管特异性结合环肽GX系列。
                         背景技术
虽然近些年来胃癌有逐渐减少的趋势，但是其仍居国人十大癌症死因排名的第三位，传统的治疗方式仍是手术，化疗和放疗。1971年，Folkman教授提出肿瘤生长和转移依赖于血管的学说，阻断肿瘤血管生成成为一种抑制肿瘤生长的方法。与传统方法相比，肿瘤血管抑制治疗具有以下优点：①不易产生耐药性；②药物易于到达靶部位；③抑制肿瘤转移；④无遗传毒性，；⑤作用强等。如目前正在进行3期临床实验的angiostatin(U.S.Patent No.5,801,012)，Endostatin(U.S.Patent No.6,174,861)。然而，肿瘤血管抑制治疗虽然具有明显的优势，但也存在一些不足：①肿瘤血管针对性不强，肿瘤难以被完全根治，还有潜在抑制正常内皮细胞的危险性。尤其在伤口愈合、月经周期、妊娠等情况下不宜使用。②表达效率低，疗效受限。③目前进入临床实验多数血管生成抑制分子进入体内表达效率低，不能在肿瘤血管局部维持治疗浓度。反复使用易引起免疫反应，且价格昂贵，限制了它们的临床应用。
由于肿瘤血管与正常血管在形态与功能上都有很大的不同，如内皮细胞体积缩小，形态不规则，细胞间隙增大，有的血管壁甚至无内皮细胞，血管壁通透性增加等等。更为重要的是肿瘤血管表达一些被称为“vascular zipcodes”的与正常血管不同的特异性蛋白。正是这些仅在肿瘤血管表达而在正常细胞中不表达或者痕量级表达的特异性分子是肿瘤血管治疗的关键靶标。
检测肿瘤血管特异性的分子标志物存在着很多困难，因为这些分子只存在于肿瘤血管，正常血管中并不存在。并且表达的量较小、难以检测、更无法纯化。正因为这样，噬菌体随机肽库的成功应用解决了这一难题(US.Patent.No.5,866,363)。采用噬菌体随机肽库技术，可以在欲筛选的靶标分子结构不明确的情况下，无需事先知道它们之间相互作用的区域及相互作用的性质来进行筛选，从而筛选出一些能与靶分子结合的特异性多肽。Arap.W.等采用噬菌体随机肽库技术发现能够与前列腺肿瘤血管特异性结合的小肽“SMSIARL”(US.Patent.No.6,610,651)
目前，大多数筛选方法均采用体外筛选，但是对于肿瘤血管内皮细胞而言，直接分离和体外培养人肿瘤血管内皮细胞，一是分离技术操作的难度，二是长期体外培养使内皮细胞失去了体内的生存环境，从而使内皮细胞细胞丧失组织特异性。而进行的一些体内的实验大多采用人肿瘤细胞系或者移植组织瘤块的裸鼠模型，也有一些采用转基因小鼠进行，移植瘤生长周期较长，这样常常使肿瘤细胞的形态和生存能力发生变化，或者丧失人源性，从而影响到这样的实验结果也许并非理想。
6天法建立CTX免疫抑制Balb/c小鼠人胃癌或食管癌移植瘤模型，由于移植瘤生长周期较短，虽小鼠血管内皮细胞开始出芽生长并引起与人胃癌组织血管的再通，保证了局部的血液供应，但是，瘤块内部的血管内皮细胞在6天内并没有被小鼠血管内皮细胞所完全取代，还大多保持了人源性。本研究所曾经利用6天法建立CTX免疫抑制Balb/c小鼠人胃癌移植瘤模型对胃癌进行了筛选，但是可能因为挑取克隆用于下一步筛选的方法不很完善，所以小肽的特异性不很理想，并且未能够进行对小肽进行体内活性检测的体内竞争抑制实验。申请人采用改进的噬菌体随机肽库体内筛选技术成功在体内筛选出能够与胃癌和食管癌血管特异性相结合的环状7肽GX系列，目前的研究结果表明该系列肽段可以同胃癌血管特异性结合，而与正常脾脏血管不结合，与肝癌，血管瘤的血管也未见特异性结合。
尽管申请人筛选出的模拟小肽其序列与天然已知分子并无相似之处，但这样并不能说明它没有同天然分子相类似的功能，也不能否认其不具有能与天然分子相结合的能力。如从噬菌体表面随机短肽库中筛选出模拟环状小肽(U.S.Patent No.5,835,382)，虽然其序列与天然EPO的序列亦无相似之处，但是它的确能够与EPO受体高亲合力结合，并且模拟促红细胞生成素(EPO)的功能。与此类似，筛选出能与消化道肿瘤血管特异性结合多肽将会在肿瘤靶向治疗等方面具有重大的意义。
                         发明内容
本发明的目的在于提供一种利用噬菌体随机肽库进行体内筛选和筛选结果活性检测的方法，并且获得11个能够与肿瘤血管特异性结合的环状7肽的氨基酸序列。
实现上述发明目的的技术方案是：首先制备免疫抑制小鼠人肿瘤组织肾包膜下移植瘤模型，从中筛选出具有能与肿瘤的血管内皮细胞高结合活性的多肽；并利用噬斑形成实验、免疫组化检测GX系列的特异性归巢性，荷瘤小鼠体内竞争抑制实验等检测了GX系列的结合活性；确认获得GX系列多肽的氨基酸序列，且证明相应序列的惟一性。
本发明选用噬菌体随机肽库体内筛选技术，成功的获得人胃低分化腺癌和人食道鳞癌血管的特异性结合环状7肽GX系列，并获得其独特的氨基酸序列，将会在肿瘤血管靶向治疗，肿瘤血管特异性分子标志物试剂的研制方面打下了良好的基础。
                         附图说明
图1是本发明的11段能够特异性结合于人消化道肿瘤血管内皮细胞上的环肽的氨基酸序列。
图2是本发明的GX₁序列同其同源性最高的蛋白序列比较。
图3是本发明的GX₂序列同其同源性最高的蛋白序列比较。
图4是本发明的GX₃序列同其同源性最高的蛋白序列比较。
图5是本发明的GX₄序列同其同源性最高的蛋白序列比较。
图6是本发明的GX₅序列同其同源性最高地蛋白序列比较。
图7是本发明的GX₆序列同其同源性最高的蛋白序列比较。
图8是本发明的GX₇序列同其同源性最高的蛋白序列比较。
图9是本发明的GX₈序列同其同源性最高的蛋白序列比较。
图10是本发明的GX₉序列同其同源性最高的蛋白序列比较。
图11是本发明的GX₁₀序列同其同源性最高的蛋白序列比较。
图12是本发明的GX₁₁序列同其同源性最高的蛋白序列比较。
                         氨基酸序列
GX₁：Gly Asn Ser Asn Pro Lys Ser
GX₂：Pro His Asn Leu Thr Lys Leu
GX₃：Tyr Ser Phe Asn Ser Trp Met
GX₄：Pro Asn Pro Asn Asn Ser Thr
GX₅：Tyr Ser Ile Asn Asp Trp His
GX₆：Leu Phe Ala Met Pro Asn Ser
GX₇：Ser Thr Val Ala Thr Ser Gln
GX₈：Tyr Val Thr Pro Tyr Asp Ile
GX₉：Ser Pro Ala Asn Leu Phe Thr
GX₁₀：Pro Met Asn Ala Asp Asn Leu
GX₁₁：Ser Arg His Asp Leu Asn Ser
                       具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步的详细说明。
肿瘤血管内皮细胞分子表面标记物是肿瘤血管治疗的基础，为此，申请人选用噬菌体随机肽库体内筛选技术，成功的获得一组人胃低分化腺癌和人食道鳞癌血管的特异性结合环状7肽GX系列，并利用噬斑形成实验、免疫组化检测GX系列的特异性归巢性，荷瘤小鼠体内竞争抑制实验等检测了GX系列的结合活性，该系列GX肽具有较高的结合消化道肿瘤血管内皮细胞的能力。
1.技术方案及其路线
1.1人肿瘤组织肾包膜下移植瘤模型的建立：
1.1.1术前准备：
Balb/c纯系小鼠雌雄各半(购自第四军医大学实验动物中心)，6周龄，体重20g-24g，实验前24h小鼠腹腔注射环磷酰胺(CTX，购自江苏恒瑞股份有限公司)150mg/kg一次，制成CTX免疫抑制小鼠。
1.1.2新鲜癌组织的处理：
在手术过程中分别取胃癌或食管癌手术患者的肿瘤组织，手术患者均经术前病理诊断为胃低分化腺癌或者食道鳞癌，瘤组织离体后立即将其投入无血清RPMI1640(购自Gibco BRL公司)中，在超净工作台中去除结缔和坏死组织，用含有双抗RPMI-1640中浸泡15min(双抗：青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100μg/ml)，然后将其切成2mm³左右的小块，再用无血清RPMI1640反复冲洗，置于RPMI-1640中备用。
1.1.3肾包膜下移植：
参考王瑜法行SRCA法：戊巴比妥钠150mg/kg(上海化学试剂分装厂)腹腔注射麻醉小鼠，消毒，无菌条件下暴露，游离肾脏，小心分离肾包膜，将切割好的组织块植入小鼠肾包膜下，缝合切口。
1.2噬菌体小鼠体内淘筛
1.2.1体内淘筛过程：
术后第6天，取一只荷瘤BALB/c小鼠，戊巴比妥钠150mg/kg腹腔注射麻醉，75％乙醇浸泡5min。将含10¹¹pfu C7C噬菌体随机肽库(购自于NEWENGLAND BIOLABS公司)的200μl RPMI1640，注入小鼠尾静脉，5min后取瘤组织和其他对照组织，称重，加入冰1ml RPMI1640-PI(含1Mm PMSF，20ug/ml aprotinin，1ug/ml leupeptin)用组织匀浆器研磨，把匀浆移入50ml离心管，加5ml冰RPMI1640-PI(含1％BSA)洗涤4次后。与1ml大肠杆菌ER2738(OD＝0.5)静止感染30min，加9ml LB培养液室温孵育30min，把混合液铺制到LB琼脂糖平皿上(含4％X-gal，5％IPTG)，37℃过夜。
1.2.2噬菌体的体外扩增：
用牙签随机挑取250个左右呈现蓝斑的噬菌体克隆，每个克隆加入5mlLB培养液于摇菌管内，37℃下250rpm培养12～14h。然后将培养物混合，4℃10000rpm离心15min，将上清移入一无菌三角锥形瓶中，加入1/6体积的PEG/NaCl(购自北京鼎国生物技术发展中心)溶液，4℃静置过夜。将4℃过夜的沉降液于4℃下10000rpm离心15min，弃去上清。用1ml RPMI1640重悬沉淀物，再次加入160μl PEG/NaCl溶液，冰浴1h，4℃下10000rpm离心10min，弃去上清，以200μl含0.02％NaN₃(购自北京鼎国生物技术发展中心)的RPMI1640溶液重悬沉淀物，此即为第一轮扩增的噬菌体。将其保存于4℃，用于下一轮筛选。胃腺癌组织体内淘筛4轮，食道鳞癌组织淘筛5轮。
1.2.3阳性噬菌体克隆的挑选及测序：
第4轮胃腺癌组织或第5轮食道鳞癌组织筛选结束后，无菌条件下以牙签随机挑取14个(胃癌)或13个(食管癌)分隔良好的蓝色噬斑分别加至2ml LB培养液中，37℃下250rpm培养2h。将噬菌体培养液4℃10000rpm离心10min后取培养上清。用华舜公司生产的单链DNA提取试剂盒进行噬菌体单链DNA的提取，按操作说明书进行操作：在含有单个噬菌体克隆的LB培养液中加入沉淀液，高速离心后得到噬菌体颗粒沉淀，加入裂解液裂解噬菌体外壳蛋白，经过树脂纯化，洗脱得到噬菌体单链DNA。以单链DNA为模板，采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物，-96gIII，5′-^HOCCC TCATAG TTA GCG TAA CG-3′送至上海生物工程有限公司测序。结果显示如下表及图1：将其分别命名为GX1-GX11，食道癌中有2例样本未测出。

样本编号样本来源呈现序列命名A₃，A₄，A₅，A₆，B₃，C₁，D₃，D₄，E₂，E₁，G₁，G₃ 胃癌 GNSNPKS GX₁A₁₀，B₁ 胃癌 PHNLTKL GX₂EB₁ 食管癌 YSFNSWM GX₃ED₂/Ee 食管癌 PNPNNST GX₄EE₃ 食管癌 YSINDWH GX₅EF₁ 食管癌 LPAMPNS GX₆EG₁/Ed 食管癌 STVATSQ GX₇Eb 食管癌 YPTPYDI GX₈Eg 食管癌 SPANLFT GX₉

Eh 食管癌 PMNADNL GX₁₀ Ei 食管癌 SRHDLNS GX₁₁

1.3呈现噬菌体归巢性的鉴定
1.3.1蓝斑计数
取移植有人胃腺癌或食道鳞癌的荷瘤BALB/c小鼠，将获得的GX系列单克隆分别以10¹¹pfu 200μl RPMI1640注入小鼠尾静脉，其他操作方法同上，37℃孵箱内过夜后比较蓝色噬斑数量。结果显示：GX₁从瘤组织获取的蓝色噬斑是其在对照组织的4.6～137.26倍；GX₂从瘤组织获取的蓝色噬斑是其在对照组织的3.98～180.74倍；GX₃从瘤组织获取的蓝色噬斑是其在对照组织的3.01～44.57倍；GX₄从瘤组织获取的蓝色噬斑是其在对照组织的1.43～3.26倍；GX₅从瘤组织获取的蓝色噬斑是其在对照组织的5.16～70.68倍；GX₆从瘤组织获取的蓝色噬斑是其在对照组织的1.69～9.42倍；GX₇从瘤组织获取的蓝色噬斑是其在对照组织的3.47～12.39倍；GX₈从瘤组织获取的蓝色噬斑是其在对照组织的1.18～4.45倍；GX₉从瘤组织获取的蓝色噬斑是其在对照组织的1.15～3.16倍；GX₁₀从瘤组织获取的蓝色噬斑是其在对照组织的1.28～5.71倍；GX₁₁从瘤组织获取的蓝色噬斑是其在对照组织的1.44～3.13倍。从结果来看GX系列均有良好的归巢于肿瘤血管的特性。
1.3.2免疫组化
1.3.2.1噬菌体M13蛋白在移植瘤中的表达
取荷胃癌或食管癌小鼠，尾静脉分别注入GX系列噬菌体10¹¹pfu，灌洗小鼠全身，方法同前。取肿瘤组织和对照组织，4％低聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。采用常规SP法染色(SP试剂盒购自于北京中山生物技术有限公司)，一抗为小鼠抗M13单克隆抗体(购自于Pharmacia公司，工作浓度为1∶80)，阴性对照采用正常山羊血清代替M13一抗，余步骤同前，封片后观察结果。结果显示：GX系列的呈现噬菌体均停留在移植瘤的血管内，M13表达较高，而在其他对照组织上几乎无表达。
1.3.2.2 VIII因子相关抗原在移植瘤中的表达
如上法取移植瘤组织，4％低聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。采用常规SP法染色(SP试剂盒购自于北京中山生物技术有限公司)，一抗为兔抗人VIII因子多克隆抗体(购自于DAKO公司，工作浓度为1∶300)，余步骤同前，封片后观察结果。结果显示：移植瘤中VIII因子显色较强，说明移植瘤内血管丰富，M13染色同VIII因子相关抗原比较结果也证实M13 GX系列呈现噬菌体表达与VIII因子表达范围类似，说明GX系列呈现肽可以特异结合在血管上。
1.3.2.3呈现噬菌体GX系列在人胃癌和食道癌上的表达
取人胃低分化腺癌或人食道鳞癌标本，石蜡包埋，切片。对于人胃低分化腺癌采用呈现噬菌体GX₁与GX₂作为一抗，对于人食道鳞癌采用GX₃～GX₁₁作为一抗，小鼠抗M13单克隆抗体作为二抗，其他程序与SP法相同，对照组织采用人肝癌组织、人血管瘤、人脾脏。观察结果显示：GX₁与GX₂结合于人胃低分化腺癌血管内皮上，而GX₃～GX₁₁结合于人食管腺癌血管内皮细胞上，而在其他对照组织上无特异性结合。说明GX₁，GX₂呈现噬菌体特异结合于人胃癌血管内皮细胞上，而GX₃～GX₁₁呈现噬菌体特异结合于人食道鳞癌血管内皮细胞上。
1.3.3体内竞争抑制实验
以下是申请人选取实验结果最好的GX₁为例，其他的GX₂～GX₁₁同样按照这个方法进行；
合成GX₁多肽(由上海吉尔生化有限公司合成)，制备荷人胃低分化腺癌小鼠模型，方法同上。由小鼠尾静脉注入GX₁合成肽，剂量分别为12.5μg，25μg，50μg，100μg，200μg和400μg，5～15min后再从尾静脉注射GX1噬菌体10¹¹pfu，5min后取瘤组织，具体操作方法同上，铺板，37℃过夜，计算蓝斑数目。结果表明：随着GX₁合成肽剂量的上升，GX₁噬菌体的噬斑数下降，说明GX₁呈现肽可以阻断GX₁呈现噬菌体与肿瘤血管的结合，说明GX₁肽特异结合在肿瘤血管上。
1.3.4肽序列的氨基酸同源性分析
确定测序无误后，按下述技术方案，鉴定氨基酸的同源性。
在non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白质数据库中，进行氨基酸序列同源性分析(Search for short，nearlyexact matches)：结果表明，在现有的蛋白多肽库里没有发现与GX系列的环状小肽相同的已知蛋白序列。GX₁与编号为gi/44554133/gb/EAK06478.1/序列中一段结构的同源性最高，为100％，但是该序列为环境中的未知蛋白并且该序列为线性的，也并非我们实验中获得的环状肽(图2)。GX₂与线性的编号为gi/19923540/ref/NP_060177.2/的人肝癌上调因子有同源性，但是人肝癌上调因子为线性，而GX₂为环状多肽(图3)。GX₃同线虫的假象蛋白gi/7497287/pir/T19889同源性最高，该假想蛋白也属于未明确功能和性质的蛋白(图4)。GX₄同Schizosaccharomyces pombe(fission yeast)中的假象蛋白gi/19113611/ref/NP_596819中一段结构有同源性(图5)，但是，该蛋白仍属线性结构，而非申请人试验结果的环状。GX₅7肽中的6个肽与环境中的未知蛋白gi/44477743/gb/EAJ54860.1/的部分序列成100％相同(图6)，但是GX₅的环状结构却无同源序列。GX₆的7肽序列与一种可能的金属蛋白酶gi/32473780/ref/NP_866774.1/相同(图7)，但是该蛋白为线性结构，是可能的金属蛋白酶，其具体功能仍不很清楚。GX₇的7肽序列与编号为gi/39593478/emb/CAE61770.1/的假想蛋白中的部分氨基酸序列有100％同源性(图8)，但是该假想蛋白仍属于线性的未知蛋白。GX₈中的6个肽与线虫属编号为gi/39597108/emb/CAE59335.1/的假想蛋白有100％同源(图9)，但是，该蛋白仍属线性结构，并且属于未明确功能和性质的蛋白。GX₉与环境中编号为gi/44043120/gb/EAG81516.1/的未知蛋白有100％同源(图10)，但是该序列为环境中的未知蛋白并且该序列为线性的，也并非我们实验中获得的环状结构。GX₁₀7肽中有6个肽与假想膜蛋白gi/29349446/ref/NP_812949.1/在氨基酸序列上有100％同源性(图11)，但是仍为线性的假想蛋白。GX₁₁中的6个肽与编号为gi/32488243/emb/CAE03063.1/有100％同源(图12)，但是和前面几个肽的情况类似，这个蛋白仍为线性的，而GX₁₁为一环状7肽，所以即使二者序列之间有较高的同源性，但实际上的空间结构和功能并不相同。因此，准确的说：并未为这11段环状7肽查到同源的、功能和结构一致的已知蛋白，这11段环状7肽属于新蛋白，并且它们同消化道肿瘤之间有明显的关系。(见附图2-12)
2.技术效果
本发明采用噬菌体随机环7肽库筛选人胃癌或食管癌血管特异性环肽，筛选出能与血管内皮细胞结合的高特异性结合环状7肽GX₁～GX₁₁，经移植瘤组织噬斑滴定，移植瘤组织和人胃癌、食管癌组织免疫组化染色，GX₁合成肽与GX₁呈现噬菌体在体内的竞争抑制实验均显示该系列7肽与人消化道肿瘤组织血管结合的特异性。这些环肽的发现将会在肿瘤血管靶向治疗，肿瘤血管特异性分子标志物试剂的研制方面将具有巨大的潜在价值。
另外，编码GX系列环肽的氨基酸序列经同源性分析后，未发现与本发明相同的基因序列，因此本发明具有惟一性和自主的知识产权。
3.最佳实施方式
3.1靶向药物的构建：
3.1.1血管靶向性腺病毒介导siRNA的构建
将本发明中发现的特异性环肽用腺病毒pAdeasy系统改造为特异性靶向胃癌血管内皮的基因治疗载体，并借助该载体将VEGFR、Raf-1的siRNA特异性导入胃癌或食管癌血管内皮细胞，通过RNAi方式干扰胃癌或食管癌血管内皮细胞的生长信号，抑制胃癌或食管癌血管内皮细胞增殖和迁移，最终达到抑制胃癌或食管癌的目的。
3.1.2血管靶向性复合肽的构建
将本发明中发现的特异性环肽同一种生物活性肽_D(KLAKLAK)₂连接，利用本发现中环肽特异性结合血管内皮细胞的能力和生物活性肽_D(KLAKLAK)₂选择作用于线粒体膜的作用，使复合肽靶向破坏胃癌或食管癌的血管内皮细胞，从而达到抑制胃癌或食管癌的目的。
3.2肿瘤血管特异性分子标志物试剂盒的构建
合成本发明中发现的特异性环肽，免疫Balb/c小鼠或新西兰兔，按常规方法制备单克隆抗体，从而构建肿瘤血管特异性分子标志物的单克隆抗体试剂盒。