分离DNJ及制备DNJ纳米混悬剂的方法.pdf

本发明公开了分离DNJ和制备DNJ纳米混悬剂的方法，分离DNJ的方法以桑树为原料，经过粉碎提取，微波焦化，加水溶解后得到分离物I，该分离物依次通过细沙-活性炭和硅胶两次色谱分离形成分离物II，所述分离物II经离子交换与乙醇沉淀得到分离物III，该分离物III经氧化铝色谱柱分离得到分离物IV，将分离物IV结晶与重结晶后得到目标产物。制备DNJ纳米混悬剂的方法首先对DNJ组分进行酯化修饰，增强其脂溶性，然后通过表面活性剂结合和高压均质处理将DNJ分散成高度分散粒子群。本发明分离DNJ技术具有原料易得，工艺简单，效果明显，适于大规模生产的特点，本发明制备DNJ纳米混悬剂可以改善药物的溶解性，提高生物利用率。

权利要求书
1.  一种分离DNJ的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、干燥粉碎桑材料并用稀盐酸、乙醇溶液或沸水提取得到提取液；
2)、首先将步骤1)的提取液浓缩后微波焦化，得到粉状提取物，然后将其溶解并离心分离上层清液，最后浓缩上清液，得到分离物I；
3)、初次色谱分离，包括：
A、利用色谱柱i分离分离物I，本步骤固定相为细沙与活性炭混合物，流动相为乙醇溶液；
B、浓缩A所得洗脱液并用色谱柱ii进一步分离，本步骤固定相为硅胶，流动相为乙酸乙酯、乙醇的混合液；
C、浓缩B所得洗脱液，得到分离物II；
4)、离子交换层析：首先使分离物II通过阳离子交换树脂，并用氢氧化钙溶液进行洗脱，然后浓缩离子交换所得洗脱液，接着向浓缩后的洗脱液中加入乙醇进行沉淀，最后过滤浓缩得到分离物III；
5)、首先利用色谱柱iii分离分离物III，本步骤固定相为氧化铝，流动相为乙酸乙酯、乙醇混合液，然后浓缩洗脱液得到分离物IV；
6)、首先将分离物IV加入乙醇溶液结晶，然后将结晶产物加入乙酸乙酯、乙醇混合溶液中重结晶，最后分离结晶产物即得到分离目标组分。

2.  根据权利要求1所述分离DNJ的方法，其特征在于：步骤1)使用稀盐酸提取时盐酸浓度为0.03～0.07mol/L，使用乙醇溶液提取时乙醇浓度为60～80％，液料比为20～45mL/g，提取次数为3～5次，提取时利用350～490W超声波辅助处理20～40min；使用沸水提取时沸水温度为95～100℃，液料比为20～45mL/g，提取时间20～40min。

3.  根据权利要求1所述分离DNJ的方法，其特征在于：步骤2)微波焦化时微波功率为640～800W，处理时间为2～6min。

4.  根据权利要求1所述分离DNJ的方法，其特征在于：步骤3)-A中细沙与活性炭体积比为2:1，乙醇溶液浓度为50～90％，洗脱流速为0.9～1.6BV/h，收集1～30柱体积洗脱液；步骤3)-B中乙酸乙酯与乙醇体积比为1:3～2:1，洗脱流速为0.5～1.3BV/h，收集1～30柱体积洗脱液。

5.  根据权利要求1所述分离DNJ的方法，其特征在于：步骤4)氢氧化钙溶液pH为10～12，洗脱流速为0.9～1.6BV/h，收集1～30柱体积洗脱液，乙醇占浓缩液体积浓度为70～85％。

6.  根据权利要求1所述分离DNJ的方法，其特征在于：步骤5)乙酸乙酯与乙醇体积比为 1:3～2:1，洗脱流速为0.3～0.8BV/h，收集1～50柱体积洗脱液。

7.  根据权利要求1所述分离DNJ的方法，其特征在于：步骤6)结晶温度为1～6℃，乙醇溶液浓度大于90％，时间为6～48h，重结晶温度为-18～-23℃，乙酸乙酯与乙醇体积比为2:1～7:1，时间为6～48h，按照结晶-重结晶-结晶-重结晶的顺序重复2～5遍。

8.  制备DNJ纳米混悬剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、制备酯化目标组分，包括：
a、按物质的量计取氯化1-丁基-3-甲基咪唑0.25～1.0份、DNJ0.03-0.07份、乙、丙、丁、戊、己或庚酸酐0.3-0.5份和八水硫酸铝0.003～0.012份并加入反应釜混合反应；b、乙酸乙酯洗涤步骤a的反应产物，分层后取上层液，用饱和碳酸钠调至中性，得酯化目标组分；
2)配制溶液A：所述溶液A按质量计含甘露醇或聚乙二醇400：0.2～3％，乳糖：0.5～2％，葡萄糖：0.5～2％，羧甲基纤维素钠：0.3～5％，其余为水；
3)向溶液A中加入表面活性剂配制溶液B，所述溶液B中表面活性剂质量百分含量为0.5～5％，所述表面活性剂是聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、泊洛沙姆188、吐温80、卵磷脂、十二烷基硫酸钠或三乙酸甘油酯中的任意一种；
4)按体积比3:2～2:3混合步骤1)所得酯化目标组分和溶液B并进行超声波处理，超声处理时功率为140～280W，时间15～45min；
5)去除步骤4)溶液中的有机组分，然后移至高压均质机或超微纳米粉碎机处理，得到纳米混悬剂。

9.  根据权利要求8所述制备DNJ纳米混悬剂的方法，其特征在于：步骤1)混合反应时温度为80～160℃，反应时间为6～14h，混合液转速为300～500r/min，所得酯化目标组分的转化率为63.2～87.3％，所制得酯化目标组分的质量浓度为0.7～1.25％。

10.  根据权利要求8所述制备DNJ纳米混悬剂的方法，其特征在于：步骤5)高压均质处理时分别在500bar、1000bar、1500bar压力下各循环5～l0次，或超微纳米粉碎机2900rpm碾磨45～60min，得平均粒径为180～380nm的混悬液。

说明书分离DNJ及制备DNJ纳米混悬剂的方法
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，涉及药物分离纯化技术，特别涉及从桑源规模化分离纯化DNJ以及制备DNJ组分纳米混悬剂的方法。
背景技术
糖尿病已成为危害人类的健康的主要杀手之一，可引发眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害及功能障碍。据估计，到2050年，世界上患糖尿病的人数将达到3亿，其中90％为2型糖尿病。目前针对2型糖尿病的口服降糖药主要有磺酰脲类、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂和噻唑烷二酮类4类。其中α-葡萄糖苷酶抑制剂降血糖效果显著，受到的关注最为广泛。目前已经上市的阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇属于此类药物，但这几种药物都通过化学合成方法得到，容易引发不同程度的胀气、腹部不适、恶心、呕吐、肠鸣及腹泻等副反应。因此，探索开发高效低毒植物源α-葡萄糖苷酶抑制剂类降血糖药物是中药研究领域的重要发展目标。
DNJ(中文名1-脱氧野尻霉素)是一种哌啶生物碱，广泛存在与桑树的枝干、树叶及根茎中，其结构与葡萄糖相似(结构式如下图所示)，可以与哺乳动物的小肠内的α-葡萄糖苷酶结合，且亲和力明显大于麦芽糖、蔗糖等二糖，从而阻断了二糖与α-葡萄糖苷酶结合，竞争性的抑制了二糖分解为葡萄糖，最终达到控制血糖含量的目的。

目前，受DNJ本身理化性质的限制，现有的分离技术或操作简单效率低、或技术复杂规模小，限制了天然DNJ的实用化和规模化开发，致使DNJ的市场投入量远远小于实际需求量(相关内容可以参考作者对近年来国内外有关植物DNJ的分离纯化研究中各方法的优劣所作系统化总结和讨论(植物源DNJ分离纯化技术综述，蚕业科学，2014，40(3):0544－0550))。鉴于DNJ优异的降血糖性能及其在大规模推广应用所遇到的困境，有必要开发一种简单高效提纯天然DNJ的方法。
药物通过血液或体液扩散转运，首先要具有一定的水溶性，但药物要通过脂质性的生物 膜到达各组织细胞，还要求其有适当的脂溶性。DNJ属于水溶性好脂溶性差的物质，因难以通过生物膜到达小肠而不适于生理注射用药。若口服则小肠生理上段的α-葡萄糖苷酶易被抑制，中、下段糖类消化的受影响程度较小，需要通过一定的方法增强其与体内黏膜组织的粘附性，从而延长DNJ在体内的滞留时间，提高其生物利用度。
发明内容
有鉴于此，本发明首先提供一种简单高效的从天然植物中分离提纯DNJ的方法。在此基础上，本发明还提供一种制备DNJ纳米混悬剂的方法。
一种分离DNJ的方法，包括以下步骤：
1)、干燥粉碎桑材料并用稀盐酸、乙醇溶液或沸水提取得到提取液；
2)、首先将步骤1)的提取液浓缩后微波焦化，得到粉状提取物，然后将其溶解并离心分离上层清液，最后浓缩上清液，得到分离物I；
3)、初次色谱分离，包括：
A、利用色谱柱i分离分离物I，本步骤固定相为细沙与活性炭混合物，流动相为乙醇溶液；
B、浓缩A所得洗脱液并用色谱柱ii进一步分离，本步骤固定相为硅胶，流动相为乙酸乙酯、乙醇的混合液；
C、浓缩B所得洗脱液，得到分离物II；
4)、离子交换层析：首先使分离物II通过阳离子交换树脂，并用氢氧化钙溶液进行洗脱，然后浓缩离子交换所得洗脱液，接着向浓缩后的洗脱液中加入乙醇进行沉淀，最后过滤浓缩得到分离物III；
5)、首先利用色谱柱iii分离分离物III，本步骤固定相为氧化铝，流动相为乙酸乙酯、乙醇混合液，然后浓缩洗脱液得到分离物IV；
6)、首先将分离物IV加入乙醇溶液结晶，然后将结晶产物加入乙酸乙酯、乙醇混合溶液中重结晶，最后分离结晶产物即得到分离目标组分。
优选的，步骤1)使用稀盐酸提取时盐酸浓度为0.03～0.07mo l/L；使用乙醇溶液提取时乙醇浓度为60～80％，液料比为20～45mL/g，提取次数为3～5次，提取时利用350～490W超声波辅助处理20～40min；使用沸水提取时沸水温度为95～100℃，液料比为20～45mL/g，提取时间20～40min。
优选的，步骤2)微波焦化时微波功率为640～800W，处理时间为2～6min。
优选的，步骤3)-A中细沙与活性炭体积比为2:1，乙醇溶液浓度为50～90％，洗脱流速 为0.9～1.6BV/h，收集1～30柱体积洗脱液；步骤3)-B中乙酸乙酯与乙醇体积比为1:3～2:1，洗脱流速为0.5～1.3BV/h，收集1～30柱体积洗脱液。
优选的，步骤4)氢氧化钙溶液pH为10～12，洗脱流速为0.9～1.6BV/h，收集1～30柱体积洗脱液，乙醇占浓缩液体积浓度为70～85％。
优选的，步骤5)乙酸乙酯与乙醇体积比为1:3～2:1，洗脱流速为0.3～0.8BV/h，收集1～50柱体积洗脱液。
优选的，步骤6)结晶温度为1～6℃，乙醇溶液浓度大于90％，时间为6～48h，重结晶温度为-18～-23℃，乙酸乙酯与乙醇体积比为2:1～7:1，时间为6～48h，按照结晶-重结晶-结晶-重结晶的顺序重复2～5遍。
本发明制备DNJ纳米混悬剂的方法，包括以下步骤：
1)、制备酯化目标组分，包括：
a、按物质的量计取氯化1-丁基-3-甲基咪唑0.25～1.0份、DNJ0.03-0.07份、乙、丙、丁、戊、己或庚酸酐0.3-0.5份和八水硫酸铝0.003～0.012份并加入反应釜混合反应；b、乙酸乙酯洗涤步骤a的反应产物，分层后取上层液，用饱和碳酸钠调至中性，得酯化目标组分；
2)配制溶液A：所述溶液A按质量计含甘露醇或聚乙二醇400：0.2～3％，乳糖：0.5～2％，葡萄糖：0.5～2％，羧甲基纤维素钠：0.3～5％，其余为水；
3)向溶液A中加入表面活性剂配制溶液B，所述溶液B中表面活性剂质量百分含量为0.5～5％，所述表面活性剂是聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、泊洛沙姆188、吐温80、卵磷脂、十二烷基硫酸钠或三乙酸甘油酯中的任意一种；
4)按体积比3:2～2:3混合步骤1)所得酯化目标组分和溶液B并进行超声波处理，超声处理时功率为140～280W，时间15～45min；
5)去除步骤4)溶液中的有机组分，然后移至高压均质机或超微纳米粉碎机处理，得到纳米混悬剂。
优选的，步骤1)混合反应时温度为80～160℃，反应时间为6～14h，混合液转速为300～500r/min，所得酯化目标组分的转化率为63.2～87.3％，所制得酯化目标组分的质量浓度为0.7～1.25％。
优选的，步骤5)高压均质处理时分别在500bar、1000bar、1500bar压力下各循环5～l0次，或超微纳米粉碎机2900rpm碾磨45～60min，得平均粒径为180～380nm的混悬液
本发明的有益效果在于：
本发明分离DNJ的方法以普通桑为原材料，在色谱分离技术原理的基础上提出了一套简 单、高效、实用的DNJ分离纯化技术路线。本发明分离方法中首次利用微波焦化手段处理提取物，在不损伤DNJ稳定性的前提下使部分生物大分子被焦化成不溶性的固体而较容易分离掉；本发明以细沙和活性炭为固定相并配合以乙醇为流动相，可以有效去除分离物I中的大量杂质，而且该固定相可以重复使用，有助于成本节约；本发明离子交换时以氢氧化钙溶液代替传统工艺中具有强刺激性气味的氨水来洗脱阳离子交换树脂，后续工序中不仅相对于氢氧化钠等碱性物质易被乙醇沉淀去除，而且洗脱效果可行性明显；本发明进一步以氧化铝作为固定相，乙酸乙酯、乙醇混合液作为流动相，可以提高分离效率并大幅降低DNJ的可逆吸附损失，改善提纯收率；本发明提纯过程中各溶剂可循环利用，各色谱柱填料价格低廉且工艺过程操作简单、重复性较好，适用于大规模的工业化生产。
本发明制备DNJ纳米混悬剂的方法首先对DNJ组分进行酯化修饰，使之变为脂溶性强且在体内易于酶解为DNJ的有效成分，本发明进一步通过表面活性剂结合和高压均质处理将DNJ有效成分分散成粒径小于1000nm的高度分散粒子群，形成稳定的纳米胶态分散体，可以改善难溶性药物的溶解度和溶出率；从而解决了DNJ脂溶性差，生物利用率低的问题。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
下述实施例将公开分离DNJ及制备DNJ纳米混悬剂的方法。
分离DNJ的方法，包括以下步骤：
1)、干燥粉碎桑材料并用稀盐酸、乙醇溶液或沸水提取得到提取液；
其中：使用稀盐酸提取时盐酸浓度为0.03～0.07mo l/L；使用乙醇溶液提取时乙醇浓度为60～80％，液料比为20～45mL/g，提取次数为3～5次，提取时利用350～490W超声波辅助处理20～40min；使用沸水提取时沸水温度为95～100℃，液料比为20～45mL/g，提取时间20～40min；
2)、首先将步骤1)的提取液浓缩后微波焦化，得到粉状提取物，然后将其溶解并离心分离上层清液，最后浓缩上清液，得到分离物I；
其中步骤2)微波焦化时微波功率为640～800W，处理时间为2～6min；
3)、初次色谱分离，包括：
A、利用色谱柱i分离分离物I，本步骤固定相为细沙与活性炭混合物，流动相为乙醇溶液；本步骤中细沙与活性炭体积比为2:1，乙醇溶液浓度为50～90％，洗脱流速为0.9～1.6BV/h，收集1～30柱体积洗脱液；
B、浓缩A所得洗脱液并用色谱柱ii进一步分离，本步骤固定相为硅胶，流动相为乙酸乙酯、乙醇的混合液；本步骤中乙酸乙酯与乙醇体积比为1:3～2:1，洗脱流速为0.5～1.3BV/h， 收集1～30柱体积洗脱液；
C、浓缩B所得洗脱液，得到分离物II；
4)、离子交换层析：首先使分离物II通过阳离子交换树脂，并用氢氧化钙溶液进行洗脱，然后浓缩离子交换所得洗脱液，接着向浓缩后的洗脱液中加入乙醇进行沉淀，最后过滤浓缩得到分离物III；本步骤中氢氧化钙溶液pH为10～12，洗脱流速为0.9～1.6BV/h，收集1～30柱体积洗脱液，乙醇占浓缩液体积浓度为70～85％；
5)、首先利用色谱柱iii分离分离物III，本步骤固定相为氧化铝，流动相为乙酸乙酯、乙醇混合液，然后浓缩洗脱液得到分离物IV；本步骤中乙酸乙酯与乙醇体积比为1:3～2:1，洗脱流速为0.3～0.8BV/h，收集1～50柱体积洗脱液；
6)、首先将分离物IV加入乙醇溶液结晶，然后将结晶产物加入乙酸乙酯、乙醇混合溶液中重结晶，最后分离结晶产物即得到分离目标组分；本步骤中结晶温度为1～6℃，乙醇溶液浓度大于90％，时间为6～48h，重结晶温度为-18～-23℃，乙酸乙酯与乙醇体积比为2:1～7:1，时间为6～48h，按照结晶-重结晶-结晶-重结晶的顺序重复2～5遍。
制备DNJ纳米混悬剂的方法，优选以上述方法所制得的DNJ目标组分(其中DNJ的质量百分比为≥35％)，具体包括以下步骤：
1)、制备酯化目标组分，包括：
a、按物质的量计取氯化1-丁基-3-甲基咪唑0.25～1.0份、DNJ(DNJ标准品或含DNJ的分离组分)0.03-0.07份、乙、丙、丁、戊、己或庚酸酐0.3-0.5份和八水硫酸铝0.003～0.012份并加入反应釜混合反应；本步骤混合反应时温度为80～160℃，反应时间为6～14h，混合液转速为300～500r/min；
b、乙酸乙酯洗涤步骤a的反应产物，分层后取上层液，用饱和碳酸钠调至中性，得酯化目标组分；经检测，本步骤所得酯化目标组分的转化率为63.2～87.3％，所制得酯化目标组分的质量浓度为0.7～1.25％；
2)配制溶液A：所述溶液A按质量计含甘露醇或聚乙二醇400：0.2～3％，乳糖：0.5～2％，葡萄糖：0.5～2％，羧甲基纤维素钠：0.3～5％，其余为水；
3)向溶液A中加入表面活性剂配制溶液B，所述溶液B中表面活性剂质量百分含量为0.5～5％，所述表面活性剂是聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、泊洛沙姆188、吐温80、卵磷脂、十二烷基硫酸钠或三乙酸甘油酯中的任意一种；
4)按体积比3:2～2:3混合步骤1)所得酯化目标组分和溶液B并进行超声波处理；本步骤超声处理时功率为140～280W，时间为15～45min；
5)去除步骤4)溶液中的有机组分，然后移至高压均质机或超微纳米粉碎机处理，得到纳米混悬剂；具体可采用分别在500bar、1000bar、1500bar压力下各循环5～l0次，或超微纳米粉碎机2900rpm碾磨45～60min，得平均粒径为180～380nm的混悬液。
实施例1：
本实施制备DNJ纳米混悬剂的方法，包括以下步骤：
(一)、制备含DNJ的提取浸膏：可采用以下3种方法中的一种或多种：
方法1：桑材料干燥粉碎后用70％的乙醇溶液超声波辅助(420W，30min)提取，其中液料比为40mL/g，提取次数为4遍，过滤提取液，减压浓缩后得提取浸膏。5kg桑皮干粉得0.50kg浸膏，其中DNJ的纯度为0.104％。
方法2：桑材料干燥粉碎后用纯水煮沸(100℃，30min)提取，其中液料比为40mL/g，提取次数为4遍，过滤提取液，减压浓缩后得提取浸膏。5kg桑皮干粉得0.33kg浸膏，其中DNJ的纯度为0.141％。
方法3：桑材料经干燥粉碎处理后用0.05mol/L的稀盐酸超声波辅助(420W，30min)提取，其中液料比为40mL/g，提取次数为4遍，过滤提取液，减压浓缩后得提取浸膏。5kg桑皮干粉得0.46kg浸膏，其中DNJ的纯度为0.162％。
(二)、利用上述浸膏规模化分离桑源DNJ：可采用以下7种方法中的一种或多种：
方法1：浸膏用微波焦化处理(640W，6min)，所得粉末用水溶解，离心(2000r/min，20min)，上清液减压浓缩后得分离物I；分离物I通过体积比为2:1的“细沙-活性炭”双层色谱柱，80％的乙醇溶液洗脱，收集1～27BV，流速为1.1BV/h，洗脱液减压浓缩，再通过硅胶色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝1:3的混合溶剂洗脱，收集2～30BV，流速为0.8BV/h，洗脱液减压浓缩得分离物II；分离物II通过阳离子交换树脂柱，PH 12的氢氧化钙溶液洗脱，收集1～28BV，流速为1.1BV/h，洗脱液减压浓缩后用占浓缩液体积浓度为75％的乙醇溶液沉淀，滤去氢氧化钙等，减压浓缩后得分离物III；分离物III通过氧化铝色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝1:3的混合溶剂洗脱，收集1～41BV，流速为0.5BV/h，洗脱液减压浓缩后得分离物IV；在4℃条件下，98％的乙醇溶液结晶6h、在-20℃条件下，乙酸乙酯:乙醇＝2:1的混合溶液重结晶6h，连续重复2遍，得纯度为36.4％，样品回收率为39.3％的DNJ分离目标组分。
方法2：浸膏用微波焦化处理(800W，2min)，所得粉末用水溶解，离心(5000r/min，8min)，上清液减压浓缩后得分离物I；分离物I通过体积比为2:1的“细沙-活性炭”双层色谱柱，50％的乙醇溶液洗脱，收集2～25BV，流速为0.9BV/h，洗脱液减压浓缩，再通过硅胶色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝2:1的混合溶剂洗脱，收集2～23BV，流速为0.6BV/h，洗脱液减压 浓缩得分离物II；分离物II通过阳离子交换树脂柱，PH 11的氢氧化钙溶液洗脱，收集2～27BV，流速为0.9BV/h，洗脱液减压浓缩后用占浓缩液体积浓度为78％的乙醇溶液沉淀，滤去氢氧化钙等，减压浓缩后得分离物III；分离物III通过氧化铝色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝2:1的混合溶剂洗脱，收集1～41BV，流速为0.3BV/h，洗脱液减压浓缩后得分离物IV；在4℃条件下，98％的乙醇溶液结晶48h、在-20℃条件下，乙酸乙酯:乙醇＝7:1的混合溶液重结晶48h，连续重复4遍，得纯度为38.7％，样品回收率为32.6％的DNJ分离目标组分。
方法3：浸膏用微波焦化处理(720W，3min)，所得粉末用水溶解，离心(3000r/min，12min)，上清液减压浓缩后得分离物I；分离物I通过体积比为2:1的“细沙-活性炭”双层色谱柱，70％的乙醇溶液洗脱，收集2～20BV，流速为1.2BV/h，洗脱液减压浓缩，再通过硅胶色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝1:1的混合溶剂洗脱，收集2～16BV，流速为0.8BV/h，洗脱液减压浓缩得分离物II；分离物II通过阳离子交换树脂柱，PH 11的氢氧化钙溶液洗脱，收集3～23BV，流速为1.2BV/h，洗脱液减压浓缩后用占浓缩液体积浓度为80％的乙醇溶液沉淀，滤去氢氧化钙等，减压浓缩后得分离物III；分离物III通过氧化铝色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝1:1的混合溶剂洗脱，收集2～38BV，流速为0.6BV/h，洗脱液减压浓缩后得分离物IV；在4℃条件下，98％的乙醇溶液结晶24h、在-20℃条件下，乙酸乙酯:乙醇＝5:1的混合溶液重结晶24h，连续重复3遍，得纯度为39.1％，样品回收率为37.9％的DNJ分离目标组分。
方法4：浸膏用微波焦化处理(640W，5min)，所得粉末用水溶解，离心(4000r/min，10min)，上清液减压浓缩后得分离物I；分离物I通过体积比为2:1的“细沙-活性炭”双层色谱柱，90％的乙醇溶液洗脱，收集1～30BV，流速为1.6BV/h，洗脱液减压浓缩，再通过硅胶色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝2:3的混合溶剂洗脱，收集1～30BV，流速为1.3BV/h，洗脱液减压浓缩得分离物II；分离物II通过阳离子交换树脂柱，PH 11的氢氧化钙溶液洗脱，收集1～30BV，流速为1.6BV/h，洗脱液减压浓缩后用占浓缩液体积浓度为70％的乙醇溶液沉淀，滤去氢氧化钙等，减压浓缩后得分离物III；分离物III通过氧化铝色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝2:3的混合溶剂洗脱，收集1～50BV，流速为0.8BV/h，洗脱液减压浓缩后得分离物IV；在4℃条件下，98％的乙醇溶液结晶12h、在-20℃条件下，乙酸乙酯:乙醇＝2:1的混合溶液重结晶12h，连续重复5遍，得纯度为35.0％，样品回收率为38.2％的DNJ分离目标组分。
方法5：浸膏用微波焦化处理(800W，5min)，所得粉末用水溶解，离心(2000r/min，18min)，上清液减压浓缩后得分离物I；分离物I通过体积比为2:1的“细沙-活性炭”双层色谱柱，60％的乙醇溶液洗脱，收集2～26BV，流速为1.0BV/h，洗脱液减压浓缩，再通过硅胶色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝4:3的混合溶剂洗脱，收集2～28BV，流速为1.1BV/h，洗脱液减 压浓缩得分离物II；分离物II通过阳离子交换树脂柱，PH 10的氢氧化钙溶液洗脱，收集2～28BV，流速为1.2BV/h，洗脱液减压浓缩后用占浓缩液体积浓度为75％的乙醇溶液沉淀，滤去氢氧化钙等，减压浓缩后得分离物III；分离物III通过氧化铝色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝5:3的混合溶剂洗脱，收集2～43BV，流速为0.6BV/h，洗脱液减压浓缩后得分离物IV；在4℃条件下，98％的乙醇溶液结晶36h、在-20℃条件下，乙酸乙酯:乙醇＝4:1的混合溶液重结晶36h，连续重复3遍，得纯度为37.1％，样品回收率为35.5％的DNJ分离目标组分。
方法6：浸膏用微波焦化处理(800W，4min)，所得粉末用水溶解，离心(3000r/min，16min)，上清液减压浓缩后得分离物I；分离物I通过体积比为2:1的“细沙-活性炭”双层色谱柱，60％的乙醇溶液洗脱，收集2～26BV，流速为1.4BV/h，洗脱液减压浓缩，再通过硅胶色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝1:1的混合溶剂洗脱，收集2～28BV，流速为0.5BV/h，洗脱液减压浓缩得分离物II；分离物II通过阳离子交换树脂柱，PH 10的氢氧化钙溶液洗脱，收集2～26BV，流速为1.4BV/h，洗脱液减压浓缩后用占浓缩液体积浓度为74％的乙醇溶液沉淀，滤去氢氧化钙等，减压浓缩后得分离物III；分离物III通过氧化铝色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝4:3的混合溶剂洗脱，收集2～44BV，流速为0.5BV/h，洗脱液减压浓缩后得分离物IV；在4℃条件下，98％的乙醇溶液结晶40h、在-20℃条件下，乙酸乙酯:乙醇＝6:1的混合溶液重结晶40h，连续重复4遍，得纯度为38.0％，样品回收率为34.3％的DNJ分离目标组分。
方法7：浸膏用微波焦化处理(720W，4min)，所得粉末用水溶解，离心(4000r/min，12min)，上清液减压浓缩后得分离物I；分离物I通过体积比为2:1的“细沙-活性炭”双层色谱柱，80％的乙醇溶液洗脱，收集2～30BV，流速为1.3BV/h，洗脱液减压浓缩，再通过硅胶色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝5:3的混合溶剂洗脱，收集2～27BV，流速为0.9BV/h，洗脱液减压浓缩得分离物II；分离物II通过阳离子交换树脂柱，PH 12的氢氧化钙溶液洗脱，收集2～30BV，流速为1.3BV/h，洗脱液减压浓缩后用占浓缩液体积浓度为85％的乙醇溶液沉淀，滤去氢氧化钙等，减压浓缩后得分离物III；分离物III通过氧化铝色谱柱，乙酸乙酯:乙醇＝1:1的混合溶剂洗脱，收集2～40BV，流速为0.4BV/h，洗脱液减压浓缩后得分离物IV；在4℃条件下，98％的乙醇溶液结晶15h、在-20℃条件下，乙酸乙酯:乙醇＝3:1的混合溶液重结晶15h，连续重复3遍，得得纯度为37.2％，样品回收率为36.7％的DNJ分离目标组分。
(三)、利用上述分离目标组分酯化修饰及制备纳米混悬剂：可采用下述6种方法中的一种或多种：
方法1：将离子液体氯化1-丁基-3-甲基咪唑(0.25mol)，分离目标组分(约含DNJ 0.05mol)，庚酸酐(0.40mol)和十八水硫酸铝(2.0g)依次加入反应釜中，80℃、转速300r/min条件下 反应18h。用乙酸乙酯洗涤离子液体，分层后取上层液，用饱和碳酸钠调至中性，得酯化目标组分(转化率63.2％，选择性100％)，离子液体减压蒸馏干燥后重复使用。搅拌下配制含质量分数为0.2％甘露醇、0.5％乳糖、0.5％葡萄糖和0.3％羧甲基纤维素钠的水溶液，得溶液A。将十二烷基硫酸钠按质量比0.5％溶解于溶液A，得溶液B。含1.25％DNJ的酯化目标组分与溶液B按体积比1:1混合，用功率140W超声波处理45min，减压蒸去有机溶剂。转移到超微粉纳米碎机2900rpm碾磨45min，得平均粒径为345nm混悬液。冷冻干燥后得其干燥品。
方法2：将离子液体氯化1-丁基-3-甲基咪唑(0.55mol)，分离目标组分(约含DNJ 0.05mol)，丙酸酐(0.40mol)十八水硫酸铝(4.4g)依次加入反应釜中，160℃、转速500r/min条件下反应6h。用乙酸乙酯洗涤离子液体，分层后取上层液，用饱和碳酸钠调至中性，得酯化目标组分(转化率75.3％，选择性100％)，离子液体减压蒸馏干燥后重复使用。搅拌下配制含质量分数为3％聚乙二醇400、2％乳糖、2％葡萄糖和4％羧甲基纤维素钠的水溶液，得溶液A。将吐温80按质量比1.2％溶解于溶液A，得溶液B。含1.1％DNJ的酯化目标组分与溶液B按体积比1:1混合，用功率280W超声波处理15min，减压蒸去有机溶剂。转移到超微粉纳米碎机2900rpm碾磨52min，得平均粒径为270nm混悬液。冷冻干燥后得其干燥品。
方法3：将离子液体氯化1-丁基-3-甲基咪唑(1.0mol)，分离目标组分(约含DNJ 0.05mol)，戊酸酐(0.40mol)和十八水硫酸铝(8.0g)依次加入反应釜中，100℃、转速300r/min条件下反应9h。用乙酸乙酯洗涤离子液体，分层后取上层液，用饱和碳酸钠调至中性，得酯化目标组分(转化率80.1％，选择性100％)，离子液体减压蒸馏干燥后重复使用。搅拌下配制含质量分数为1.6％甘露醇、0.7％乳糖、0.7％葡萄糖和2.8％羧甲基纤维素钠的水溶液，得溶液A。将三乙酸甘油酯按质量比2.4％溶解于溶液A，得溶液B。含1.0％DNJ的酯化目标组分与溶液B按体积比1:1混合，用功率140W超声波处理45min，减压蒸去有机溶剂。转移到高压均质机内，500bar、1000bar、1500bar压力下各循环5次，得平均粒径为380nm混悬液。冷冻干燥后得其干燥品。
方法4：将离子液体氯化1-丁基-3-甲基咪唑(0.7mol)，分离目标组分(约含DNJ 0.05mol)，丁酸酐(0.40mol)和十八水硫酸铝(5.6g)依次加入反应釜中，120℃、转速400r/min条件下反应12h。用乙酸乙酯洗涤离子液体，分层后取上层液，用饱和碳酸钠调至中性，得酯化目标组分(转化率87.3％，选择性100％)，离子液体减压蒸馏干燥后重复使用。搅拌下配制质量分数为1.2％聚乙二醇400、1.5％乳糖、1.5％葡萄糖和3％羧甲基纤维素钠的水溶液，得溶液A。将聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯按质量比2％溶解于溶液A，得溶液B。含 0.83％DNJ的酯化目标组分与溶液B按体积比1:1混合，用功率210W超声波处理30min，减压蒸去有机溶剂。转移到高压均质机内，500bar、1000bar、1500bar压力下各循环l0次，得平均粒径为180nm混悬液。冷冻干燥后得其干燥品。
方法5：将离子液体氯化1-丁基-3-甲基咪唑(0.85mol)，分离目标组分(约含DNJ 0.05mol)，乙酸酐(0.40mol)和十八水硫酸铝(6.8g)依次加入反应釜中，160℃、转速500r/min条件下反应15h。用乙酸乙酯洗涤离子液体，分层后取上层液，用饱和碳酸钠调至中性，得酯化目标组分(转化率81.8％，选择性100％)，离子液体减压蒸馏干燥后重复使用。搅拌下配制含质量分数为2％聚乙二醇400、1.2％乳糖、1.2％葡萄糖和1.6％羧甲基纤维素钠的水溶液，得溶液A。将卵磷脂按质量比5％溶解于溶液A，得溶液B。含0.91％DNJ的酯化目标组分与溶液B按体积比1:1混合，用功率210W超声波处理30min，减压蒸去有机溶剂。转移到超微粉纳米碎机2900rpm碾磨60min，得平均粒径为300nm混悬液。冷冻干燥后得其干燥品。
方法6：将离子液体氯化1-丁基-3-甲基咪唑(0.4mol)，DNJ标准品(0.05mol)，己酸酐(0.40mol)和十八水硫酸铝(3.2g)依次加入反应釜中，130℃、转速400r/min条件下反应9h。用乙酸乙酯洗涤离子液体，分层后取上层液，用饱和碳酸钠调至中性，得酯化目标组分(转化率70.4％，选择性100％)，离子液体减压蒸馏干燥后重复使用。搅拌下配制含质量分数为2％甘露醇、1％乳糖、1％葡萄糖和5％羧甲基纤维素钠的水溶液，得溶液A。将泊洛沙姆188按质量比2％溶解于溶液A，得溶液B。含0.70％DNJ的酯化目标组分与溶液B按体积比1:1混合，用功率280W超声波处理15min，减压蒸去有机溶剂。转移到高压均质机内，500bar、1000bar、1500bar压力下各循环7次，得平均粒径为210nm混悬液。冷冻干燥后得其干燥品。
备注：在分离DNJ及制备DNJ纳米混悬剂的过程中，几乎各步都要检测DNJ的含量以确定后续步骤的操作程序和得出产率、浓度等结果；本发明采用下述方法检测DNJ的含量：
步骤1：DNJ衍生化步骤为：
将30μL DNJ标准品溶液或提取液与30μL 0.4mol/L的硼酸钾缓冲液(pH 8.5)混合于0.5mL离心管中，加入60μL 5mmol/L的FMOC-Cl，25℃条件下水浴20min，加30μL 1mol/L的甘氨酸终止反应。用30μL 0.1％(v/v)乙酸溶液稳定新生成的DNJ-FMOC，以120μL蒸馏水定容。最后过0.22μm尼龙滤膜，待测。
步骤2：HPLC检测：
利用HPLC检测步骤1的待测样品，检测用反相5μm C18(4.6×150mm)色谱柱(Waters,Atlantis,Ireland)，流动相为乙腈：0.1％醋酸的体积比为55:45，流速1mL/min，柱温30℃， 检测波长254nm，进样量10μL，每个样品3个重复。
需要说明的是，步骤(一)、(二)即构成本发明分离DNJ方法的技术方案，步骤(一)、(二)、(三)构成本发明制备DNJ纳米混悬剂的方法的技术方案，但是步骤(3)的DNJ来源不限于步骤(一)、(二)方法所制得的DNJ目标组分，也可以是其他方法所制得的DNJ。另外需要说明的是，上述实施例中，步骤(一)包括3种具体的制程，步骤(二)包括7中具体制程，步骤(三)包括6种具体的制程，实施例1中制备DNJ纳米混悬剂的方法可以是上述三个步骤的任意组合。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。