抗生素产生菌LNU13的发酵条件.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410691651.X	申请日：	2014.11.25
公开号：	CN104404085A	公开日：	2015.03.11
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12P1/06申请日:20141125\|\|\|公开
IPC分类号：	C12P1/06; C12R1/465(2006.01)N	主分类号：	C12P1/06
申请人：	辽宁大学
发明人：	郑方亮; 朱春玉; 潘思明; 郑甜甜; 佘晓双; 刘宏生
地址：	110000辽宁省沈阳市沈北新区道义南大街58号
优先权：
专利代理机构：	沈阳杰克知识产权代理有限公司21207	代理人：	金春华
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内容摘要

本发明涉及一种抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件。本发明针对抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件进行了研究，比较在不同的营养条件和培养条件下，菌株Lnu-13抗生素的产生情况。确定最佳发酵培养基配方为：玉米粉3.0％、花生饼粉2.0％、MgSO40.03％、NaCl0.01％，CaCO30.2％。最佳发酵条件为：发酵培养基的初始pH7.0，培养温度28℃，摇床速度180r/min，培养时间为5天。本发明的Lnu-13菌株，对多种植物病原菌和金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等革兰氏阳性细菌有较强的抗性，具有很好的开发应用前景。

权利要求书

权利要求书
1.  抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，其特征在于：发酵培养基的碳源为玉米粉，氮源为花生饼粉。

2.  如权利要求1所述的抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养基的组成如下：按重量百分比，玉米粉2.0-4.0％，花生饼粉1.0-3.0％，MgSO4 0.01-0.03％，NaCl 0.01-0.03％，CaCO3 0.1-0.3％，余量为水。

3.  如权利要求2所述的抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养基的组成如下：按重量百分比，玉米粉3.0％，花生饼粉2.0％，MgSO40.03％，NaCl0.01％，CaCO3 0.2％，余量为水。

4.  如权利要求1、2或3所述的抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，其特征在于：所述的抗生素产生菌Lnu-13为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。

5.  抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件，其特征在于：将抗生素产生菌Lnu-13用种子培养基活化，活化后的菌株制备成菌悬液，置于权利要求3所述的发酵培养基中，调节初始pH7.0，培养温度30℃，装液量60ml/250ml，三角瓶摇床速度180rpm/min，发酵5天。

6.  如权利要求5所述的抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件，其特征在于：所述的种子培养基配方：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，蒸馏水1000ml，pH7.3。

7.  如权利要求5或6所述的抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件，其特征在于：所述的抗生素产生菌Lnu-13为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。

说明书

说明书抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域。具体地涉及抗生素产生菌Lnu-13的最佳发酵培养基及发酵条件。
本发明所称的抗生素产生菌Lnu-13，命名为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址，中国，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。
背景技术
放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70％是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂、维生素和有机酸等。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。因此，开发新的抗生素生产菌种在医药工业及农业生物防治上有重要意义。
发明内容
抗生素是微生物的次级代谢产物,其生产水平不仅取决于菌种本身的性能，而且还受营养条件、pH值大小、温度高低、甚至发酵时间等多种因素的影响和调控，这些因素相互作用又相互制约。
本发明的目的是提供一种新的抗生素生产菌种，本发明所述的抗生素产生菌，命名为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。
本发明的另一目的是提供优化的抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件，为Lnu-13的工业化生产和应用提供理论基础。
本发明的链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，是从辽宁省仙人洞国家自然保护区土壤中分离得到。将土壤样品用无菌水稀释105浓度，利用高氏一号培养基，采用常规的平板划线分离法进行分离培养，挑取放线菌单菌落，编号备用，筛选而得。
1、链霉菌Lnu-13的显微形态特征
图1为Lnu-13在光学显微镜100X下的孢子丝和气生菌丝形态，形态特征：基内菌丝无横膜，不断裂；气生菌丝多分枝，孢子丝大部分为直、波曲状、钩形、小螺旋和松散的螺旋状(一般1～2圈)，孢子呈圆形、椭圆形和梭形；图2为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征
(正面)，图中显示Lnu-13在高氏一号培养基上生长良好，表面形状为棉絮状；图3为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征(反面)，图中显示菌落与培养基着生紧密，有黄色色素生成，均符合链霉菌属的特征。
2、Lnu-13生理生化特性：
纤维素水解实验、明胶液化实验、硫化氢实验、牛奶凝固与胨化实验均呈阳性；淀粉水解实验、MR实验、VP实验、色氨酸分解实验、柠檬酸盐实验、卵磷脂酶、硝酸盐还原实验均呈阴性；可利用葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、淀粉、蔗糖、半乳糖、纤维二糖作为碳源生长，在含有葡萄糖、半乳糖和蔗糖的培养基上生长旺盛，对淀粉和纤维二糖的利用能力较差。
3、链霉菌Lnu-13的16S rDNA序列分析方法：
(1)链霉菌Lnu-13的DNA提取采用反复冻融法，以此为模板进行PCR扩增。
(2)PCR引物：正向引物BSF8/27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
反向引物BSR1541/1522：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′
(3)PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

(5)PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃1.5min；30个循环；72℃5min。
本发明链霉菌Lnu-13菌株，PCR产物测序由上海生物工程有限公司完成，测得的序列如SCQ ID NO.1所示，将所测得的16S rDNA序列用BLAST搜索工具从GeneBank中调出与其相关的16S rDNA序列，然后用CLASTAL X软件进行多序列比对，并采用MEGA4.1软件中的邻位相接法(Neighbor-Joining)进行系统进化树的构建与同源性比较，所构建的系统进化树见图4。结果与已报道的蓝色链霉菌(Streptomyces cyaneus)同源性达到99％，结合生理生化反应特性，鉴定抗生素产生菌Lnu-13为蓝色链霉菌属。
抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，发酵培养基的碳源为玉米粉，氮源为花生饼粉。优选的，发酵培养基的组成如下：按重量百分比，玉米粉3.0％，花生饼粉2.0％，MgSO40.03％，NaCl 0.01％，CaCO30.2％，余量为水。发酵的最佳培养时间是5天，发酵培养基的初始pH为7.0，装液量是60ml/250ml三角瓶，培养温度是30℃，摇床速度180r/min。
本发明的有益效果是：本发明通过确定了生物防治菌Lnu-13的最佳发酵条件，为Lnu-13的工业化生产和应用提供理论基础，采用本发明所述的发酵条件，Lnu-13发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用明显高于原始发酵培养基，抑菌圈直径达到2.66cm，通过发酵培养基的优化将Lnu-13抗生素的产生能力提高了16.5％。
附图说明
本发明所称的抗生素产生菌，命名为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2014555。
图1为Lnu-13的孢子丝和气生菌丝形态(光学显微镜100X)。
图2为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征(正面)。
图3为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征(反面)。
图4为Lnu-13菌株的系统发育进化树。
图5为不同碳源对抗生素生成的影响。
图6为不同氮源对抗生素生成的影响。
图7为不同pH对抗生素生成的影响。
具体实施方式
菌株:链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。
供试菌:金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，购自武汉大学菌种保藏中心
实施例1碳源对链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)发酵培养基的影响
1)将链霉菌Lnu-13于种子培养基中培养；种子培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，KH2PO40.5g，MgSO40.1g，FeSO40.01g，琼脂20g，水1000ml，pH 7.2～7.4。
2)发酵培养基：碳源3.0％，KNO31.5％，CaCO30.2％，NaCl 0.02％，MgSO40.01％，余量为水，pH7.2～7.4，121℃湿热灭菌20min。
3)发酵：分别用玉米粉、淀粉、甘油、葡萄糖、蔗糖作为发酵培养基的碳源，以不加任何碳源作为空白对照，每一种配制三份培养液作为重复。121℃湿热灭菌20min。分别往不同的发酵培养基中接入活化的链霉菌Lnu-13的菌悬液100ul，180r/min 30℃恒温摇床培养5d，8000r/min离心10min，取上清液，得不同的发酵液。
4)杯碟法进行拮抗实验
将4ml无菌水加入到金黄色葡萄球菌斜面中，用接种环刮下病原菌，制成菌悬液，备用。配制牛肉膏蛋白胨养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15-25g，水1000ml，pH 7.4-7.6。灭菌，当培养基冷却到不烫手时，加入金黄色葡萄球菌悬液，轻轻摇匀，倒平板，待平板冷却，牛津杯摆在平板上，将制得的不同的发酵液用移液枪加到牛津杯中，每个200ul，37℃培养20h，测量抑菌圈直径，结果如图5。图5中抑菌圈直径的测量结果见表1
表1不同碳源对抗生素生成的影响

抗生素产生菌Lnu-13能利用多种碳源有效的合成抗生素，玉米粉发酵液形成的抑菌圈直径为2.40cm，效果最佳。与其它碳源存在显著性差异，而且玉米粉价格比较低廉，所以无论是从发酵效果还是经济性方面考虑，玉米粉都是最优碳源，适于工业上大规模生产。
实施例2氮源对链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)发酵培养基的影响
1)将链霉菌Lnu-13于种子培养基中培养：同实施例1。
2)发酵培养基：玉米粉3.0％,氮源1.5％，CaCO30.2％，NaCl 0.02％，MgSO40.01％，余量为水，pH7.2～7.4，121℃湿热灭菌20min。
3)发酵：分别用蛋白胨、花生饼粉、酵母膏、豆饼粉、KNO3作为发酵培养基的氮源，以不加任何氮源作为空白对照，每一种配制三份培养液作为重复。121℃湿热灭菌20min。分别往不同的发酵培养基中接入活化的链霉菌Lnu-13的菌悬液200ul，180r/min 30℃恒温摇床培养5d，8000r/min离心10min，取上清液，得不同的发酵液。
4)杯碟法进行拮抗实验
方法同实施例1，测量抑菌圈直径，结果如图6。图6中抑菌圈直径的测量结果见表2
表2不同氮源对抗生素生成的影响

由表2可见，以蛋白胨、酵母膏、花生饼粉、豆饼粉、KNO3作为氮源时，抗生素产生菌Lnu-13都可以利用其产生拮抗物质。其中以花生饼粉为氮源的发酵液形成的抑菌圈直径为2.61cm，效果较好。
实施例3初始pH对链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)发酵培养基的影响
1)将链霉菌Lnu-13于种子培养基中培养：同实施例1。
2)发酵培养基：玉米粉3.0％，花生饼粉1.5％，CaCO30.2％，NaCl 0.02％，MgSO40.01％，余量为水，初始pH 5.0-9.0(灭菌前)，121℃湿热灭菌20min。
3)发酵：初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，每一种配制三份培养液作为重复。121℃湿热灭菌20min。分别往不同的发酵培养基中接入活化的抗生素产生菌Lnu-13的菌悬液200ul，180r/min 30℃恒温摇床培养5d，8000r/min离心10min，取上清液，得不同的发酵液。
4)杯碟法进行拮抗实验
方法同实施例1，测量抑菌圈直径，结果如图7。图7中抑菌圈直径的测量结果见表3。
表3不同初始pH对抗生素生成的影响

由表3可见，当pH为7.0时，抑菌圈直径为2.54cm，发酵液的抑菌效果最好，结果表明菌株Lnu-13在接近中性产生的抗生素最多，过酸或过碱都会对抗生素的产量有负面影响。
实施例4四因素对链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)产素能力的影响
采用L9(34)正交表进行设计试验，对抗生素产生菌Lnu-13发酵培养基进行了优化研究。选取影响Lnu-13生长的4个营养因子，即碳源(玉米粉)、氮源(花生饼粉)、MgSO4、NaCl，正交实验因素和水平见表4，每一处理重复3次，250ml摇瓶中装液量为60ml，接种量为200μl初始pH为7.0，摇床转速为180r/min，30℃恒温摇床培养5d后测量发酵液的抑菌效果，正交试验对培养基各组分优化的结果见表5。从结果可以看出，在供试的浓度变化范围内，各因素对Lnu-13产生抗生素的影响程度为，即碳源>氮源>NaCl>MgSO4，表明碳源和氮源是影响Lnu-13菌株摇瓶发酵产生抗生素的主要因素，从正交实验结果可以看出最佳的配比为A2B2C3D2,在正交试验设计中抑菌效果最佳配比为A2B2C3D1，但从K值来看，D因素影响较小，结合成本考虑，最佳配比为A2B2C3D1，培养基配方为:玉米粉3.0％、花生饼粉2.0％、MgSO40.03％、NaCl 0.01％，CaCO30.2％，余量为水。
表4正交实验因素和水平
水平玉米粉/％花生饼粉/％ MgSO4/％ NaCl/％ 1 2.0 1.0 0.01 0.01 2 3.0 2.0 0.02 0.02 3 4.0 3.0 0.03 0.03
表5正交试验对培养基各组分优化的结果分析

实施例5优化培养基配方与原始发酵培养基配方抑菌效果的比较
菌株Lnu-13在高氏一号斜面培养基上30℃培养，产生足量的孢子后制成孢子悬浮液，以200ul的量接种分别接种于250ml三角瓶内的60ml的原始发酵培养基(淀粉3.0％，KNO31.5％，CaCO30.2％，NaCl 0.02％，MgSO40.01％，余量为水，)及优化后发酵培养基(玉米粉3.0％、花生饼粉2.0％、MgSO40.03％、NaCl 0.01％，CaCO30.2％，余量为水)中，初始pH均为7.0，30℃，180r/min振荡培养5天。发酵液7000r/min离心20min，取上清液采用杯碟法测量发酵液的抑菌效果。方法同实例1。结果如下，原始发酵液抑菌圈直径为2.22cm.而优化后的发酵培养基的抑菌圈直径为2.66cm,通过发酵培养基的优化将Lnu-13抗生素的产生能力提高了16.5％。

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410691651.X(22)申请日 2014.11.25CCTCC NO：M2014555 2014.11.06C12P 1/06(2006.01)C12R 1/465(2006.01)(71)申请人辽宁大学地址 110000 辽宁省沈阳市沈北新区道义南大街58号(72)发明人郑方亮朱春玉潘思明郑甜甜佘晓双刘宏生(74)专利代理机构沈阳杰克知识产权代理有限公司 21207代理人金春华(54) 发明名称抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件(57) 摘要本发明涉及一种抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件。本发明针对抗生素产生菌Ln。

2、u-13的发酵条件进行了研究，比较在不同的营养条件和培养条件下，菌株Lnu-13抗生素的产生情况。确定最佳发酵培养基配方为：玉米粉3.0、花生饼粉2.0、MgSO40.03、NaCl0.01，CaCO30.2。最佳发酵条件为：发酵培养基的初始pH7.0，培养温度28，摇床速度180r/min，培养时间为5天。本发明的Lnu-13菌株，对多种植物病原菌和金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等革兰氏阳性细菌有较强的抗性，具有很好的开发应用前景。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表1页。

3、附图4页(10)申请公布号 CN 104404085 A(43)申请公布日 2015.03.11CN 104404085 A1/1页21.抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，其特征在于：发酵培养基的碳源为玉米粉，氮源为花生饼粉。2.如权利要求1所述的抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养基的组成如下：按重量百分比，玉米粉2.0-4.0，花生饼粉1.0-3.0，MgSO40.01-0.03，NaCl 0.01-0.03，CaCO30.1-0.3，余量为水。3.如权利要求2所述的抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养基的组成如下：按重量百分比。

4、，玉米粉3.0，花生饼粉2.0，MgSO40.03，NaCl0.01，CaCO30.2，余量为水。4.如权利要求1、2或3所述的抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，其特征在于：所述的抗生素产生菌Lnu-13为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。5.抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件，其特征在于：将抗生素产生菌Lnu-13用种子培养基活化，活化后的菌株制备成菌悬液，置于权利要求3所述的发酵培养基中，调节初始pH7.0，培养温度30，装液量60ml/250ml，三角瓶摇床速度180rpm/。

5、min，发酵5天。6.如权利要求5所述的抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件，其特征在于：所述的种子培养基配方：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，蒸馏水1000ml，pH7.3。7.如权利要求5或6所述的抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件，其特征在于：所述的抗生素产生菌Lnu-13为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。权利要求书CN 104404085 A1/6页3抗生素产生菌 Lnu-13 的发酵条件技术领域0001 本发明属于微生物发酵。

6、技术领域。具体地涉及抗生素产生菌Lnu-13的最佳发酵培养基及发酵条件。0002 本发明所称的抗生素产生菌Lnu-13，命名为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址，中国，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。背景技术0003 放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂、维生素和有机酸等。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。因此，开发新的抗生素生产菌种在医药工业及农业生物防治上有。

7、重要意义。发明内容0004 抗生素是微生物的次级代谢产物,其生产水平不仅取决于菌种本身的性能，而且还受营养条件、pH值大小、温度高低、甚至发酵时间等多种因素的影响和调控，这些因素相互作用又相互制约。0005 本发明的目的是提供一种新的抗生素生产菌种，本发明所述的抗生素产生菌，命名为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。0006 本发明的另一目的是提供优化的抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件，为Lnu-13的工业化生产和应用提供理论基础。0007 本发明的链霉菌Ln。

8、u-13(Streptomyces sp.lnu-13)，是从辽宁省仙人洞国家自然保护区土壤中分离得到。将土壤样品用无菌水稀释105浓度，利用高氏一号培养基，采用常规的平板划线分离法进行分离培养，挑取放线菌单菌落，编号备用，筛选而得。0008 1、链霉菌Lnu-13的显微形态特征0009 图1为Lnu-13在光学显微镜100X下的孢子丝和气生菌丝形态，形态特征：基内菌丝无横膜，不断裂；气生菌丝多分枝，孢子丝大部分为直、波曲状、钩形、小螺旋和松散的螺旋状(一般12圈)，孢子呈圆形、椭圆形和梭形；图2为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征0010 (正面)，图中显示Lnu-13在高氏一号培养基上。

9、生长良好，表面形状为棉絮状；图3为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征(反面)，图中显示菌落与培养基着生紧密，有黄色色素生成，均符合链霉菌属的特征。0011 2、Lnu-13生理生化特性：0012 纤维素水解实验、明胶液化实验、硫化氢实验、牛奶凝固与胨化实验均呈阳性；淀粉水解实验、MR实验、VP实验、色氨酸分解实验、柠檬酸盐实验、卵磷脂酶、硝酸盐还原实验说明书CN 104404085 A2/6页4均呈阴性；可利用葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、淀粉、蔗糖、半乳糖、纤维二糖作为碳源生长，在含有葡萄糖、半乳糖和蔗糖的培养基上生长旺盛，对淀粉和纤维二糖的利用能力较差。0013 3、链霉菌Lnu-13。

10、的16S rDNA序列分析方法：0014 (1)链霉菌Lnu-13的DNA提取采用反复冻融法，以此为模板进行PCR扩增。0015 (2)PCR引物：正向引物BSF8/27：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-30016 反向引物BSR1541/1522：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-30017 (3)PCR引物由上海生物工程有限公司合成。0018 0019 (5)PCR扩增条件：945min；9430s，5730s，721.5min；30个循环；725min。0020 本发明链霉菌Lnu-13菌株，PCR产物测序由上海生物工程有限公司完成，测得的序列如SCQ ID N。

11、O.1所示，将所测得的16S rDNA序列用BLAST搜索工具从GeneBank中调出与其相关的16S rDNA序列，然后用CLASTAL X软件进行多序列比对，并采用MEGA4.1软件中的邻位相接法(Neighbor-Joining)进行系统进化树的构建与同源性比较，所构建的系统进化树见图4。结果与已报道的蓝色链霉菌(Streptomyces cyaneus)同源性达到99，结合生理生化反应特性，鉴定抗生素产生菌Lnu-13为蓝色链霉菌属。0021 抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，发酵培养基的碳源为玉米粉，氮源为花生饼粉。优选的，发酵培养基的组成如下：按重量百分比，玉米粉3.0，花生。

12、饼粉2.0，MgSO40.03，NaCl 0.01，CaCO30.2，余量为水。发酵的最佳培养时间是5天，发酵培养基的初始pH为7.0，装液量是60ml/250ml三角瓶，培养温度是30，摇床速度180r/min。0022 本发明的有益效果是：本发明通过确定了生物防治菌Lnu-13的最佳发酵条件，为Lnu-13的工业化生产和应用提供理论基础，采用本发明所述的发酵条件，Lnu-13发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用明显高于原始发酵培养基，抑菌圈直径达到2.66cm，通过发酵培养基的优化将Lnu-13抗生素的产生能力提高了16.5。附图说明0023 本发明所称的抗生素产生菌，命名为链霉菌Lnu-13。

13、(Streptomyces sp.lnu-13)，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2014555。0024 图1为Lnu-13的孢子丝和气生菌丝形态(光学显微镜100X)。说明书CN 104404085 A3/6页50025 图2为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征(正面)。0026 图3为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征(反面)。0027 图4为Lnu-13菌株的系统发育进化树。0028 图5为不同碳源对抗生素生成的影响。0029 图6为不同氮源对抗生素生成的影响。0030 图7为不同pH对抗生素生成的影响。具体实施方式0。

14、031 菌株:链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。0032 供试菌:金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，购自武汉大学菌种保藏中心0033 实施例1碳源对链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)发酵培养基的影响0034 1)将链霉菌Lnu-13于种子培养基中培养；种子培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，KH2PO40.5g，MgSO40.1g，FeSO40.01g，琼脂20g，水1000ml，p。

15、H 7.27.4。0035 2)发酵培养基：碳源3.0，KNO31.5，CaCO30.2，NaCl 0.02，MgSO40.01，余量为水，pH7.27.4，121湿热灭菌20min。0036 3)发酵：分别用玉米粉、淀粉、甘油、葡萄糖、蔗糖作为发酵培养基的碳源，以不加任何碳源作为空白对照，每一种配制三份培养液作为重复。121湿热灭菌20min。分别往不同的发酵培养基中接入活化的链霉菌Lnu-13的菌悬液100ul，180r/min 30恒温摇床培养5d，8000r/min离心10min，取上清液，得不同的发酵液。0037 4)杯碟法进行拮抗实验0038 将4ml无菌水加入到金黄色葡萄球菌斜面。

16、中，用接种环刮下病原菌，制成菌悬液，备用。配制牛肉膏蛋白胨养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15-25g，水1000ml，pH 7.4-7.6。灭菌，当培养基冷却到不烫手时，加入金黄色葡萄球菌悬液，轻轻摇匀，倒平板，待平板冷却，牛津杯摆在平板上，将制得的不同的发酵液用移液枪加到牛津杯中，每个200ul，37培养20h，测量抑菌圈直径，结果如图5。图5中抑菌圈直径的测量结果见表10039 表1不同碳源对抗生素生成的影响0040 说明书CN 104404085 A4/6页60041 抗生素产生菌Lnu-13能利用多种碳源有效的合成抗生素，玉米粉发酵液形成的抑菌圈直。

17、径为2.40cm，效果最佳。与其它碳源存在显著性差异，而且玉米粉价格比较低廉，所以无论是从发酵效果还是经济性方面考虑，玉米粉都是最优碳源，适于工业上大规模生产。0042 实施例2氮源对链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)发酵培养基的影响0043 1)将链霉菌Lnu-13于种子培养基中培养：同实施例1。0044 2)发酵培养基：玉米粉3.0,氮源1.5，CaCO30.2，NaCl 0.02，MgSO40.01，余量为水，pH7.27.4，121湿热灭菌20min。0045 3)发酵：分别用蛋白胨、花生饼粉、酵母膏、豆饼粉、KNO3作为发酵培养基的氮源，以不加任何氮源。

18、作为空白对照，每一种配制三份培养液作为重复。12 1湿热灭菌20min。分别往不同的发酵培养基中接入活化的链霉菌Lnu-13的菌悬液200ul，180r/min 30恒温摇床培养5d，8000r/min离心10min，取上清液，得不同的发酵液。0046 4)杯碟法进行拮抗实验0047 方法同实施例1，测量抑菌圈直径，结果如图6。图6中抑菌圈直径的测量结果见表20048 表2不同氮源对抗生素生成的影响0049 0050 由表2可见，以蛋白胨、酵母膏、花生饼粉、豆饼粉、KNO3作为氮源时，抗生素产生菌Lnu-13都可以利用其产生拮抗物质。其中以花生饼粉为氮源的发酵液形成的抑菌圈直径为2.61cm。

19、，效果较好。0051 实施例3初始pH对链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)发酵培养基的影响0052 1)将链霉菌Lnu-13于种子培养基中培养：同实施例1。0053 2)发酵培养基：玉米粉3.0，花生饼粉1.5，CaCO30.2，NaCl 0.02，MgSO40.01，余量为水，初始pH 5.0-9.0(灭菌前)，121湿热灭菌20min。0054 3)发酵：初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，每一种配制三份培养液作为重复。121湿热灭菌20min。分别往不同的发酵培养基中接入活化的抗生素产生菌Lnu-13的菌悬液200ul，180r/min 。

20、30恒温摇床培养5d，8000r/min离心10min，取上清液，得不同的发酵液。0055 4)杯碟法进行拮抗实验说明书CN 104404085 A5/6页70056 方法同实施例1，测量抑菌圈直径，结果如图7。图7中抑菌圈直径的测量结果见表3。0057 表3不同初始pH对抗生素生成的影响0058 0059 由表3可见，当pH为7.0时，抑菌圈直径为2.54cm，发酵液的抑菌效果最好，结果表明菌株Lnu-13在接近中性产生的抗生素最多，过酸或过碱都会对抗生素的产量有负面影响。0060 实施例4四因素对链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)产素能力的影响0061 。

21、采用L9(34)正交表进行设计试验，对抗生素产生菌Lnu-13发酵培养基进行了优化研究。选取影响Lnu-13生长的4个营养因子，即碳源(玉米粉)、氮源(花生饼粉)、MgSO4、NaCl，正交实验因素和水平见表4，每一处理重复3次，250ml摇瓶中装液量为60ml，接种量为200l初始pH为7.0，摇床转速为180r/min，30恒温摇床培养5d后测量发酵液的抑菌效果，正交试验对培养基各组分优化的结果见表5。从结果可以看出，在供试的浓度变化范围内，各因素对Lnu-13产生抗生素的影响程度为，即碳源氮源NaClMgSO4，表明碳源和氮源是影响Lnu-13菌株摇瓶发酵产生抗生素的主要因素，从正交实验。

22、结果可以看出最佳的配比为A2B2C3D2,在正交试验设计中抑菌效果最佳配比为A2B2C3D1，但从K值来看，D因素影响较小，结合成本考虑，最佳配比为A2B2C3D1，培养基配方为:玉米粉3.0、花生饼粉2.0、MgSO40.03、NaCl 0.01，CaCO30.2，余量为水。0062 表4正交实验因素和水平0063 水平玉米粉/花生饼粉/MgSO4/NaCl/1 2.0 1.0 0.01 0.012 3.0 2.0 0.02 0.023 4.0 3.0 0.03 0.030064 表5正交试验对培养基各组分优化的结果分析0065 说明书CN 104404085 A6/6页80066 实施。

23、例5优化培养基配方与原始发酵培养基配方抑菌效果的比较0067 菌株Lnu-13在高氏一号斜面培养基上30培养，产生足量的孢子后制成孢子悬浮液，以200ul的量接种分别接种于250ml三角瓶内的60ml的原始发酵培养基(淀粉3.0，KNO31.5，CaCO30.2，NaCl 0.02，MgSO40.01，余量为水，)及优化后发酵培养基(玉米粉3.0、花生饼粉2.0、MgSO40.03、NaCl 0.01，CaCO30.2，余量为水)中，初始pH均为7.0，30，180r/min振荡培养5天。发酵液7000r/min离心20min，取上清液采用杯碟法测量发酵液的抑菌效果。方法同实例1。结果如下，原始发酵液抑菌圈直径为2.22cm.而优化后的发酵培养基的抑菌圈直径为2.66cm,通过发酵培养基的优化将Lnu-13抗生素的产生能力提高了16.5。说明书CN 104404085 A1/1页90001 序列表CN 104404085 A1/4页10图1图2说明书附图CN 104404085 A10。

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