一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针.pdf

摘要
申请专利号：	CN201310365333.X	申请日：	2013.08.21
公开号：	CN104416152A	公开日：	2015.03.18
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):B22F1/00申请日:20130821\|\|\|公开
IPC分类号：	B22F1/00; B22F1/02; B22F9/24; C09K11/02; C12Q1/02; G01N21/64; A61K41/00; A61K9/14; A61P35/00; B82Y30/00(2011.01)I; B82Y40/00(2011.01)I	主分类号：	B22F1/00
申请人：	安徽医科大学第一附属医院
发明人：	蒋童童; 朱立新; 许小亮
地址：	230022安徽省合肥市安徽医科大学第一附属医院中心实验室
优先权：
专利代理机构：	北京维澳专利代理有限公司11252	代理人：	吉海莲; 王立民
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内容摘要

本发明提供了本发明提供了一种金纳米花结构及其制备方法，所述金纳米花结构是用金八面体、金球或金四面体作为籽晶，在高浓度聚乙烯吡咯烷酮的环境中，用弱还原剂还原氯金酸得到周侧均布有圆头柱状体的金纳米花颗粒。另外，本发明还提供了一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针及其制备方法和应用。相对于传统的探针，此探针是集光热治疗与荧光标记于一身的探针，可以有效地定向杀死癌细胞，采用两种光源分别实现巨大的光热转化效率和量子点的荧光强度的较大增强，巧妙避开了两种效应的互相干涉。二氧化硅的包覆使得金纳米花和量子点的生物毒性被有效避免了，使得复合探针的表面易功能化，具有非常好的生物相容性。

权利要求书

权利要求书
1.  一种金纳米花结构，其特征在于，所述金纳米花结构是用金八面体、金球或金四面体作为籽晶，在高浓度聚乙烯吡咯烷酮的环境中，用弱还原剂还原氯金酸得到周侧均布有圆头柱状体的金纳米颗粒。

2.  根据权利要求1所述的金纳米花结构，其特征在于，所述金纳米花的直径为45-150nm，枝长为10-30nm。

3.  一种制备所述金纳米花的方法，其步骤如下：
（1）使用NaBH4还原氯金酸的方式得到金籽晶溶液，再用还原剂还原长成较大的金纳米球，接着在金球的基础上生长金八面体、金球或金四面体；
（2）用步骤（1）得到的金八面体、金球或金四面体作为籽晶，在高浓度PVP的环境中，用弱还原剂还原氯金酸得到金纳米花；通过改变PVP的浓度，氯金酸量及金籽晶量、金籽晶种类，从而得到不同尺寸不同枝长的菊花状金纳米颗粒。

4.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述NaBH4和氯金酸的混合溶液的还包括老化的步骤，其老化温度为27度到32度之间，老化时间为3小时以上。

5.  根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述NaBH4与氯金酸的摩尔比为6-24:2-10；步骤（1）中所述还原剂为抗坏血酸。

6.  根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述高浓度PVP环境是指浓度为4-10mM的聚乙烯吡咯烷酮溶液;步骤（2）中所述弱还原剂为N,N-二甲基甲酰胺；步骤（2）中所述氯金酸和金籽晶溶液体积比为1:1～1:30。

7.  一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针，其特征在于，其包含权利要求1或2所述的金纳米花结构。

8.  根据权利要求7所述的复合探针，其特征在于，其由内至外依次包括所述金纳米花、二氧化硅纳米壳层、量子点和二氧化硅纳米壳层；其是在制备好的金纳米花基础上，利用水解的方式在金纳米花外包裹二氧化硅层，形成包裹有金纳米花的二氧化硅球；然后通过对二氧化硅的表面进行修饰将量子点链接在二氧化硅球表面，形成内包裹有金纳米花、外链接有量子点的二氧化硅球复合材料；最后在复合材料表面再包裹一层二氧化硅纳米壳层。

9.  一种制备权利要求7或8所述用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针的方法，其步骤如下：
（1）制备金纳米花；
（2）金纳米花@二氧化硅@量子点复合材料的制备：
先将步骤（1）所得金纳米花离心洗涤后溶解在乙醇、水和氨水的混合液中超声，然后将正硅酸四乙酯的酒精溶液逐滴加到反应溶液中进行二氧化硅球壳对金纳米花的包覆，反应12小时后进行离心洗涤，形成金纳米花和二氧化硅的复合结构；
用上述结构进行表面修饰，然后将带有羧基的水溶性荧光量子点加入到修饰过的金纳米花和二氧化硅的复合结构中，使其反应24小时，然后离心并分散在乙醇中，得金纳米花@二氧化硅@量子点复合材料乙醇溶液；
（3）金纳米花@二氧化硅@量子点复合探针的制备：
向步骤（2）中制备好的复合材料中加入氨水超声，再逐滴加入正硅酸四乙酯的水溶液，室温下搅拌反应24小时，离心洗涤；用各种硅烷偶联剂进行修饰，使其表面带有不同的修饰基团，最终得所述复合探针。

10.  权利要求7或8所述金纳米花@二氧化硅@量子点荧光/光热复合纳米探针在生物靶向中的应用。

说明书

说明书一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针
技术领域
本发明涉及复合纳米探针技术领域，具体涉及一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针。
背景技术
量子点是由少量的原子所人工合成的纳米材料，又被称为“人造原子”，受激发后可以发出荧光，改变量子点的结构，可随意调节其激发和发射荧光波长，在接上特异性抗体后，用以标记及定位靶细胞，并在细胞中长期保持其物化与发光稳定性。用量子点取代传统的染料作为荧光标记体，可以克服染料分子大（因而需要在细胞上打洞、不能做活体标记）、光化学稳定性及光谱特性差等缺点，从而用于细胞的免疫荧光标记。其中近红外量子点发出的近红外光被组织吸收很少，从而用于活体内的细胞的免疫荧光标记。
光热治疗是一种利用纳米金属光热材料吸收近红外光（近红外波段是透过人体血液和软组织的窗口，近红外光可以透过人体皮肤进入深组织），通过等离子激元共振和非辐射能级跃迁的过程产生声子（即热能）、导致局部高温，从而使癌细胞凋亡的治疗手段。将供热的金属纳米颗粒通过细胞吞噬或特异性抗体靶向链接癌细胞，通过激光束的激励，使肿瘤尺寸萎缩。研究显示，纳米光热材料的构型对其产生光热效应的阈值（通常以每平方厘米瓦计算，即W/cm2）以及温度直接相关，阈值越低及升温速度越快，癌细胞的活性越能被有效地停止、同时对正常机体的损伤愈小。近十年来，光热材料经历了金纳米球（激发阈值200W/cm2）、金纳米棒（160W/cm2）、金纳米壳（10W/cm2）、金纳米笼（2W/cm2）、金纳米星（1.8W/cm2）等各种金纳米构型。
基于金纳米颗粒在局域表面等离子共振区域大的吸收截面，使其成为产生热的良好材料。而荧光量子点具有较宽的激发带和较窄的发射带，使其成为了医学上示踪的良好的材料。把两者的优良性质结合在一起，制备一种纳米光热荧光复合探针，实现治疗与诊断模式的联合成为一种新型课题。一般光热材料具有较大的吸收截面，场增强效应较弱。易导致量子点的荧光减弱。专利号为201310117034.4、名称为“一种具有光热及荧光增强双功能的金纳米星@量子点复合型细胞探针及其制备方法和应用”的专利，公开的复合探针虽然具备光热转换及荧光增强双功能，然而由于下述3各方面的原因，还需要做一些改进，使之更适用于活体内的光热-荧光复合标记：（1）由于金纳米星尖刺的数目较少、各尖刺长度不易控制一致性，造成它的吸收光谱宽度很大、与近红外量子点的吸收谱重叠，这样在激发量子点发光（即做荧光示踪）时也会产生一些光热效应，对近红外发光的亮度产生一定的影响（但对波长短于橙色的光有增强效应，故适用于浅表肿瘤的标记）；（2）金纳米星的光热阈值为1.8W/cm2左右，还有进一步减少的空间；（3）由于金纳米星的尖刺较长，使得在链接量子点和包覆SiO2、制备复合探针时，不易控制复合探针的直径使之小于100nm，故而在对做活体细胞的标记产生一定程度的负面影响。
发明内容
为了实现对量子点的荧光增强，用以细胞的荧光示踪，进而通过光热转换作用实现对癌细胞靶向治疗。本发明的目的是提供一种金纳米花结构及其制备方法。
本发明的另一目的是提供一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针金及其制备方法。
首先，本发明是在各种金纳米结构的基础上做了改进，制备了金纳米花结构，所述金纳米花结构是用金八面体、金球或金四面体作为籽晶，在高浓度PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的环境中，用弱还原剂还原氯金酸得到周侧均布有圆头柱状体的金纳米颗粒，即像菊花状金纳米花。
优选的，所述金纳米花的直径为45-150nm，枝长为10-30nm。
本发明制备的纳米花是利用表面活性剂修饰生成纳米颗粒。其由于有表面活性剂的包裹生成的颗粒具有较高的稳定性能够长时间的保存，且在水和酒精溶液中具有很好的稳定性。
相比于金纳米星上的尖刺，本发明制备的纳米花瓣数目较多、长度较为一致，这样：（1）它的吸收光谱可以控制得较窄、且与近红外量子点的吸收谱不重叠，荧光的亮度没有衰减，反而由于金纳米花同时具备荧光增强效应，使得近红外量子点的发光强度增强了35%；（2）光热阈值进一步减小到1.2W/cm2左右；（3）由于金纳米花瓣长度较短，使得在链接量子点和包覆SiO2、制备复合探针时，易控制复合探针的直径使之小于100nm，故而适用于做活体细胞的标记。本发明制备的不同尺度的纳米花如图8所示。
一般来说，在荧光增强效应中，对金属纳米结构的等离子激元共振与荧光物质的吸收和发射的光谱重叠的控制被认为是非常重要的。另外，当入射光的频率和金属纳米结构的内在频率耦合时。局域表面等离子激元共振的现象将会出现。共振激发将会导致强烈局域的电场。它可以导致吸收和激发速率戏剧化的增加。金属颗粒的等离子共振(SPR)峰依靠很多因素，如材料、尺寸、形貌。纳米花结构有两个SPR峰，其中一个在500纳米到650纳米之间，这个与近红外量子点的激发峰很好匹配。可有效地增强量子点荧光。另一个可以调到700纳米到红外（如常用的808纳米），有助于进行体内的光热治疗。如果用于体外细胞株荧光显色，则可以接发射不同可见光的量子点（如470纳米蓝光、530纳米绿光、580纳米黄光），这些量子点的激发波长可统一用单一紫外光激发（不需要像染料那样必须用指定的波长激发单一的光发射），其发射强度没有减弱现象。
进一步地，本发明提供了一种制备所述金纳米花的方法，其包括如下具体步骤：
（1）使用NaBH4还原氯金酸的方式得到金籽晶溶液，再用还原剂还原长成较大的金纳米球、金八面体或金四面体；
（2）用步骤（1）得到的金八面体、金球或金四面体作为籽晶，在高浓度 PVP的环境中，用弱还原剂还原氯金酸得到金纳米花；通过改变PVP的浓度，氯金酸量及金籽晶量、金籽晶种类，从而得到不同尺寸不同枝长的菊花状金纳米颗粒。
优选的，所述NaBH4和氯金酸的混合溶液的还包括老化的步骤，其老化温度为27度到32度之间，老化时间为3小时以上。
优选的，步骤（1）中所述NaBH4与氯金酸的摩尔比为6-24:2-10。
优选的，步骤（1）中所述还原剂为抗坏血酸。
优选的，步骤（2）中所述高浓度PVP环境是指浓度为4-10mM的聚乙烯吡咯烷酮溶液。
优选的，步骤（2）中所述弱还原剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述氯金酸和金籽晶的溶液体积比为1:1～1:30。如，在本发明一优选实施例中，所述氯金酸量100-500uL,24.28mM；金籽晶量100-3000uL，0.1mM；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）10-30mL以及PVP（固体粉末)用量4-10mM。
另一方面，本发明提供了一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针，其包括所述金纳米花结构。
本实施例中，该探针由内至外依次包括所述金纳米花、二氧化硅纳米壳层、量子点和二氧化硅纳米壳层；其是在制备好的金纳米花基础上，利用水解的方式在金纳米花外包裹二氧化硅层，形成包裹有金纳米花的二氧化硅球；然后通过对二氧化硅的表面进行修饰将量子点链接在二氧化硅球表面，形成内包裹有金纳米花、外链接有量子点的二氧化硅球复合材料；最后在复合材料表面再包裹一层二氧化硅纳米壳层。
进一步地，本发明还提供了一种制备所述复合探针的方法，其包括如下具体步骤：
（1）制备所述金纳米花；
（2）金纳米花@二氧化硅@量子点复合材料的制备：
先将步骤（1）所得金纳米花离心洗涤后溶解在乙醇、水和氨水的混合液中超声，然后将正硅酸四乙酯的酒精溶液逐滴加到反应溶液中进行二氧化硅球壳对金纳米花的包覆，反应12小时后进行离心洗涤，形成金纳米花和二氧化硅的复合结构；
用上述结构进行表面修饰，然后将带有羧基的水溶性荧光量子点加入到修饰过的金纳米花和二氧化硅的复合结构中，使其反应24小时，然后离心并分散在乙醇中，得金纳米花@二氧化硅@量子点复合材料乙醇溶液；
（3）金纳米花@二氧化硅@量子点复合探针的制备：
向步骤（2）中制备好的复合材料中加入氨水超声，再逐滴加入正硅酸四乙酯的水溶液，室温下搅拌反应24小时，离心洗涤；用各种硅烷偶联剂进行修饰，使其表面带有不同的修饰基团，最终得所述复合探针，具体合成的流程图请参见图1。
优选的，步骤（2）中所述正硅酸四乙酯酒精溶液的体积浓度为1%；所述乙醇、水、正硅酸四乙酯酒精溶液和氨水的体积比为10-40：2-10:0.4-1：0.2-1；所述金纳米花与上述混合溶液的体积比为0.1-1:5-20。
优选的，步骤（2）所述修饰剂为3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS）或氨丙基三乙氧基硅烷；所述修饰剂用量可以适当多点，后来多余的通过洗涤就洗去了，一般在全部制备好的颗粒时加入200-3000微升。
优选的，所述荧光量子点为CdTeS、CdTe、CdSe、Mn-doped ZnS、CdS或CdTe/CdS/ZnS，摩尔数为0.05-1.0mM。
优选的，所述硅烷偶联剂为乙烯基硅烷偶联剂、氨基硅烷偶联剂、环氧基硅烷偶联剂、甲基丙烯酰氧基硅烷偶联剂、巯基硅烷偶联剂或脲基硅烷偶联剂。所述硅烷偶联剂的用量应适当多加，后来多余的洗掉，一般在全部制备好的颗粒时加入150-4000微升，优选为200-300微升。
更进一步地，本发明提供了所述复合型细胞探针在生物靶向中的应用。具体为将多种生物分子连接在该复合型细胞探针表面各种修饰基团上，以完成靶向标记的作用。所述生物分子优选为抗体、链霉亲和素、DNA片段、生物配体、阳离子多肽等。可以根据需要链接不同的抗体，以标记细胞中的不同亚细胞器官。比如链接单一抗体ck-19,可以特异性示踪乳腺癌通过淋巴的微转移；也可对多种生物指标进行多色量子点同时标记。
本发明优点和积极效果如下：
相对于传统的探针，此探针是集光热治疗与荧光标记于一身的探针，可以有效地定向杀死癌细胞，采用两种光源分别实现巨大的光热转化效率和量子点的荧光强度的较大增强，巧妙避开了两种效应的互相干涉。二氧化硅的包覆使得金纳米花和量子点的生物毒性被有效避免了，使得复合探针的表面易功能化，具有非常好的生物相容性。
（1）利用金纳米花800nm处的等离子激元与808纳米的激光进行匹配实现非常高的光热转换效率，其光热转化阈值低于1.5W/cm2，可以有效地杀伤癌细胞同时保护正常细胞不受伤害，通过在复合纳米探针表面链接抗体可以实现对癌细胞的靶向治疗。
（2）在复合纳米探针中，可以利用金纳米花600多纳米处的局域等离激元（LSP）诱导的局域电磁场实现了对近红外量子点（630-700nm）的辐射速率的增强，进而增强其发射的荧光强度。较好地对活体内癌细胞进行标记，对其转移进行示踪。如果用于体外细胞株的亚细胞器官的荧光显色，则可以接不同可见光量子点（如470纳米蓝光、530纳米绿光、580纳米黄光或620纳米红光），这些量子点的激发可用一种波长紫外光激发（不需要像染料那样每一种都要用特定波长激发），其发射强度没有减弱现象。
（3）相对于传统的光热探针和量子点荧光探针，用二氧化硅作为屏障。使探针不是直接地裸露在生物体或细胞中。屏蔽了其毒性。同时对二氧化硅的表面进行功能化。实现了其靶向标记作用。
附图说明
本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1.金纳米花@量子点光热荧光复合型探针的合成流程示意图。
图2.实施例4金纳米花@量子点光热荧光复合型探针的透射电子显微镜(TEM)图。
图3.实施例1-5中制备的复合探针的吸收光谱，其峰值为建议之产生光热效应的激发波长。
图4.（a）金纳米花@量子点复合探针的荧光与相同量量子点的发射光谱之比较，可见量子点发光峰在650nm，发光增强35%；（b）金纳米星@量子点复合探针的荧光与相同量量子点的荧光谱之比较，量子点发光峰在575nm，发光增强26%。
图5.实施例4制成的复合探针溶液及对照组（水溶液）的升温曲线（808nm激发光功率密度：1.2W/cm2）。
图6.实施例4制成的复合探针（链接CK-19抗体）对乳腺癌细胞的光热疗效（细胞中间黑的小泡为死细胞）（808nm激发光功率密度：1.2W/cm2）。
图7.实施例4制成的808nm激发光（功率密度：1.2W/cm2，照射10分钟）对(a)不接探针与(b)接复合探针（链接CK-19抗体）的乳腺癌细胞SK-BR-3的光热疗效之比较。
图8.改变氯金酸（24.28mM）的量和籽晶的量得到的几种不同尺寸的纳米花。两者的体积比为(a)1:16，(b)3:40，(c)3:32，(d)1:8，(e)3:16，以及(f)3:8。(a)-(e)分别对应实施例1-5中制备的纳米花。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
化学药品：
氯金酸，N,N-二甲基甲酰胺(DMF,AR)，聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW=55000,AR），聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW=1000,AR），溴化十六烷基三甲铵（CTAB,AR），氯化十六烷基三甲基铵（CTAC,AR），抗坏血酸（AA,AR）。硼氢化钠（NaBH4,AR）正硅酸四乙酯（TEOS,AR），氨水(25%NH3,AR)，无水乙醇(AR)，以上为向国药集团化学试剂有限公司购买药品。3-巯丙基三甲氧基硅烷（MPTMS，sigma,AR），3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS，sigma，AR）、几种不同的量子点（CdTe,CdTe@CdS,CdTeS等）的制备方法见参考文献（[1]Sander F.Wuister,Ingmar Swart,Floris van Driel,Stephen G.Hickey,and Celso de Mello Donega Nano Lett.,3(2003)504；[2]Hui Peng,Lijuan Zhang,Christian Soeller,Jadranka Travas-Sejdic Journal of Luminescence127(2007)721–726[3]Weiyong Mao,JiaGuo,WuLiYang,Changchun Wang,Jia He and Jiyao Chen Nanotechnology18(2007)485611）。
实施例1：
（1）将0.6mL10mM冰浴的NaBH4加入到10mL包含0.85mM HAuCl4和0.1M CTAB的水溶液中，溶液在29摄氏度下老化至少3小时。生成小的金球。
（2）6mL0.5mM的HAuCl4溶液、6mL0.2M CTAC和4.5mL0.1M AA混合后加入0.3mL（1）中已制备的籽晶。离心溶于1mL水中。得到较大的金球。
（3）将5.8mL DMF(包括0.43mM PVP（MW=55000）)和40uL HAuCl4（24.28mM）加入小瓶，然后加入200uL步骤（2）中的籽晶，在80摄氏度下搅拌1小时，得到生长金纳米花的籽晶，籽晶形状尺寸如图8(a)所示。
（4）15mL9M PVP的DMF溶液，加入150uL HAuCl4，2400uL步骤（3）制备的籽晶加入搅拌几小时等反应完全。将生成的金纳米花离心溶于酒精溶液中。以本发明得到的纳米花的形状与吸收谱的关系做了一个图（如图3所示），说明激发波长受形状的调控。本身产生光热效应的激发波长可参考图3中左一曲线，为670nm。
（5）在40mL酒精，8mL水，0.8mL氨水溶液中加入（4）中的产物超声，加入1.6mL1％TEOS的酒精溶液。12小时后离心溶液酒精中。生成金纳米花@二氧化硅的复合物；然后将200uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS）对二氧化硅的表面进行功能化修饰，然后将2mL带羧基的CdTeS量子点加入。反应24小时，然后离心分散于酒精中。
（6）20mL酒精，4mL水，0.8mL氨水混合，向其中加入（5）中酒精溶液，逐滴加入400微升1%的TEOS的酒精溶液，反应24小时后，使用200uL的MPTMS、APTMS等对复合结构表面进行修饰使其表面带有巯基基团、氨基基团。进而可以将探针转移到特定的目标位置。本例复合探针尺度为65纳米，形状与图2金纳米花@量子点光热荧光复合型探针的透射电子显微镜(TEM)图一致，只是产生光热效应的波长有所区别，分别应用于不同场合（体内、体外）。复合探针溶液及对照组（水溶液）的升温曲线与图5大致相同，只是产生光热效应的激发波长有所区别，分别应用于不同场合（体内、体外）。
各个实施例中制备的探针，其形状即图8(a)-(e)（对应实施例1-5）表示的纳米花包覆SiO2所成，各自的光谱对应于图3，适用于波长不同的（600-900nm）激光器激发，各用户可根据自己的条件加以选择。比如考虑到808nm激光的通用性以及在活体中具有良好的穿透性，当金纳米花的其中一个吸收峰在808纳米时（见实施例3），与激光器的发射波长达成共振，光热效果最好。其它各实施例分析与此相同。
实施例2：
（1）将0.6mL10mM冰浴的NaBH4加入到10mL包含1.5mM HAuCl4和0.1M CTAB的水溶液中，溶液在29摄氏度下老化至少3小时。生成小的金球。
（2）6mL0.5mM的HAuCl4溶液、6mL0.2M CTAC和4.5mL0.1M AA混合后加入0.3mL（1）中已制备的籽晶。离心溶于1mL水中。得到较大的金球。
（3）将5.8mL DMF(包括0.43mM PVP（MW=55000）)和40uL HAuCl4（24.28mM）加入小瓶，然后加入200uL（2）中的籽晶，在80度下搅拌1小时。得到生长金纳米花的籽晶。籽晶形状尺寸如图8(b)所示。
（4）15mL9M PVP的DMF溶液，加入180uL HAuCl4，2400uL（3）制备的籽晶加入搅拌几小时等反应完全。将生成的金纳米花离心溶于酒精溶液中。本身产生光热效应的激发波长可参考图3中左二曲线，为780nm。
（5）在40mL酒精，8mL水，0.8mL氨水溶液中加入（4）中的产物超声，加入1.6mL1％TEOS的酒精溶液。12小时后离心溶液酒精中。生成金纳米花@二氧化硅的复合物；然后将200uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS）对二氧化硅的表面进行功能化修饰，然后将2mL带羧基的CdTeS量子点加入。反应24小时，然后离心分散于酒精中。
（6）20mL酒精，4mL水，0.8mL氨水混合，向其中加入（5）中酒精溶液，逐滴加入400微升1%的TEOS的酒精溶液，反应24小时后，使用200uL的MPTMS、APTMS等对复合结构表面进行修饰使其表面带有巯基基团、氨基基团。进而可以将探针转移到特定的目标位置。本例复合探针尺度为75纳米，形状与图2一致，只是产生光热效应的波长有所区别，分别应用于不同场合（体内、体外）。复合探针溶液及对照组（水溶液）的升温曲线与图5大致相同，只是产生光热效应的激发波长有所区别，分别应用于不同场合（体内、体外）。
实施例3：
（1）将0.6mL10mM冰浴的NaBH4加入到10mL包含3mM HAuCl4和0.1M CTAB的水溶液中，溶液在29摄氏度下老化至少3小时。生成小的金球。
（2）6mL0.5mM的HAuCl4溶液、6mL0.2M CTAC和4.5mL0.1M AA混合后加入0.3mL（1）中已制备的籽晶。离心溶于1mL水中。得到较大的金球。
（3）将5.8mL DMF(包括0.43mM PVP（MW=55000）)和40uL HAuCl4（24.28mM）加入小瓶，然后加入200uL（2）中的籽晶，在80度下搅拌1小时。得到生长金纳米花的籽晶。籽晶形状尺寸如图8(c)所示。
（4）15mL9M PVP的DMF溶液，加入180uL HAuCl4，1920uL籽晶加入搅拌几小时等反应完全。将生成的金纳米花离心溶于酒精溶液中。本身产生光热效应的激发波长可参考图3中左三曲线，为808nm。
（5）在40mL酒精，8mL水，0.8mL氨水溶液中加入（4）中的产物超声，加入1.6mL1％TEOS的酒精溶液。12小时后离心溶液酒精中。生成金纳米花@二氧化硅的复合物；然后将200uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS）对二氧化硅的表面进行功能化修饰，然后将2mL带羧基的CdTeS量子点加入。反应24小时，然后离心分散于酒精中。
（6）20mL酒精，4mL水，0.8mL氨水混合，向其中加入（5）中酒精溶液，逐滴加入400微升1%的TEOS的酒精溶液，反应24小时后，使用200uL的MPTMS、APTMS等对复合结构表面进行修饰使其表面带有巯基基团、氨基基团。进而可以将探针转移到特定的目标。本例复合探针尺度为85纳米，形状与图2一致，只是产生光热效应的波长有所区别，分别应用于不同场合。复合探针溶液及对照组（水溶液）的升温曲线与图5一致。
实施例4：
（1）将0.6mL10mM冰浴的NaBH4加入到10mL包含4mM HAuCl4和0.1M CTAB的水溶液中，溶液在29摄氏度下老化至少3小时。生成小的金球。
（2）6mL0.5mM的HAuCl4溶液、6mL0.2M CTAC和4.5mL0.1M AA混合后加入0.3mL（1）中已制备的籽晶。离心溶于1mL水中。得到较大的金球。
（3）将5.8mL DMF(包括0.43mM PVP（MW=55000）)和40uL HAuCl4（24.28mM）加入小瓶，然后加入200uL（2）中的籽晶，在80度下搅拌1小时。得到生长金纳米花的籽晶。籽晶形状尺寸如图8(d)所示。
（4）15mL9M PVP的DMF溶液，加入180uL HAuCl4，1440uL籽晶加入搅拌几小时等反应完全。将生成的金纳米花离心溶于酒精溶液中。本身产生光热效应的激发波长可参考图3中左4曲线，为800-860nm。
（5）在40mL酒精，8mL水，0.8mL氨水溶液中加入（4）中的产物超声，加入1.6mL1％TEOS的酒精溶液。12小时后离心溶液酒精中。生成金纳米花@二氧化硅的复合物；然后将200uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS）对二氧化硅的表面进行功能化修饰，然后将2mL带羧基的CdTeS量子点加入。反应24小时，然后离心分散于酒精中。
（6）20mL酒精，4mL水，0.8mL氨水混合，向其中加入（5）中酒精溶液，逐滴加入400微升1%的TEOS的酒精溶液，反应24小时后，使用200uL的MPTMS、APTMS等对复合结构表面进行修饰使其表面带有巯基基团、氨基基团。进而可以将探针转移到特定的目标位置。本例复合探针尺度为90纳米，形状与图2一致。复合探针溶液及对照组（水溶液）的升温曲线（808nm激发光功率密度：1.2W/cm2）如图5所示。
进一步地，利用本实施例金纳米花@量子点复合探针的荧光与相同量量子点的发射光谱之比较，如图4.（a）所示，可见量子点发光峰在650nm，发光增强35%；如图4（b）所示，金纳米星@量子点复合探针的荧光与相同量量子点的荧光谱之比较，量子点发光峰在575nm，发光增强26%。由于量子点在复合探针中被SiO2包裹，故而增强的发光峰值有红移。可见金纳米花@量子点复合探针对量子点发光的增强处于近红外区，更加适用于活体标记。
更进一步地，本实施例制备的探针按照常规方法链接CK-19抗体，并用常规方法检测乳腺癌细胞的光热疗效。其结果如图6所示.本实施例中复合探针（链接CK-19抗体）对乳腺癌细胞的光热疗效（细胞中间黑的小泡为死细胞）（808nm激发光功率密度：1.2W/cm2）。其它实施例制备的不同尺度纳米花制备的探针形状疗效大致相同，但产生光热效应的波长有所区别，分别应用于不同场合。
进一步地，对(a)不接探针与(b)接复合探针（链接CK-19抗体）的乳腺癌细胞SK-BR-3的光热疗效之比较，808nm激发光（功率密度：1.2W/cm2，照射10分钟），其结果如图7所示。其它实施例制备的不同尺度纳米花制备的探针形状疗效大致相同，但产生光热效应的波长有所区别，分别应用于不同场合。
实施例5：
（1）将0.6mL10mM冰浴的NaBH4加入到10mL包含4.5mM HAuCl4和0.1M CTAB的水溶液中，溶液在29摄氏度下老化至少3小时。生成小的金球。
（2）6mL0.5mM的HAuCl4溶液、6mL0.2M CTAC和4.5mL0.1M AA混合后加入0.3mL（1）中已制备的籽晶。离心溶于1mL水中。得到较大的金球。
（3）将5.8mL DMF(包括0.43mM PVP（MW=55000）)和40uL HAuCl4（24.28mM）加入小瓶，然后加入200uL（2）中的籽晶，在80度下搅拌1小时。得到生长金纳米花的籽晶。籽晶形状尺寸如图8(e)所示。
（4）15mL3M PVP的DMF溶液，加入180uL HAuCl4，960uL籽晶加入搅拌几小时等反应完全。将生成的金纳米花离心溶于酒精溶液中。本身产生光热效应的激发波长可参考图3中左5曲线，为900nm左右。
（5）在40mL酒精，8mL水，0.8mL氨水溶液中加入（4）中的产物超声，加入1.6mL1％TEOS的酒精溶液。12小时后离心溶液酒精中。生成金纳米花@二氧化硅的复合物；然后将200uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS）对二氧化硅的表面进行功能化修饰，然后将2mL带羧基的CdTeS量子点加入。反应24小时，然后离心分散于酒精中。
（6）20mL酒精，4mL水，0.8mL氨水混合，向其中加入（5）中酒精溶液，逐滴加入400微升1%的TEOS的酒精溶液，反应24小时后，使用200uL的MPTMS、APTMS等对复合结构表面进行修饰使其表面带有巯基基团、氨基基团。进而可以将探针转移到特定的目标位置。本例复合探针尺度为100纳米，形状与图2一致，只是产生光热效应的波长有所区别，分别应用于不同场合。复合探针溶液及对照组（水溶液）的升温曲线（900nm激发光功率密度：1.2W/cm2）如图5所示。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同限定。

资源描述

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201310365333.X(22)申请日 2013.08.21B22F 1/00(2006.01)B22F 1/02(2006.01)B22F 9/24(2006.01)C09K 11/02(2006.01)C12Q 1/02(2006.01)G01N 21/64(2006.01)A61K 41/00(2006.01)A61K 9/14(2006.01)A61P 35/00(2006.01)B82Y 30/00(2011.01)B82Y 40/00(2011.01)(71)申请人安徽医科大学第一附属医院地址 230022 安徽省合肥市安。

2、徽医科大学第一附属医院中心实验室(72)发明人蒋童童朱立新许小亮(74)专利代理机构北京维澳专利代理有限公司 11252代理人吉海莲王立民(54) 发明名称一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针(57) 摘要本发明提供了本发明提供了一种金纳米花结构及其制备方法，所述金纳米花结构是用金八面体、金球或金四面体作为籽晶，在高浓度聚乙烯吡咯烷酮的环境中，用弱还原剂还原氯金酸得到周侧均布有圆头柱状体的金纳米花颗粒。另外，本发明还提供了一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针及其制备方法和应用。相对于传统的探针，此探针是集光热治疗与荧光标记于一身的探。

3、针，可以有效地定向杀死癌细胞，采用两种光源分别实现巨大的光热转化效率和量子点的荧光强度的较大增强，巧妙避开了两种效应的互相干涉。二氧化硅的包覆使得金纳米花和量子点的生物毒性被有效避免了，使得复合探针的表面易功能化，具有非常好的生物相容性。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页说明书8页附图5页(10)申请公布号 CN 104416152 A(43)申请公布日 2015.03.18CN 104416152 A1/2页21.一种金纳米花结构，其特征在于，所述金纳米花结构是用金八面体、金球或金四面体作为籽晶，在高浓度聚乙烯吡咯烷酮的环境中，用。

4、弱还原剂还原氯金酸得到周侧均布有圆头柱状体的金纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的金纳米花结构，其特征在于，所述金纳米花的直径为45-150nm，枝长为10-30nm。3.一种制备所述金纳米花的方法，其步骤如下：（1）使用NaBH4还原氯金酸的方式得到金籽晶溶液，再用还原剂还原长成较大的金纳米球，接着在金球的基础上生长金八面体、金球或金四面体；（2）用步骤（1）得到的金八面体、金球或金四面体作为籽晶，在高浓度PVP的环境中，用弱还原剂还原氯金酸得到金纳米花；通过改变PVP的浓度，氯金酸量及金籽晶量、金籽晶种类，从而得到不同尺寸不同枝长的菊花状金纳米颗粒。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，。

5、所述NaBH4和氯金酸的混合溶液的还包括老化的步骤，其老化温度为27度到32度之间，老化时间为3小时以上。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述NaBH4与氯金酸的摩尔比为6-24:2-10；步骤（1）中所述还原剂为抗坏血酸。6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述高浓度PVP环境是指浓度为4-10mM的聚乙烯吡咯烷酮溶液;步骤（2）中所述弱还原剂为N,N-二甲基甲酰胺；步骤（2）中所述氯金酸和金籽晶溶液体积比为1:11:30。7.一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针，其特征在于，其包含权利要求1或2所述的金纳米花结构。。

6、8.根据权利要求7所述的复合探针，其特征在于，其由内至外依次包括所述金纳米花、二氧化硅纳米壳层、量子点和二氧化硅纳米壳层；其是在制备好的金纳米花基础上，利用水解的方式在金纳米花外包裹二氧化硅层，形成包裹有金纳米花的二氧化硅球；然后通过对二氧化硅的表面进行修饰将量子点链接在二氧化硅球表面，形成内包裹有金纳米花、外链接有量子点的二氧化硅球复合材料；最后在复合材料表面再包裹一层二氧化硅纳米壳层。9.一种制备权利要求7或8所述用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针的方法，其步骤如下：（1）制备金纳米花；（2）金纳米花二氧化硅量子点复合材料的制备：先将步骤（1）所得金纳米花离心洗涤。

7、后溶解在乙醇、水和氨水的混合液中超声，然后将正硅酸四乙酯的酒精溶液逐滴加到反应溶液中进行二氧化硅球壳对金纳米花的包覆，反应12小时后进行离心洗涤，形成金纳米花和二氧化硅的复合结构；用上述结构进行表面修饰，然后将带有羧基的水溶性荧光量子点加入到修饰过的金纳米花和二氧化硅的复合结构中，使其反应24小时，然后离心并分散在乙醇中，得金纳米花二氧化硅量子点复合材料乙醇溶液；（3）金纳米花二氧化硅量子点复合探针的制备：向步骤（2）中制备好的复合材料中加入氨水超声，再逐滴加入正硅酸四乙酯的水溶液，室温下搅拌反应24小时，离心洗涤；用各种硅烷偶联剂进行修饰，使其表面带有不同的修权利要求书CN 1044。

8、16152 A2/2页3饰基团，最终得所述复合探针。10.权利要求7或8所述金纳米花二氧化硅量子点荧光/光热复合纳米探针在生物靶向中的应用。权利要求书CN 104416152 A1/8页4一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花 /量子点复合探针技术领域0001 本发明涉及复合纳米探针技术领域，具体涉及一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针。背景技术0002 量子点是由少量的原子所人工合成的纳米材料，又被称为“人造原子”，受激发后可以发出荧光，改变量子点的结构，可随意调节其激发和发射荧光波长，在接上特异性抗体后，用以标记及定位靶细胞，并在细胞中长期保。

9、持其物化与发光稳定性。用量子点取代传统的染料作为荧光标记体，可以克服染料分子大（因而需要在细胞上打洞、不能做活体标记）、光化学稳定性及光谱特性差等缺点，从而用于细胞的免疫荧光标记。其中近红外量子点发出的近红外光被组织吸收很少，从而用于活体内的细胞的免疫荧光标记。 0003 光热治疗是一种利用纳米金属光热材料吸收近红外光（近红外波段是透过人体血液和软组织的窗口，近红外光可以透过人体皮肤进入深组织），通过等离子激元共振和非辐射能级跃迁的过程产生声子（即热能）、导致局部高温，从而使癌细胞凋亡的治疗手段。将供热的金属纳米颗粒通过细胞吞噬或特异性抗体靶向链接癌细胞，通过激光束的激励，使肿瘤尺寸萎缩。研究。

10、显示，纳米光热材料的构型对其产生光热效应的阈值（通常以每平方厘米瓦计算，即W/cm2）以及温度直接相关，阈值越低及升温速度越快，癌细胞的活性越能被有效地停止、同时对正常机体的损伤愈小。近十年来，光热材料经历了金纳米球（激发阈值200W/cm2）、金纳米棒（160W/cm2）、金纳米壳（10W/cm2）、金纳米笼（2W/cm2）、金纳米星（1.8W/cm2）等各种金纳米构型。 0004 基于金纳米颗粒在局域表面等离子共振区域大的吸收截面，使其成为产生热的良好材料。而荧光量子点具有较宽的激发带和较窄的发射带，使其成为了医学上示踪的良好的材料。把两者的优良性质结合在一起，制备一种纳米光热荧光复合探。

11、针，实现治疗与诊断模式的联合成为一种新型课题。一般光热材料具有较大的吸收截面，场增强效应较弱。易导致量子点的荧光减弱。专利号为201310117034.4、名称为“一种具有光热及荧光增强双功能的金纳米星量子点复合型细胞探针及其制备方法和应用”的专利，公开的复合探针虽然具备光热转换及荧光增强双功能，然而由于下述3各方面的原因，还需要做一些改进，使之更适用于活体内的光热-荧光复合标记：（1）由于金纳米星尖刺的数目较少、各尖刺长度不易控制一致性，造成它的吸收光谱宽度很大、与近红外量子点的吸收谱重叠，这样在激发量子点发光（即做荧光示踪）时也会产生一些光热效应，对近红外发光的亮度产生一定的影响（但对波长。

12、短于橙色的光有增强效应，故适用于浅表肿瘤的标记）；（2）金纳米星的光热阈值为1.8W/cm2左右，还有进一步减少的空间；（3）由于金纳米星的尖刺较长，使得在链接量子点和包覆SiO2、制备复合探针时，不易控制复合探针的直径使之小于100nm，故而在对做活体细胞的标记产生一定程度的负面影响。说明书CN 104416152 A2/8页5发明内容0005 为了实现对量子点的荧光增强，用以细胞的荧光示踪，进而通过光热转换作用实现对癌细胞靶向治疗。本发明的目的是提供一种金纳米花结构及其制备方法。 0006 本发明的另一目的是提供一种用于活体细胞免疫荧光标记及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针金及其制。

13、备方法。 0007 首先，本发明是在各种金纳米结构的基础上做了改进，制备了金纳米花结构，所述金纳米花结构是用金八面体、金球或金四面体作为籽晶，在高浓度PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的环境中，用弱还原剂还原氯金酸得到周侧均布有圆头柱状体的金纳米颗粒，即像菊花状金纳米花。 0008 优选的，所述金纳米花的直径为45-150nm，枝长为10-30nm。 0009 本发明制备的纳米花是利用表面活性剂修饰生成纳米颗粒。其由于有表面活性剂的包裹生成的颗粒具有较高的稳定性能够长时间的保存，且在水和酒精溶液中具有很好的稳定性。 0010 相比于金纳米星上的尖刺，本发明制备的纳米花瓣数目较多、长度较为一致，这样：（1。

14、）它的吸收光谱可以控制得较窄、且与近红外量子点的吸收谱不重叠，荧光的亮度没有衰减，反而由于金纳米花同时具备荧光增强效应，使得近红外量子点的发光强度增强了35%；（2）光热阈值进一步减小到1.2W/cm2左右；（3）由于金纳米花瓣长度较短，使得在链接量子点和包覆SiO2、制备复合探针时，易控制复合探针的直径使之小于100nm，故而适用于做活体细胞的标记。本发明制备的不同尺度的纳米花如图8所示。 0011 一般来说，在荧光增强效应中，对金属纳米结构的等离子激元共振与荧光物质的吸收和发射的光谱重叠的控制被认为是非常重要的。另外，当入射光的频率和金属纳米结构的内在频率耦合时。局域表面等离子激元共振的现。

15、象将会出现。共振激发将会导致强烈局域的电场。它可以导致吸收和激发速率戏剧化的增加。金属颗粒的等离子共振(SPR)峰依靠很多因素，如材料、尺寸、形貌。纳米花结构有两个SPR峰，其中一个在500纳米到650纳米之间，这个与近红外量子点的激发峰很好匹配。可有效地增强量子点荧光。另一个可以调到700纳米到红外（如常用的808纳米），有助于进行体内的光热治疗。如果用于体外细胞株荧光显色，则可以接发射不同可见光的量子点（如470纳米蓝光、530纳米绿光、580纳米黄光），这些量子点的激发波长可统一用单一紫外光激发（不需要像染料那样必须用指定的波长激发单一的光发射），其发射强度没有减弱现象。 0012 进一。

16、步地，本发明提供了一种制备所述金纳米花的方法，其包括如下具体步骤： 0013 （1）使用NaBH4还原氯金酸的方式得到金籽晶溶液，再用还原剂还原长成较大的金纳米球、金八面体或金四面体； 0014 （2）用步骤（1）得到的金八面体、金球或金四面体作为籽晶，在高浓度 PVP的环境中，用弱还原剂还原氯金酸得到金纳米花；通过改变PVP的浓度，氯金酸量及金籽晶量、金籽晶种类，从而得到不同尺寸不同枝长的菊花状金纳米颗粒。 0015 优选的，所述NaBH4和氯金酸的混合溶液的还包括老化的步骤，其老化温度为27度到32度之间，老化时间为3小时以上。 0016 优选的，步骤（1）中所述NaBH4与氯金酸的摩尔比。

17、为6-24:2-10。 0017 优选的，步骤（1）中所述还原剂为抗坏血酸。说明书CN 104416152 A3/8页60018 优选的，步骤（2）中所述高浓度PVP环境是指浓度为4-10mM的聚乙烯吡咯烷酮溶液。 0019 优选的，步骤（2）中所述弱还原剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述氯金酸和金籽晶的溶液体积比为1:11:30。如，在本发明一优选实施例中，所述氯金酸量100-500uL,24.28mM；金籽晶量100-3000uL，0.1mM；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）10-30mL以及PVP（固体粉末)用量4-10mM。 0020 另一方面，本发明提供了一种用于活体细胞免疫荧光标记。

18、及光热治疗的金纳米花/量子点复合探针，其包括所述金纳米花结构。 0021 本实施例中，该探针由内至外依次包括所述金纳米花、二氧化硅纳米壳层、量子点和二氧化硅纳米壳层；其是在制备好的金纳米花基础上，利用水解的方式在金纳米花外包裹二氧化硅层，形成包裹有金纳米花的二氧化硅球；然后通过对二氧化硅的表面进行修饰将量子点链接在二氧化硅球表面，形成内包裹有金纳米花、外链接有量子点的二氧化硅球复合材料；最后在复合材料表面再包裹一层二氧化硅纳米壳层。 0022 进一步地，本发明还提供了一种制备所述复合探针的方法，其包括如下具体步骤： 0023 （1）制备所述金纳米花； 0024 （2）金纳米花二氧化硅量子点复合。

19、材料的制备： 0025 先将步骤（1）所得金纳米花离心洗涤后溶解在乙醇、水和氨水的混合液中超声，然后将正硅酸四乙酯的酒精溶液逐滴加到反应溶液中进行二氧化硅球壳对金纳米花的包覆，反应12小时后进行离心洗涤，形成金纳米花和二氧化硅的复合结构； 0026 用上述结构进行表面修饰，然后将带有羧基的水溶性荧光量子点加入到修饰过的金纳米花和二氧化硅的复合结构中，使其反应24小时，然后离心并分散在乙醇中，得金纳米花二氧化硅量子点复合材料乙醇溶液； 0027 （3）金纳米花二氧化硅量子点复合探针的制备： 0028 向步骤（2）中制备好的复合材料中加入氨水超声，再逐滴加入正硅酸四乙酯的水溶液，室温下搅拌反应24。

20、小时，离心洗涤；用各种硅烷偶联剂进行修饰，使其表面带有不同的修饰基团，最终得所述复合探针，具体合成的流程图请参见图1。 0029 优选的，步骤（2）中所述正硅酸四乙酯酒精溶液的体积浓度为1%；所述乙醇、水、正硅酸四乙酯酒精溶液和氨水的体积比为10-40：2-10:0.4-1：0.2-1；所述金纳米花与上述混合溶液的体积比为0.1-1:5-20。 0030 优选的，步骤（2）所述修饰剂为3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS）或氨丙基三乙氧基硅烷；所述修饰剂用量可以适当多点，后来多余的通过洗涤就洗去了，一般在全部制备好的颗粒时加入200-3000微升。 0031 优选的，所述荧光量子点为CdTeS。

21、、CdTe、CdSe、Mn-doped ZnS、CdS或CdTe/CdS/ZnS，摩尔数为0.05-1.0mM。 0032 优选的，所述硅烷偶联剂为乙烯基硅烷偶联剂、氨基硅烷偶联剂、环氧基硅烷偶联剂、甲基丙烯酰氧基硅烷偶联剂、巯基硅烷偶联剂或脲基硅烷偶联剂。所述硅烷偶联剂的用量应适当多加，后来多余的洗掉，一般在全部制备好的颗粒时加入150-4000微升，优选为200-300微升。说明书CN 104416152 A4/8页70033 更进一步地，本发明提供了所述复合型细胞探针在生物靶向中的应用。具体为将多种生物分子连接在该复合型细胞探针表面各种修饰基团上，以完成靶向标记的作用。所述生物分子。

22、优选为抗体、链霉亲和素、DNA片段、生物配体、阳离子多肽等。可以根据需要链接不同的抗体，以标记细胞中的不同亚细胞器官。比如链接单一抗体ck-19,可以特异性示踪乳腺癌通过淋巴的微转移；也可对多种生物指标进行多色量子点同时标记。 0034 本发明优点和积极效果如下： 0035 相对于传统的探针，此探针是集光热治疗与荧光标记于一身的探针，可以有效地定向杀死癌细胞，采用两种光源分别实现巨大的光热转化效率和量子点的荧光强度的较大增强，巧妙避开了两种效应的互相干涉。二氧化硅的包覆使得金纳米花和量子点的生物毒性被有效避免了，使得复合探针的表面易功能化，具有非常好的生物相容性。 0036 （1）利用金纳米。

23、花800nm处的等离子激元与808纳米的激光进行匹配实现非常高的光热转换效率，其光热转化阈值低于1.5W/cm2，可以有效地杀伤癌细胞同时保护正常细胞不受伤害，通过在复合纳米探针表面链接抗体可以实现对癌细胞的靶向治疗。 0037 （2）在复合纳米探针中，可以利用金纳米花600多纳米处的局域等离激元（LSP）诱导的局域电磁场实现了对近红外量子点（630-700nm）的辐射速率的增强，进而增强其发射的荧光强度。较好地对活体内癌细胞进行标记，对其转移进行示踪。如果用于体外细胞株的亚细胞器官的荧光显色，则可以接不同可见光量子点（如470纳米蓝光、530纳米绿光、580纳米黄光或620纳米红光），这些量。

24、子点的激发可用一种波长紫外光激发（不需要像染料那样每一种都要用特定波长激发），其发射强度没有减弱现象。 0038 （3）相对于传统的光热探针和量子点荧光探针，用二氧化硅作为屏障。使探针不是直接地裸露在生物体或细胞中。屏蔽了其毒性。同时对二氧化硅的表面进行功能化。实现了其靶向标记作用。附图说明0039 本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中： 0040 图1.金纳米花量子点光热荧光复合型探针的合成流程示意图。 0041 图2.实施例4金纳米花量子点光热荧光复合型探针的透射电子显微镜(TEM)图。 0042 图3.实施例1-5中制备的复合探针的。

25、吸收光谱，其峰值为建议之产生光热效应的激发波长。 0043 图4.（a）金纳米花量子点复合探针的荧光与相同量量子点的发射光谱之比较，可见量子点发光峰在650nm，发光增强35%；（b）金纳米星量子点复合探针的荧光与相同量量子点的荧光谱之比较，量子点发光峰在575nm，发光增强26%。 0044 图5.实施例4制成的复合探针溶液及对照组（水溶液）的升温曲线（808 nm激发光功率密度：1.2W/cm2）。 0045 图6.实施例4制成的复合探针（链接CK-19抗体）对乳腺癌细胞的光热疗效（细胞中间黑的小泡为死细胞）（808nm激发光功率密度：1.2W/cm2）。 0046 图7.实施例4制成的。

26、808nm激发光（功率密度：1.2W/cm2，照射10分钟）对(a)不说明书CN 104416152 A5/8页8接探针与(b)接复合探针（链接CK-19抗体）的乳腺癌细胞SK-BR-3的光热疗效之比较。 0047 图8.改变氯金酸（24.28mM）的量和籽晶的量得到的几种不同尺寸的纳米花。两者的体积比为(a)1:16，(b)3:40，(c)3:32，(d)1:8，(e)3:16，以及(f)3:8。(a)-(e)分别对应实施例1-5中制备的纳米花。具体实施方式0048 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类。

27、似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。 0049 化学药品： 0050 氯金酸，N,N-二甲基甲酰胺(DMF,AR)，聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW=55000,AR），聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW=1000,AR），溴化十六烷基三甲铵（CTAB,AR），氯化十六烷基三甲基铵（CTAC,AR），抗坏血酸（AA,AR）。硼氢化钠（NaBH4,AR）正硅酸四乙酯（TEOS,AR），氨水(25%NH3,AR)，无水乙醇(AR)，以上为向国药集团化学试剂有限公司购买药品。3-巯丙基三甲氧基硅烷（MPTMS，sigma,AR），3-氨丙基三。

28、甲氧基硅氧烷（APTMS，sigma，AR）、几种不同的量子点（CdTe,CdTeCdS,CdTeS等）的制备方法见参考文献（1Sander F.Wuister,Ingmar Swart,Floris van Driel,Stephen G.Hickey,and Celso de Mello Donega Nano Lett.,3(2003)504；2Hui Peng,Lijuan Zhang,Christian Soeller,Jadranka Travas-Sejdic Journal of Luminescence127(2007)7217263Weiyong Mao,JiaGuo,Wu。

29、LiYang,Changchun Wang,Jia He and Jiyao Chen Nanotechnology18(2007)485611）。 0051 实施例1： 0052 （1）将0.6mL10mM冰浴的NaBH4加入到10mL包含0.85mM HAuCl4和0.1M CTAB的水溶液中，溶液在29摄氏度下老化至少3小时。生成小的金球。 0053 （2）6mL0.5mM的HAuCl4溶液、6mL0.2M CTAC和4.5mL0.1M AA混合后加入0.3mL（1）中已制备的籽晶。离心溶于1mL水中。得到较大的金球。 0054 （3）将5.8mL DMF(包括0.43mM PVP（MW。

30、=55000）)和40uL HAuCl4（24.28mM）加入小瓶，然后加入200uL步骤（2）中的籽晶，在80摄氏度下搅拌1小时，得到生长金纳米花的籽晶，籽晶形状尺寸如图8(a)所示。 0055 （4）15mL9M PVP的DMF溶液，加入150uL HAuCl4，2400uL步骤（3）制备的籽晶加入搅拌几小时等反应完全。将生成的金纳米花离心溶于酒精溶液中。以本发明得到的纳米花的形状与吸收谱的关系做了一个图（如图3所示），说明激发波长受形状的调控。本身产生光热效应的激发波长可参考图3中左一曲线，为670nm。 0056 （5）在40mL酒精，8mL水，0.8mL氨水溶液中加入（4）中的产物超。

31、声，加入1.6mL1TEOS的酒精溶液。12小时后离心溶液酒精中。生成金纳米花二氧化硅的复合物；然后将200uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS）对二氧化硅的表面进行功能化修饰，然后将2mL带羧基的CdTeS量子点加入。反应24小时，然后离心分散于酒精中。 0057 （6）20mL酒精，4mL水，0.8mL氨水混合，向其中加入（5）中酒精溶液，逐滴加入400微升1%的TEOS的酒精溶液，反应24小时后，使用200uL的MPTMS、APTMS等对复合结构表面说明书CN 104416152 A6/8页9进行修饰使其表面带有巯基基团、氨基基团。进而可以将探针转移到特定的目标位置。本例复合探。

32、针尺度为65纳米，形状与图2金纳米花量子点光热荧光复合型探针的透射电子显微镜(TEM)图一致，只是产生光热效应的波长有所区别，分别应用于不同场合（体内、体外）。复合探针溶液及对照组（水溶液）的升温曲线与图5大致相同，只是产生光热效应的激发波长有所区别，分别应用于不同场合（体内、体外）。 0058 各个实施例中制备的探针，其形状即图8(a)-(e)（对应实施例1-5）表示的纳米花包覆SiO2所成，各自的光谱对应于图3，适用于波长不同的（600-900nm）激光器激发，各用户可根据自己的条件加以选择。比如考虑到808nm激光的通用性以及在活体中具有良好的穿透性，当金纳米花的其中一个吸收峰在808。

33、纳米时（见实施例3），与激光器的发射波长达成共振，光热效果最好。其它各实施例分析与此相同。 0059 实施例2： 0060 （1）将0.6mL10mM冰浴的NaBH4加入到10mL包含1.5mM HAuCl4和0.1M CTAB的水溶液中，溶液在29摄氏度下老化至少3小时。生成小的金球。 0061 （2）6mL0.5mM的HAuCl4溶液、6mL0.2M CTAC和4.5mL0.1M AA混合后加入0.3mL（1）中已制备的籽晶。离心溶于1mL水中。得到较大的金球。 0062 （3）将5.8mL DMF(包括0.43mM PVP（MW=55000）)和40uL HAuCl4（24.28mM）加。

34、入小瓶，然后加入200uL（2）中的籽晶，在80度下搅拌1小时。得到生长金纳米花的籽晶。籽晶形状尺寸如图8(b)所示。 0063 （4）15mL9M PVP的DMF溶液，加入180uL HAuCl4，2400uL（3）制备的籽晶加入搅拌几小时等反应完全。将生成的金纳米花离心溶于酒精溶液中。本身产生光热效应的激发波长可参考图3中左二曲线，为780nm。 0064 （5）在40mL酒精，8mL水，0.8mL氨水溶液中加入（4）中的产物超声，加入1.6mL1TEOS的酒精溶液。12小时后离心溶液酒精中。生成金纳米花二氧化硅的复合物；然后将200uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS）对二氧化硅的。

35、表面进行功能化修饰，然后将2mL带羧基的CdTeS量子点加入。反应24小时，然后离心分散于酒精中。 0065 （6）20mL酒精，4mL水，0.8mL氨水混合，向其中加入（5）中酒精溶液，逐滴加入400微升1%的TEOS的酒精溶液，反应24小时后，使用200uL的MPTMS、APTMS等对复合结构表面进行修饰使其表面带有巯基基团、氨基基团。进而可以将探针转移到特定的目标位置。本例复合探针尺度为75纳米，形状与图2一致，只是产生光热效应的波长有所区别，分别应用于不同场合（体内、体外）。复合探针溶液及对照组（水溶液）的升温曲线与图5大致相同，只是产生光热效应的激发波长有所区别，分别应用于不同场合（。

36、体内、体外）。 0066 实施例3： 0067 （1）将0.6mL10mM冰浴的NaBH4加入到10mL包含3mM HAuCl4和0.1M CTAB的水溶液中，溶液在29摄氏度下老化至少3小时。生成小的金球。 0068 （2）6mL0.5mM的HAuCl4溶液、6mL0.2M CTAC和4.5mL0.1M AA混合后加入0.3mL（1）中已制备的籽晶。离心溶于1mL水中。得到较大的金球。 0069 （3）将5.8mL DMF(包括0.43mM PVP（MW=55000）)和40uL HAuCl4（24.28mM）加入小瓶，然后加入200uL（2）中的籽晶，在80度下搅拌1小时。得到生长金纳米。

37、花的籽晶。籽晶形状尺寸如图8(c)所示。说明书CN 104416152 A7/8页100070 （4）15mL9M PVP的DMF溶液，加入180uL HAuCl4，1920uL籽晶加入搅拌几小时等反应完全。将生成的金纳米花离心溶于酒精溶液中。本身产生光热效应的激发波长可参考图3中左三曲线，为808nm。 0071 （5）在40mL酒精，8mL水，0.8mL氨水溶液中加入（4）中的产物超声，加入1.6mL1TEOS的酒精溶液。12小时后离心溶液酒精中。生成金纳米花二氧化硅的复合物；然后将200uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS）对二氧化硅的表面进行功能化修饰，然后将2mL带羧基的。

38、CdTeS量子点加入。反应24小时，然后离心分散于酒精中。 0072 （6）20mL酒精，4mL水，0.8mL氨水混合，向其中加入（5）中酒精溶液，逐滴加入400微升1%的TEOS的酒精溶液，反应24小时后，使用200uL的MPTMS、APTMS等对复合结构表面进行修饰使其表面带有巯基基团、氨基基团。进而可以将探针转移到特定的目标。本例复合探针尺度为85纳米，形状与图2一致，只是产生光热效应的波长有所区别，分别应用于不同场合。复合探针溶液及对照组（水溶液）的升温曲线与图5一致。 0073 实施例4： 0074 （1）将0.6mL10mM冰浴的NaBH4加入到10mL包含4mM HAuCl4和0。

39、.1M CTAB的水溶液中，溶液在29摄氏度下老化至少3小时。生成小的金球。 0075 （2）6mL0.5mM的HAuCl4溶液、6mL0.2M CTAC和4.5mL0.1M AA混合后加入0.3mL（1）中已制备的籽晶。离心溶于1mL水中。得到较大的金球。 0076 （3）将5.8mL DMF(包括0.43mM PVP（MW=55000）)和40uL HAuCl4（24.28mM）加入小瓶，然后加入200uL（2）中的籽晶，在80度下搅拌1小时。得到生长金纳米花的籽晶。籽晶形状尺寸如图8(d)所示。 0077 （4）15mL9M PVP的DMF溶液，加入180uL HAuCl4，1440u。

40、L籽晶加入搅拌几小时等反应完全。将生成的金纳米花离心溶于酒精溶液中。本身产生光热效应的激发波长可参考图3中左4曲线，为800-860nm。 0078 （5）在40mL酒精，8mL水，0.8mL氨水溶液中加入（4）中的产物超声，加入1.6mL1TEOS的酒精溶液。12小时后离心溶液酒精中。生成金纳米花二氧化硅的复合物；然后将200uL的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTMS）对二氧化硅的表面进行功能化修饰，然后将2mL带羧基的CdTeS量子点加入。反应24小时，然后离心分散于酒精中。 0079 （6）20mL酒精，4mL水，0.8mL氨水混合，向其中加入（5）中酒精溶液，逐滴加入400微升1%的T。

41、EOS的酒精溶液，反应24小时后，使用200uL的MPTMS、APTMS等对复合结构表面进行修饰使其表面带有巯基基团、氨基基团。进而可以将探针转移到特定的目标位置。本例复合探针尺度为90纳米，形状与图2一致。复合探针溶液及对照组（水溶液）的升温曲线（808nm激发光功率密度：1.2W/cm2）如图5所示。 0080 进一步地，利用本实施例金纳米花量子点复合探针的荧光与相同量量子点的发射光谱之比较，如图4.（a）所示，可见量子点发光峰在650nm，发光增强35%；如图4（b）所示，金纳米星量子点复合探针的荧光与相同量量子点的荧光谱之比较，量子点发光峰在575nm，发光增强26%。由于量子点在复合探针中被SiO2包裹，故而增强的发光峰值有红移。可见金纳米花量子点复合探针对量子点发光的增强处于近红外区，更加适用于活体标记。 0081 更进一步地，本实施例制备的探针按照常规方法链接CK-19抗体，并用常规方法说明书CN 104416152 A10。

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