采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法.pdf

本发明涉及一种用于定量比较同一基因在不同来源中的表达量的分析法，它利用生物发光法的定量特性和逐个加入不同的三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)的原理，定量比较同一基因在不同来源组织或细胞间的基因表达量差异。具体步骤为：将不同来源的信使核糖核酸(mRNA)反转录成cDNA，并在各来源cDNA中标记一段来源特异性DNA序列；将经标记的各来源cDNA混合于一管中，作为聚合酶链反应(PCR)的底物；用一个共用引物和一个基因特异性引物进行PCR扩增；采用生物发光分析法测定碱基序列，其中碱基种类代表基因的不同来源，信号强度代表各来源中基因表达量。该方法对疾病相关基因的筛选、对临床早期诊断和创制治疗疾病的特效药具有重大意义。

1.  一种采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法，它具有如下特征：
(a)用DNA序列标记法使不同来源的信使核糖核酸(mRNA)的反转录产物互补DNA(cDNA)中含有一段来源特异性序列；
(b)将经标记的各来源cDNA混合于一管中，作为聚合酶链反应(PCR)的底物，用一个共用引物和一个基因特异性引物进行PCR扩增；
(c)用生物发光分析法测定上述PCR扩增产物中与基因来源相对应的一段碱基序列，以碱基种类代表基因的不同来源，其信号强度代表各来源中基因表达量。

2.  按权利要求项1所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法，其特征在于所述的不同来源是指不同的组织或细胞。

3.  按权利要求项1所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法，其特征在于所述的DNA序列标记法是指用限制性内切酶将不同来源的双链cDNA酶解成适当长度的片段，再用序列不同的DNA适配器(adapter)与之相连接，不同来源的cDNA连有不同的DNA适配器。

4.  按权利要求项3所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法，其特征在于所述的DNA适配器是指由两条不完全互补的单链DNA组成，含有与权利要求项3中限制性内切酶切口互补的序列，在连接酶作用下能与双链cDNA酶解片段连接。

5.  按权利要求项4所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法，其特征还在于所述的两条不完全互补的单链DNA是指其中一条DNA单链中含有一段基因来源特异性的序列，并且在这段序列与该链的5’端之间含有一段不随基因来源而改变且不与另一条链3’端互补的碱基序列。

6.  按权利要求项1所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法，其特征还在于所述的DNA序列标记法是指用序列不同的引物分别反转录不同来源的mRNA，使各来源的cDNA标记上序列不同的DNA片段。

7.  按权利要求项6所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法，其特征还在于所述的序列不同的引物是指其3’端由多个胸腺嘧啶碱基组成，在3’端与5’端之间含有一段基因来源特异性的序列，并且在这段序列与该链的5’端之间含有一段不随基因来源而改变的碱基序列。

8.  按权利要求项1所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法，其特征在于所述的共用引物是指其序列与权利要求项5或权利要求项7中所述的不随基因来源而改变的碱基序列中的部分或全部序列相同。

9.  按权利要求项1所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法，其特征还在于所述的生物发光分析法是指定量测定延伸反应产生的焦磷酸盐(PPi)的方法。

10.  按权利要求项9所述的采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法，其特征还在于所述的延伸反应是指以权利要求项1中的PCR扩增产物或其单链产物为模板，加入测序引物进行退火，然后按一定次序逐个加入三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)，或三磷酸双脱氧核苷酸(ddNTP)，或它们的类似物，在DNA聚合酶的作用下，当所加dNTP或ddNTP或它们的类似物与模板互补时，所发生的聚合反应。

采用碱基序列测定法比较同一基因在不同来源中的表达量的方法
技术领域
本发明涉及一种定量比较同一基因在不同来源的组织或细胞中相对表达量的方法，具体说是一种用碱基测序的方法同时测定经不同碱基序列标记的DNA片段混合物中各DNA片段相对含量的方法。
背景技术
随着分子生物学和分析仪器的进步，人类基因组计划的测序工作已经完成，现已从构造分析转向功能分析[1]，即了解基因转写产物mRNA的分布状态及mRNA的翻译产物蛋白质在细胞及脏器组织中的存在量、分布情况和作用。通过比较健康和疾病个体间的基因表达量，可以寻找和发现疾病相关基因，进而用于临床早期诊断[2]。在药物筛选中，测定给药组与未给药组的相关基因表达量，可以发现药物的作用靶点，寻找创制治疗疾病的特效药[3]。因此，基因表达量的差异分析已逐渐成为“后测序时代”的主要任务之一。发达国家先后投入了很大的财力和物力，力争在该领域抢占制高点，实行技术垄断。目前用于比较基因表达量差异的分析方法主要有SAGE法[4]、RT-PCR法[5]和微阵列法(即基因芯片)[6]等，但这些方法仍有一些缺点，主要表现在一次只能比较两个个体间的基因表达量的差异，仪器价格昂贵，操作复杂和定量性能差等。如SAGE法，测定相当繁锁，步骤多，难以掌握，成本也高，很难普及；RT-PCR法的测定需使用专用仪器，且需用内标，测定繁锁，重复性差；微陈列法是一种高通量的测定方法，虽然测定批量大，可在一块芯片上同时测定若干个基因，但需要用荧光染料标记样品，灵敏度低，仪器价格昂贵，数据处理也较复杂，更主要的问题是其定量性能差，难于准确比较某一基因在不同来源间表达量差异。
采用生物发光技术测定碱基序列是新近发展起来的一种崭新技术[7-8]，该法简便快速，仪器价格便宜，测定成本低，易于自动化。但由于仅能测定10-30个碱基序列，故该法仅限于分析基因的突变和基因的多态性[9]。
发明内容
本发明的目的就是为了采用碱基序列测定的技术研究同一基因在不同来源中的相对表达量的方法，即如何通过测定几个碱基的序列来测定基因的相对表达量，建立一种灵敏度高、定量性好、价格低廉、操作方便的方法，并用于临床诊断。
本发明的技术解决方案如下，其测定原理如图1所示。
(1)碱基序列法标记不同来源的同一基因
有两种方法来实现：第一种方法是DNA适配器标记法，即先提取不同来源组织或细胞中的总RNA或mRNA，并将其反转录成双链cDNA，再用限制性内切酶将各来源的cDNA切成不同长度的DNA片段，分别将各来源的cDNA酶解产物与可区分不同来源的DNA适配器相连接，使各来源的cDNA标记上序列不同的DNA适配器。DNA适配器由两条不完全互补的单链DNA组成，其结构如图2所示，即一端含有与上述限制性内切酶切口互补的序列1，在连接酶作用下能与双链cDNA酶解片段连接；另一端为“Y”形结构，由一段不互补的碱基序列2和3组成，也可以将序列3设计成与序列2互补，但此时序列3的3’端必须加以适当的修饰使之不能在聚合酶的作用下发生延伸反应。序列2中含有一段基因来源特异性的序列4，并且在这段序列与该链的5’端之间含有一段不随基因来源而改变的碱基序列5。可以将不同的基因来源特异性DNA适配器设计成仅在序列4处的碱基序列不同，而组成该段序列的碱基种类和数目相同。
第二种方法为反转录引物标记法，即先提取不同来源组织或细胞中的总RNA或mRNA，用序列不同的引物分别将其反转录成cDNA，使各来源的cDNA标记上序列不同的DNA片段。反转录引物的结构如图3所示，其3’端即图中序列1由多个胸腺嘧啶碱基组成，在3’端与5’端之间含有一段基因来源特异性的序列2，并且在序列2与该链的5’端之间含有一段不随基因来源而改变的碱基序列3。可以将不同的基因来源特异性反转录引物设计成仅在序列2处的碱基序列不同，而组成该段序列的碱基种类和数目相同。
(2)PCR等比例扩增不同来源的同一基因片段
通常由组织中提取的目地基因的表达量很少，必须经过PCR扩增才能检测到。如何在单管中等比例扩增上述经标记的不同来源的同一基因是本专利的关键技术之一。首先根据目的基因序列设计一条基因特异性引物GSP；同时设计另一共用引物CP，其序列与图2中的序列5(用DNA适配器标记时)或图3中的序列3(用反转录引物标记时)相同。在引物CP和GSP的存在下，若某来源中存在目的基因，则GSP首先与之退火并发生延伸反应，引物CP与该延伸产物退火并延伸，如果没有GSP的延伸产物，引物CP不会延伸。由于采用一对共同引物CP和GSP扩增不同来源的同一基因片段，且扩增产物的Tm值完全相同(长度和碱基种类相同)，所以能够保证PCR的等比例扩增。
如果图2中臂3与臂2互补，则臂3就会在DNA聚合酶的作用下延伸，产生供引物CP退火的模板，这样就不能实现不同来源基因的等比例PCR扩增。
(3)不同来源基因扩增产物的序列测定
目前通常的测序反应是基于凝胶电泳的原理，但这种方法属于定性测定序列，定量性能差；并且不能测定引物后面碱基的序列，即不适用于测定前50个碱基的序列。基于PPi测定的生物发光测定法，如焦测序法，是通过依次逐个循环加入各dNTP进行测序反应，不但可以直接测定引物后面的碱基序列，而且定量性能很好，能通过测量峰高确定重复碱基的个数。本发明采用基于PPi测定的测序法测定不同来源基因扩增产物的序列，根据序列中碱基的种类区别各来源的基因，根据峰强度就可判断不同来源的基因表达量差异。
基因表达量分析是基因组学研究的重要内容，本发明旨在将测序技术用于基因表达量差异的比较分析中。与现有技术相比，其创新性表现在：通过一次分析就可以同时测得相同基因在多个不同个体中的表达量差异，且不需增加额外的测定成本。易于仪器化，不需要使用激光、凝胶、荧光标记和电泳。本发明方法灵敏度高、定量性好、价格低廉、操作方便，具有很大的应用前景。本发明方法对疾病相关基因的筛选、对临床早期诊断和创制治疗疾病的特效药具有重大意义，也可以用于研究人体、动物或细胞在药物等方法处置下，各相关基因的表达情况。
附图说明
图1是本发明基因表达量差异测定原理图。
图2是DNA适配器的构造示意图。
图3是反转录引物构造示意图。
图4是用DNA适配器法标记人脑癌组织、正常组织和肝癌组织中的P53基因时的测序结果图。
图5是用反转录引物法标记人肝癌细胞和人膀胱癌细胞中的P53基因时的测序结果图。
具体实施方式
下面以具体事例来阐述以上方法，主要实验步骤如下：
(1)标识不同来源的同一基因。分别提取各个体中相关组织或细胞中的总RNA或mRNA，并测定其浓度。然后按照DNA适配器标记法或反转录引物标记法，使各来源的cDNA标记上序列不同的DNA适配器或序列不同的DNA片段。当以DNA适配器标记法标记时，首先将mRNA反转录成双链cDNA，用可识别四个碱基序列的限制性内切酶(MobI)将cDNA切割成一定长度的片段，分别用含有基因来源特异性序列的DNA适配器与之相连接，然后再将经DNA适配器标记的各来源cDNA片段混合，作为PCR扩增反应的模板。当以反转录引物标记法标记时，分别用各来源相对应的反转录引物，将mRNA反转录成cDNA，纯化后混合，作为PCR扩增反应的模板。
(2)PCR扩增。以与基因来源无关的共用引物(CP)，和一个基因特异性引物(GSP)对(1)中的DNA模板进行PCR扩增反应。由于采用同一对引物CP和GSP扩增多个来源的同一基因，故该基因在各来源中的相对比例在扩增过程中保持不变，即以相同的比例扩增，而不会随着扩增次数的增加而变化。如要分别测定多个基因在上述不同来源中的表达量差异时，仅需改变基因特异性引物GSP即可。
(3)同时定量测定不同来源的基因片段扩增产物。用微球技术或酶切技术将扩增的PCR产物制备成单链后，加入与模板序列互补的通用引物进行退火。也可以直接将PCR产物纯化后，加入与模板序列互补的通用引物进行退火。然后用生物发光测序法测定碱基的序列，即在含有底物的溶液中分别加入与基因来源相对应的dNTP或ddNTP，如所加入的dNTP或ddNTP与模板互补，则释放出焦磷酸盐(PPi)，PPi在酶的作用下可迅速转化成ATP，ATP与luciferin和luciferase反应产生光信号。所得结果中的碱基序列代表着基因的不同来源，信号强度代表各来源的基因表达量。根据各个体的基因表达量的差异，可迅速判断基因的功能和发现与疾病相关的功能基因。
【实施例1】人正常组织、脑癌组织和肝癌组织中P53基因表达量差异的测定。
本例叙述了以DNA适配器标记法标记测定三个不同来源组织中P53基因的相对表达量。首先设计三种不同的DNA适配器，分别与经限制性内切酶消化过的cDNA片段连接，然后混合进行PCR扩增。
1.cDNA样品的制备
(1)总RNA的提取：取人正常组织、脑癌组织和肝癌组织各0.1g，加1ml Trizol于组织研磨器中研磨，按照Trizol说明书操作提取总RNA。经电泳鉴定其28s和18s条带完好无降解后，用紫外吸收光谱法测定其浓度，再用灭菌DEPC-H₂O调节终浓度为1μg/μl。
(2)cDNA第一链的合成：Oligo(dt)₁₆(100pmol/L)1μl和总RNA(1μg/μl)3μl，70℃ 10min后，置于冰上，加入5倍浓度的第一链缓冲液4μl，0.1mol/L DTT 2μl，RNase抑制剂(40U/μl)1μl，dNTP混合物(各2.5mmol/L)4μl，DEPC-H₂O 4μl，37℃ 2min，加入Superscript II(200U/μl)1μl，于42℃ 1h，70℃ 10min，冰上冷却。
(3)双链cDNA的合成：在上述混和液中加入5倍浓度的第二链缓冲液30μl，dNTP混合物(2.5mmol/L each)12μl，Ecoli连接酶(10U/μl)1μl，DNA聚合酶I(4U/μl)10μl，RNase H(2U/μl)1μl，加入DEPC-H₂O至总体积为150μl，16℃ 2h，70℃10min。
2.标识不同来源的同一基因
(1)酶切反应：取双链cDNA 10μl，加入1 0倍浓度的缓冲液2μl，Mbo I TaKaRa内切酶(10U/μl)1μl，灭菌蒸馏水7μl，共20μl反应体系，置于37℃水浴中反应2h，再置于70℃ 10min，使Mbo I酶灭活。Mbo I内切酶的特性是能识别DNA中5′→3′的GATC顺序，并切断使之形成5′端突出GATC的粘性末端。
(2)连接反应：取等体积的各来源的酶切反应液，分别与三种不同的DNA适配器相连，三个DNA适配器中有一条链adp-4是相同的，另一条链中含有四个基因来源特异性的碱基，这四个碱基仅是序列不同，均由c，t，g，c组成，其序列分别为：adp-1：5’-ccc cac ttc ttg ttctct catgtca cg cat cac tcg-3’；adp-2：5’-ccc cac ttc ttgttc tct catctga cg cat cac tcg-3’；adp-3：5’-ccc cac ttc ttgttc tct catatcg cg cat cac tcg-3’；adp-4：5’-gat ccg agt gatgcg cta ag-3’，其中下划线斜体部分为基因来源特异性的碱基。adp-1与adp-4构成一个DNA适配器1，adp-2与adp-4构成DNA适配器2，adp-1与adp-4构成另一个DNA适配器3，且都具有5’端突出四个碱基GATC的结构。DNA适配器1，2和3分别用于标记人正常组织、脑癌组织和肝癌组织中的P53基因。取酶切液1μl，加入构成DNA适配器的两条单链(10pmol/L)各2μl，10倍T4DNA连接酶缓冲液2μl，灭菌蒸馏水11μl，置于70℃10min，然后以0.2℃/s的速度降至16℃，加入T4DNA连接酶(4U/μl)2μl，反应2h。
3.PCR扩增及单链的制备
(1)PCR扩增：将上述三个不同来源的连接产物按1∶1∶1的比例混合于同一反应管中，分别加入共用引物(CP，5’-ccc cac ttc ttg ttctct cat-3’)(10pmol/L)2μl，生物素标记的P53基因的特异性引物(5’-gga gca cta agc gag cac tg-3’)(10 pmol/L)2μl，Mg²⁺(25mmol/L)3μl，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4μl，10×PCR Buffer5μl，TaKaRa Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，加灭菌蒸馏水至总体积50μl，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃ 30s，60℃ 30s，72℃30s，反应35个循环。最终得到的产物是生物素标记的双链DNA。
(2)单链的制备：取25μl M280磁珠，按照使用说明书的要求洗涤，溶于50μl的2×B&W Buffer(洗涤缓冲液)中，加入等体积的PCR产物，反应30min，反应过程中轻轻振摇使磁珠始终处于悬浮状态。用磁铁固定磁珠，弃去上清液，用1×B&W Buffer洗涤2～3次后加入0.1mol/L NaOH溶液20μl，反应5min，吸取上清液至另一试管中，用稀HCl调节pH值为6～7，冷藏保存。固相的磁珠洗涤后溶于1×B&W Buffer中保存，待用。
4.碱基序列测定法比较同一基因在不同来源组织中的相对表达量
取上述单链DNA样品(步骤3中的微球)制备成含有25mM Mg²⁺和5mM Tris(pH7.7)的溶液，并分别加入5pmol的共用引物CP，70℃加热10min后自然冷却至室温。取1～5μl加入到100μl的序列测定标准混合液中，然后依次加入dNTP，进行测序反应。
序列测定标准混合液组成为：0.1 M Tris-HAc(pH7.7)，2mM EDTA，10mM Mg(Ac)₂，0.1％白蛋白(BSA)，1mM二硫苏糖醇(DTT)，3μM5’-磷酸化硫酸腺苷(APS)，0.4mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.4mM荧光素，200mU/ml三磷酸腺苷硫酸化酶，2U/ml三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)，1U无外切酶活性的DNA聚合酶Klenow，及适量荧光素酶。
5.测定结果
由于DNA适配器1，2和3分别用于标记人正常组织、脑癌组织和肝癌组织中的P53基因，当加入dGTP时所得信号强度代表来源于人正常组织的基因表达量，当加入dCTP时所得信号强度代表来源于人脑癌组织的基因表达量，当加入dATPαS(dATP的类似物)时所得信号强度代表来源于人肝癌组织的基因表达量。测序结果如图4所示，图中所示序列的第一个碱基“C”来自于DNA适配器2，代表脑癌组织中P53基因的表达量A1；第二个碱基“G”来自于DNA适配器1，代表正常组织中P53基因的表达量A2；第三个碱基“A”来自于DNA适配器3，代表肝癌组织中P53基因的表达量A3，这三个碱基序列的峰高比代表着P53基因在这三种来源中的表达量差异，两次测定结果(A1∶A2∶A3)分别为：28.20∶24.9∶46.9和28.1∶22.4∶49.5，平均比值(A1∶A2∶A3)为：28.15∶23.65∶48.2。
【实施例2】人肝癌细胞和膀胱癌细胞中P53基因表达量差异的测定。
本实施例主要是采用反转录引物标记法测定P53基因在人肝癌细胞和膀胱癌细胞中的表达量差异，即用序列不同的引物分别反转录不同来源的mRNA，使各来源的cDNA标记上序列不同的DNA片段。并与RT-PCR的测定结果作对比。
1.测定样品的制备
按【实施例1】的方法，分别从人肝癌细胞和膀胱癌细胞中提取总RNA，经电泳检定质量完好后，紫外测定其浓度，然后用DEPC-H2O调节终浓度为1μg/μl。分别用反转录引物P-1和P-2将人肝癌细胞和膀胱癌细胞中的mRNA反转录成cDNA。反转录引物P-1和P-2的序列为，P-1：5’-ccc cac ttc ttg ttc tct catcag ttt ttt ttt ttt ttt-3’；P-2：5’-ccc cac ttc ttg ttc tct catgac ttt ttt ttt ttt ttt-3’。
反应步骤为：取引物P-1或P-2(10 pmol/L)3μl和总RNA(1μg/μl)3μl，70℃10min后，置于冰上，加入5倍浓度的第一链缓冲液4μl，0.1mol/L DTT 2μl，Rnase抑制剂(40U/μl)1μl，dNTP混合物(2.5mmol/L each)4μl，DEPC-H2O 2μl，37℃2min，加入SuperScript^TMIIRNase H^-反转录酶1μl，于42℃ 1h，70℃ 10min，冰上冷却。
将其纯化后，取等体积混合，作为PCR反应的模板。
2.PCR扩增及单链的制备
按照【实施例1】的方法进行PCR扩增及制备单链，其中共用引物CP与基因特异性引物均与【实施例1】相同。
3.碱基序列测定法比较同一基因在不同来源组织中的相对表达量
取上述单链DNA样品制备成含有25mM Mg²⁺和5mM Tris(pH7.7)的溶液，并分别加入5pmol的共用引物CP，70℃加热10min后自然冷却至室温。取1～5μl加入到100μl的序列测定标准混合液中，然后依次加入dNTP，进行测序反应。
由于反转录引物P-1和P-2分别用于标记人肝癌细胞和膀胱癌细胞中P53基因，因此当加入dCTP时所得信号强度代表来源于人肝癌细胞的基因表达量；当加入dGTP时所得信号强度代表来源于人膀胱癌细胞的基因表达量。
4.测定结果
测序结果如图5所示，图中所示序列的第一个碱基“C”来自于反转录引物P-1，代表人肝癌细胞的基因表达量A1；第二个碱基“G”来自于反转录引物P-2，代表人膀胱癌细胞的基因表达量A2。这两个碱基序列的峰高比代表着P53基因在这三种来源中的表达量差异，两次测定结果(A1∶A2)分别为：82.9∶17.1，87.4∶12.6，84.2∶15.8，89.5∶10.5，平均值为：86∶14＝6.14∶1，测定标准偏差为3.0∶3.0。
用RT-PCR法测定P53基因在肝癌细胞和膀胱癌细胞的表达量分别为126359拷贝/μl和22093/μl，比值为5.72∶1。
比较两种方法的测定结果，相对平均偏差小于2％，说明本发明的方法测定结果比较准确。
文中标引：
1.Bentley，D.R.2000.The Human Genome Project--an overview.Medicinal Research Reviews 20：189-96.
2.Zhang，L.，W.Zhou，V.E.Velculescu，S.E.Kern，R.H.Hruban，S.R.Hamilton，B.Vogelstein，and K.W.Kinzler.1997.Geneexpression profiles in normal and cancer cells.Science 276：1268-72.
3.Debouck，C.，and P.N.Goodfellow.1999.DNA microarrays indrug discovery and development.Nature Genetics 21：48-50.
4.Velculescu，V.E.，L.Zhang，B.Vogelstein，and K.W.Kinzler.1995.Serial analysis of gene expression.Science 270：484-7.
5.Karet，F.E.，D.S.Charnock_Jones，M.L.Harrison_Woolrych，G.O_Reilly，A.P.Davenport，and S.K.Smith.1994.Quantification of mRNA in human tissue using fluorescentnested reverse-transcriptase polymerase chain reaction.Analytical Biochemistry 220：384-90.
6.Schena，M.，D.Shalon，R.W.Davi s，and P.O.Brown.1995.Quantitative monitoring of gene expression patterns with acompl ementary DNA microarray.Science 270：467-70.
7.Ronaghi，M.，M.Uhlen，and P.Nyren，A sequencing methodbased on real-time pyrophosphate.Science，1998.281(5375)：p.363，365.
8.周国华，古卓良，章杰兵.生物发光分析法检测P53基因上的突变点.药学学报，2002；37(1)：41-45.
9.Guo-Hua Zhou，Masao Kamahori，Kazunori Okano，Kunio Harada，and Hideki Kambara.Miniaturized pyrosequencer for DNAanalysis with capillaries to deliver deoxynucleotides.Electrophoresis，2001，22，3497-3504.