说明书新的表面外露流感嗜血菌蛋白质(蛋白质E;pE)
本申请是发明人于2007年1月17日提交的题为“新的表面外露流感嗜血菌蛋白质(蛋白质E；pE)”的中国专利申请200780003278.2的分案申请。
技术领域
本发明涉及表面外露蛋白质E，其为毒力因子，存在于所有有荚膜的和非典型的流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)中。
背景技术
b型流感嗜血菌(Hib)和非典型流感嗜血菌(NTHi)都可以在儿童和成人中引起多种疾病。Hib在4岁以下儿童中引起细菌性脑膜炎和其他侵入性感染，而NTHi从中耳炎、鼻窦炎、会厌炎、支气管炎和肺炎病例中分离出来，其可引起新生儿脓毒症。目前还没有商业上可获得的抗NTHi疫苗，但是已使用多种抗Hib的疫苗。这些疫苗包括Hib荚膜多糖、磷酸聚核糖基核糖醇(polyribosyl ribitol phosphate)，所述磷酸聚核糖基核糖醇与多种蛋白质载体(脑膜炎球菌外膜复合物、破伤风类毒素、白喉毒素无毒突变体或白喉类毒素)缀合，从而克服小于18个月的儿童对荚膜多糖产生的弱的免疫应答。流感嗜血菌外膜蛋白(OMPs)也可以作为多核糖基磷酸核糖醇的载体，因为它们是Hib和NTHi感染以后宿主抗体的目标。在对抗流感嗜血菌感染的体内防御和体外杀菌试验中检测OMPP1、P2、P4、P5和P6和98-kDa蛋白质的抗体，P1、P4和P6的抗体显示对抗同源和异源流感嗜血菌菌株的生物学活性。其他OMP的抗体缺乏异源防御的部分原因是这些蛋白质在不同流感嗜血菌菌株中的抗原多样性。因此，理想的抗原必须是外露于细菌表面且具有良好的抗原保守性。在本实验室中，分离、克隆、测序了一种42-kDa的膜蛋白(蛋白质D)，其在Hib和NTHi菌株中广泛分布且具有抗原保守性，同时其为致病因子和可能的疫苗候选者(1-5)。
二十年以前发现流感嗜血菌和粘膜炎莫拉菌(M.catarrhalis)对于可 溶的和表面结合的人IgD具有强亲和力(6)。IgD结合似乎与细胞水平上与表面结合的IgD的类似相互作用是平行的，该现象解释了流感嗜血菌和粘膜炎莫拉菌对人淋巴细胞的强促有丝分裂作用(7-9)。分离和克隆了来自流感嗜血菌的IgD结合外膜蛋白质(蛋白质D)，其为重要的致病性因子(1-5)。然而，蛋白质D不都结合于所有的IgD骨髓瘤(10)。
发明概述
由于发现流感嗜血菌是上和下呼吸道感染的重要原因，目前需要发展用于对抗流感嗜血菌的疫苗。
因此，本发明的目的是发现流感嗜血菌与机体细胞和免疫系统相互作用的方式，并且能够提供新型疫苗。
本发明的一方面提供可以在流感嗜血菌中检测到的表面外露蛋白质，其具有标识号为Sequence ID No.1的氨基酸序列，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羟基化、磺化或糖基化产物，或其他次级加工产物。
本发明的另一方面提供所述表面外露蛋白质的免疫原性片段，该片段可以在流感嗜血菌中检测到，或者是其天然存在的或人工修饰的变体。
本发明的另一方面提供基于上述表面外露蛋白质的重组免疫原性蛋白质，其中Sequence ID No.1的第1-21位氨基酸缺失或被一个或多个氨基酸取代。在一个实施方案中，Sequence ID No.1序列的第1-21位氨基酸被0-21个任选氨基酸的序列所取代。在另一个实施方案中，重组免疫原性蛋白质具有标识号为Sequence ID No.2的氨基酸序列，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羟基化、磺化或糖基化产物，或其他次级加工产物。
本发明的另一方面提供具有标识号为Sequence ID No.3的氨基酸序列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羟基化、磺化或糖基化产物，或其他次级加工产物。
本发明的仍然另一方面提供具有标识号为Sequence ID No.4的氨基酸 序列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羟基化、磺化或糖基化产物，或其他次级加工产物。
本发明的另一方面还提供具有标识号为Sequence ID No.5的氨基酸序列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羟基化、磺化或糖基化产物，或其他次级加工产物。
本发明的另一方面提供具有标识号为Sequence ID No.6的氨基酸序列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羟基化、磺化或糖基化产物，或其他次级加工产物。
本发明的仍然另一方面提供具有标识号为Sequence ID No.7的氨基酸序列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羟基化、磺化或糖基化产物，或其他次级加工产物。
本发明的另一方面还提供具有标识号为Sequence ID No.8的氨基酸序列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羟基化、磺化或糖基化产物，或其他次级加工产物。
本发明的另一部分提供具有标识号为Sequence ID No.9的氨基酸序列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羟基化、磺化或糖基化产物，或其他次级加工产物。
本发明的另一方面提供具有标识号为Sequence ID No.10的氨基酸序列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羟基化、磺化或糖基化产物，或其他次级加工产物。
本发明的另一方面提供至少一种上述蛋白质、片段或肽在制备用于预防或治疗感染的药物中的用途。在一个实施方案中，感染由流感嗜血菌引起，且在另一个实施方案中，流感嗜血菌是有荚膜的或非典型的。在另一个实施方案中，所述用途是用于预防或治疗儿童的中耳炎、鼻窦炎或下呼吸道感染，和成人的例如慢性梗阻性肺疾病(COPD)。
本发明的一个方面提供包含至少一种上述蛋白质、片段或肽的药物，其也包含一种或多种可药用佐剂、介质、赋形剂、结合剂、载体、防腐剂、缓冲剂、乳化剂、湿润剂或利于转染的化合物。
本发明的另一方面提供包含至少一种上述蛋白质、片段或肽的疫苗组合物。在一个实施方案中，所述疫苗组合物包含至少一种所述蛋白质、片段或肽的二-、三-或多聚体。在另一个实施方案中，疫苗组合物还包含一种或多种可药用佐剂、介质、赋形剂、结合剂、载体、防腐剂、缓冲剂、乳化剂、湿润剂或利于转染的化合物。在另一个实施方案中，所述疫苗组合物包含至少一种其他疫苗，而且在另一个实施方案中，其包含另一分子的免疫原性部分，其中另一分子的免疫原性部分可以选自流感嗜血菌的蛋白质D(EP594 610)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的MID(WO03/004651、WO 97/41731和WO96/34960)、粘膜炎莫拉菌的UspAl或UspA2(WO93/03761)，和任意呼吸道病原体的外膜蛋白质或糖类荚膜、或DNA寡核苷酸、例如CpG基序。
本发明的一个方面涉及编码上述蛋白质、片段或肽的核酸序列，及其同源物、多态变体、降解和剪接变体。在一个实施方案中，所述核酸序列与至少另一种基因融合。
本发明的另一方面涉及包含上述核酸序列的质粒或噬菌体。
本发明的另一个实施方案还涉及包含至少一种上述质粒的非人宿主，所述非人宿主能够产生上述蛋白质、片段或肽，及其同源物、多态变体、降解和剪接变体，并且该宿主选自细菌、酵母和植物。在一个实施方案中，所述宿主是大肠杆菌。
本发明的另一方面提供融合蛋白质或多肽，其中通过使用上述重组核酸序列使上述蛋白质、片段或肽与至少另一种蛋白质结合。在一个实施方案中，所述融合蛋白质是上述蛋白质、片段或肽的二-、三-或多聚体。
本发明的一个方面涉及融合产物，其中上述蛋白质、片段或肽共价或通过其他方式与蛋白质、糖类或基质结合。
本发明的另一方面涉及分离上述蛋白质、片段或肽的方法，所述方法包含下列步骤：
a)培养含有所述蛋白质、片段或肽的编码DNA的流感嗜血菌或大肠杆菌，收集细菌并分离外膜或包涵体；
b)用强溶解剂(solvatising agent)溶解包涵体；
c)加入复性剂；和
d)得到的混悬液以pH8-10的缓冲液透析。
在所述方法的一个实施方案中，溶解剂是盐酸胍(guanidium hydrochloride)，而在另一个实施方案中复性剂是精氨酸(arginin)。
本发明的另一方面涉及上述药物或疫苗组合物，其包含所述融合蛋白质或多肽、或所述融合产物。
本发明的一个方面涉及预防或治疗个体感染的方法，其包含施用药学有效量的上述药物或疫苗组合物。在一个实施方案中，所述感染由有荚膜的或非典型的流感嗜血菌引起，而在另一个实施方案中，感染选自中耳炎、鼻窦炎或下呼吸道感染。
本发明涉及蛋白质E，具体是蛋白质E多肽和蛋白质E多核苷酸，以及产生它们所用的重组材料和方法。在另一方面，本发明涉及使用此类多肽和多核苷酸的方法，包括预防和治疗微生物疾病(microbial disease)等等。在另一方面，本发明涉及检测微生物感染相关疾病和此类感染的相关病症的诊断测定，例如检测蛋白质E多核苷酸或多肽的表达或活性的测定。
通过阅读以下描述和本公开文本的其他部分，公开的本发明的精神和范围的多种改变和修饰对于本领域技术人员是显而易见的。
附图描述
图1.通过IgD(λ)骨髓瘤蛋白质检测16.3kDa的流感嗜血菌蛋白质E。A中显示在流感嗜血菌772中pE表达的流式细胞术分析。图示处理的流感嗜血菌MinnA外膜蛋白质的SDS-PAGE和Western印迹(B)以及二维SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(C)。图示Q-琼脂糖分离前(B)和后(C)的外膜蛋白质提取物。C中的箭头表示相应凝胶Western印迹(用IgD(λ)作为探针)上pE的预测位置。A中细菌和IgD(λ)骨髓瘤蛋白质一起上样，然后与兔FITC缀合的抗IgD pAb一起孵育并进行流式细胞术分析。B中显示考马斯亮蓝染色的SDS凝胶(染色)和以人骨髓瘤IgD(λ)为探针、随后 与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgD多克隆抗体一起孵育的Western印迹。上样前样品在2-巯基乙醇存在下煮沸10分钟。
图2.表达pE的大肠杆菌与流感嗜血菌3655野生型和pE缺失突变体相比较的流式细胞术谱。携带空载体pUC18的大肠杆菌(A)与含流感嗜血菌772基因组DNA(基因HI0175到HI0178)的pUC18转染的细菌(B)相比较。显示了在非典型流感嗜血菌3655野生型(C)和相应突变体(D)中的pE表达。大肠杆菌菌株JM83和流感嗜血菌在液体培养基中生长过夜。大肠杆菌与人骨髓瘤IgD(λ)一同在冰上孵育。一小时以后洗涤，加入FITC缀合的兔抗人IgD pAb再孵育30分钟，然后进行洗涤步骤，随后进行流式细胞术分析。对流感嗜血菌3655或衍生的pE突变体，使用特异性兔抗pE多克隆抗体和FITC缀合的山羊抗兔pAb进行同样的操作。
图3.通过流式细胞术和IgD(λ)骨髓瘤血清显示流感嗜血菌和相关种中的pE表达。分析了22个NTHi和27个嗜血菌属物种或相关细菌菌株。细菌生长到静止期，并与人骨髓瘤IgD(λ)在冰上共同孵育。一小时以后洗涤，加入FITC缀合的兔抗人IgD多克隆抗体(pAb)再孵育30分钟，然后进行洗涤步骤，随后进行流式细胞术分析。
图4.Western印迹显示pE在NTHi和有荚膜的流感嗜血菌中表达。来自所示菌株的细菌蛋白质用制备，进行SDS凝胶电泳，然后以人骨髓瘤IgD(λ)为探针进行Western印迹，并用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgD多克隆pAb作为检测抗体。
图5.相对于流感嗜血菌MinnA的天然pE，基于NTHi772序列的重组pE22-160。A中为pE衍生片段A的氨基端序列与天然蛋白质pE预测的氨基端序列相比较。B中为具有组氨酸标记的pE(A)的示意图。C中为在考马斯亮蓝染色的PAGE上证明的大小和纯度。D和E为考马斯亮蓝染色的凝胶和Western印迹中流感嗜血菌MinnA中提取的外膜蛋白(OMP)与重组产物pE(A)分别相比较。A中除第21位谷氨酸氨基酸残基以外，除去了信号肽序列。如所示从表达载体pET26(+)衍生了9个氨基酸。数字代表从pE翻译起始的氨基酸位点。重组pE(A)在大肠杆菌中产生、纯化， 并进行Edman降解从而分析信号肽酶切割位点。在D和E中，同时进行两块凝胶的电泳，一个用考马斯亮蓝染色，一个印迹到Immobilon-P膜上，以人IgD(λ)骨髓瘤蛋白为探针，然后与合适的辣根过氧化物酶缀合的二抗一起孵育。OMP部分用按材料和方法中所述进行纯化。
图6.蛋白质E非常保守。图中显示了涵盖有荚膜和非典型分离物的13到31流感嗜血菌菌株(表2)中点突变的频率。结果通过使用侧翼引物测序得到。所有的序列与用作参考序列的流感嗜血菌Rd的pE序列进行比较，并在此显示。
图7.pE的亲水性图谱。图中显示了各氨基酸残基的疏水和亲水部分。也标出预测的信号肽。数据通过使用所述标准方法获得(21)。
图8.SDS-PAGE证明的重组pE22-160(片段A)和称为B到H的一系列截短片段。A中显示不同片段的略图，而B中显示SDS-PAGE图。编码多种蛋白质的DNA被连接到表达载体pET26(+)中，并且在大肠杆菌中重组表达。得到的过表达蛋白质在镍树脂上纯化，并在SDS-PAGE上分离，随后用考马斯亮蓝染色。
图9.pE缺失的突变菌株(NTHi3655)诱导大鼠急性中耳炎的能力降低100-1000倍。在雄性Sprague-Dawley大鼠中通过在颈腹侧正中切口，然后向中耳腔注射0.05ml所示数字的细菌，从而诱导感染。所示的数据是从攻击3天，每组5个代表性动物得到的数据。
图10.不同年龄组的血清中直接抗pE的IgG和IgA抗体的平均浓度。用重组pE(A)作为bate，抗pE抗体通过夹心ELISA进行分析。pE(A)的纯度在图5中显示。
图11.pE在不同嗜血菌属菌株中特别保守。使用侧翼引物在a型(n＝2)、b型(n＝2)、c型(n＝2)、d型(n＝l)、e型(n＝2)和f型(n＝3)有荚膜的流感嗜血菌、NTHi(n＝8)、流感嗜血菌生物变型aegypticus(n＝6)和埃及嗜血菌(H.aegypticus，n＝5)中对pe基因进行测序。Rd意指流感嗜血菌菌株Rd(HiO178)，而772为NTHi菌株772。数字65-577相应为表1所列出的菌株。
发明详述
在详细解释本发明之前，很重要的是理解在本申请中，本发明不限于本文描述的实施方案和步骤的细节。提及的实施例是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。本发明也可以用其他实施方案和以多种方式实践或进行。也应理解本文使用的词语和术语的目的是为说明而不是限制。
本申请描述称为蛋白质E(pE)的新的流感嗜血菌外膜蛋白质的克隆和表达。该蛋白质是使用与pE有特异性亲和力的人IgD(λ)骨髓瘤血清而发现的。
为了使重组pE的产量最大化，制备了包含第22位赖氨酸至第160位赖氨酸氨基酸残基的截短的pE片段。因而除去了包含第21位谷氨酸氨基酸的N末端信号肽，除源自载体pET26(+)的9个残基以外用前导肽取代。截短的pE(即pE22-160)称为pE(A)。
本发明包含嗜血菌外膜蛋白质pE和pE衍生的肽pE22-60、pE22-95、pE22-125、pE41-68、pE56-125、pE56-160、pE86-160、pE115-160，和其二-、三-或寡聚体。尤其更为优选表面外露的pE或衍生肽的序列。
因此，本发明的疫苗组合物包含可以在所有流感嗜血菌中检测到的作为免疫原性成分的表面外露蛋白质、所述表面外露蛋白质的免疫原性片段、基于所述表面外露蛋白质的重组免疫原性蛋白质、具有标识号为Sequence ID No2的氨基酸序列的重组免疫原性蛋白质；和/或具有标识号为Sequence ID No3-10的氨基酸序列的肽，或其片段、同源物、功能性等同物、衍生物，降解或羟基化、磺化或糖基化产物，或其他次级加工产物。疫苗组合物也可以包含融合蛋白质或多肽、或作为免疫原性成分的本发明的融合产物。免疫原性成分能够产生对流感嗜血菌的抗体或其他免疫应答，其中产生的抗体抑制流感嗜血菌细菌对受试者细胞的致病作用。本发明疫苗组合物的“免疫原性剂量”是与施用前的标准免疫应答相比在施用以后产生可检测的体液和/或细胞免疫应答的剂量。
用于本发明的疫苗组合物中产生抗原的核酸序列可以通过多种方法 插入多种表达载体中的任一个。此类方法是本领域技术人员所公知的。
使用熟知的方法和技术可以容易地获得疫苗组合物，并且该疫苗组合物可以以多种方式施用，优选胃肠外或鼻内施用。适合于胃肠外或鼻内施用的制剂包括水和非水性无菌注射溶液、其可能包含抗氧化剂、缓冲液、制菌剂和使制剂与所述受试者的体液等渗的溶质；而且水和非水性无菌混悬液可以包括悬浮剂或增稠剂。活性免疫原性成分通常与赋形剂相混合，赋形剂为可药用的，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等。另外，疫苗组合物也可以包含少量的辅助性物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、结合剂、载体或防腐剂。
疫苗组合物也可以包括用于增强组合物免疫原性的佐剂，例如弗氏佐剂和本领域公知的其他系统。疫苗组合物的免疫原性成分(即本发明的蛋白质、片段、肽、融合蛋白质或多肽、或融合产物)可以制备成中性或盐形式的疫苗。
疫苗组合物的剂量依赖于疫苗的特异活性，并且可以通过常规实验容易地确定。疫苗组合物以基于受试者治疗上有效的和有免疫原性的量施用。
本发明涉及下面更详细描述的蛋白质E多肽和多核苷酸。具体地，本发明涉及非典型流感嗜血菌的蛋白质E的多肽和多核苷酸。蛋白质E多肽具有信号序列，并且外露于细菌表面。信号肽位于蛋白质E多肽的第1-20个残基。
本文所述“蛋白质E”指本文描述的本发明任意肽、免疫原性片段、融合物(fusion)、多肽或蛋白质(例如有或没有信号序列的SEQ ID NO:1)。“编码蛋白质D的多核苷酸”指编码本文描述的本发明任意肽、免疫原性片段、融合物、多肽或蛋白质的任意多核苷酸序列。
术语“包含”在本文可以任选地被术语“包括”取代。
本发明尤其涉及本文列出的蛋白质E多核苷酸和编码的多肽。
应该理解下面序列表中列出的作为“DNA”的序列代表本发明的一个实施方案的范例，因为普通技术人员将认识到此类序列一般以多核苷酸(包 括核糖多核苷酸)应用。
蛋白质E多核苷酸的序列示于SEQ ID NO:11(来自ntHi菌株772)。蛋白质E编码多肽的序列示于SEQ ID NO:1(来自ntHi菌株772)、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
多肽
本发明的一个方面提供流感嗜血菌的多肽(尤其是非典型流感嗜血菌)，在本文中称为“蛋白质E”和“蛋白质E多肽”，以及其生物学上、诊断上、预防上、临床上或治疗上有用的变体，和包含这些的组合物。
本发明还提供：
(a)分离的多肽，其包含与SEQ ID NO:1-10中的任一序列具有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、最优选至少97-99％同一性或完全同一性的氨基酸序列；
(b)分离的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸包含在所选SEQ ID NO:0序列的全长上与SEQ ID NO:11任意序列具有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％同一性或完全同一性的多核苷酸序列；或
(c)由分离的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:1-10的任意氨基酸序列具有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％同一性或完全同一性的多肽的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:1-10提供的蛋白质E多肽是来自非典型流感嗜血菌菌株的蛋白质E多肽。已经确定了来自表1列出的流感嗜血菌菌株的其他蛋白质E序列。
本发明也提供蛋白质E多肽的免疫原性片段，即蛋白质E多肽的连续部分，其与包含选自SEQ ID NO:1-10的相应氨基酸序列的多肽具有相同的或基本相同的免疫原性。也就是说该片段(如需要与载体配对)能够产生识别蛋白质E多肽的免疫应答。可选择地或另外地，免疫原性片段可以保留全长蛋白质的IgD结合功能(如在实施例部分的描述，例如从结合位点 (Birmingham,英国)结合IgD(λ)的能力)。此类免疫原性片段可包括例如缺失N末端前导序列、和/或跨膜结构域、和/或C末端锚定结构域的蛋白质E多肽。在优选的方面，本发明的蛋白质E的免疫原性片段基本上包含在所述序列全长上与选自SEQ ID NO:1-10的序列具有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、最优选至少97-99％同一性的多肽的所有胞外结构域。
片段是具有与本发明任意多肽的氨基酸序列部分但不是全部完全相同的氨基酸序列的多肽。对于蛋白质E多肽，片段可以是“独立的”，或包含在较大的多肽中，在其中片段形成一部分或区域，最优选在单个较大多肽中作为单个连续区域。因此片段可以比全长的天然序列短，或者如果包含在较大的多肽之内，其可以是全长的天然序列或更长的融合蛋白质。
优选的片段包括例如具有选自SEQ ID NO:1-10的氨基酸序列的一部分的截短多肽或其变体，例如包括氨基和/或羧基端氨基酸序列的残基的连续系列。也优选由或在宿主细胞中产生的本发明多肽的降解形式。还优选由结构或功能属性表征的片段，例如包含α-螺旋和α-螺旋形成区、β-片层和β-片层形成区、转角和转角形成区、卷曲和卷曲形成区、亲水区、疏水区、α两亲区、β两亲区、柔性区、表面形成区、底物结合区和高抗原指数区的片段。
更优选的片段分离的多肽，其包括含有选自SEQ ID NO:1-10的氨基酸序列的至少15、20、30、40、50或100个连续氨基酸的氨基酸序列，或含有选自SEQ ID NO:1-10的氨基酸序列截短或缺失的至少15、20、30、40、50或100个连续氨基酸氨基酸序列。
还更优选包含B细胞表位的片段，例如实施例10中描述的那些片段/肽。
本发明多肽的片段可以用于通过肽合成产生相应的全长多肽；因此，这些片段可以用作产生本发明的全长多肽的中间体。
尤其优选几个、5-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸以任意组合被取代、缺失或添加的变体。
本发明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”形式的蛋白质，或可以是较大蛋白质(例如前体或融合蛋白质)的一部分。通常有利地包括附加氨基酸序列，其含有分泌或前导序列、前序列、辅助纯化的序列(例如多组氨酸残基)，或有利地包括在重组制备中保持稳定的附加序列。此外，也考虑增加外源多肽或脂类尾或多核苷酸序列，从而增加最终分子的免疫原性潜力。
本发明的一个方面涉及包含本发明多肽的基因工程可溶融合蛋白质，或其片段，以及多种亚类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重或轻链恒定区的多个部分。优选的免疫球蛋白是人IgG(尤其是IgG1)的重链的恒定部分，其中融合发生在铰链区。在具体实施方案中，可以通过掺入可被血液凝固因子Xa切割的切割序列而简单地除去Fc部分。
此外，本发明涉及通过基因工程制备这些融合蛋白质的方法，和这些融合蛋白质用于药物筛选、诊断和治疗的用途。本发明的另一方面也涉及编码此类融合蛋白质的多核苷酸。融合蛋白质技术的实例可以在国际专利申请WO94/29458号和WO94/22914号中找到。
蛋白质可以通过化学方法缀合，或作为重组融合蛋白质表达，与非融合蛋白质相比较，该融合蛋白质可以增加在表达系统中产生的水平。融合配偶体可以协助提供T辅助细胞表位(免疫融合配偶体)，优选由人识别的T辅助细胞表位，或可以协助表达比天然重组蛋白质产量更高的蛋白质(表达增强子)。优选的融合配偶体既是免疫融合配偶体，也是增强表达的配偶体。
融合配偶体包括来自流感嗜血菌(EP594610)的蛋白质D和来自流感病毒NS1的非结构型蛋白质(血凝素)。另一个融合配偶体是已知为Omp26(WO 97/01638)的蛋白质。另一个融合配偶体是已知为LytA的蛋白质。优选使用该分子的C末端部分。LytA是衍生自合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(酰胺酶LytA)的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，该酶(由lytA基因{Gene,43(1986)，265-272页}编码)是自溶素，其特异性降解肽聚糖主链的某些键。LytA蛋白质的C末端结构域负责与胆碱或某些胆碱类似物(例 如DEAE)的亲和性。该特性可以用于开发用于融合蛋白质表达的大肠杆菌C-LytA表达质粒。氨基末端含有C-lytA片段的杂化物蛋白质的纯化在{Biotechnology:10,(1992)，795-798页}中描述。可以使用LytA分子C末端从178残基开始的重复部分，例如残基188-305。
本发明也包括上述多肽的变体，即通过保守氨基酸取代而与参照物不同的多肽，其中残基被另一个具有类似特性的残基所取代。通常此类取代在丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中；在丝氨酸和苏氨酸中；在酸性残基天冬氨酸和谷氨酸中；在天冬酰胺和谷氨酰胺中；和在碱性残基赖氨酸和精氨酸中；或在芳香族残基苯丙氨酸和酪氨酸中。
本发明的多肽可以用任意合适的方法制备。此类多肽包括分离的天然存在的多肽、重组产生的多肽、合成产生的多肽、或这些方法组合产生的多肽。制备此类多肽的方法是本领域熟知的。
最优选本发明的多肽衍生自非典型流感嗜血菌，然而，也可以优选从其他相同分类学属的生物中获得。本发明的多肽也可以例如从相同分类学科或目的生物中获得。
多核苷酸
本发明的一个目标是提供编码蛋白质E多肽的多核苷酸，尤其是编码本文称为蛋白质E的多肽的多核苷酸。
在本发明尤其优选的实施方案中，多核苷酸包含编码含SEQ ID NO:11所示序列(包括全长基因)的蛋白质E多肽的区域或其变体。
SEQ ID NO:11提供的蛋白质E多核苷酸是来自非典型流感嗜血菌菌株772的蛋白质E多核苷酸。确定为来自流感嗜血菌菌株的蛋白质E的编码基因的其他序列在表1中列出。
本发明的另一方面提供编码和/或表达蛋白质E多肽和多核苷酸的分离的核酸分子，尤其是编码非典型流感嗜血菌蛋白质E多肽和多核苷酸的分离的核酸分子，其包括例如未加工的RNA、核酶RNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、B-和Z-DNA。本发明的其他实施方案包括在生物学上、诊断上、预防上、临床上或治疗上有用的多核苷酸和多肽、和其变体、和包 含这些的组合物。
本发明的另一方面涉及编码具有SEQ ID NO:1-10推导的氨基酸序列的蛋白质E多肽的分离的多核苷酸(包括至少一种全长基因)，和紧密相关的多核苷酸和其变体。
本发明的另一个尤其优选的实施方案涉及来自非典型流感嗜血菌的蛋白质E多肽，其包含或包括选自SEQ ID NO:1-10的氨基酸序列或其变体。
使用本文提供的信息，例如SEQ ID NO:11所示的多核苷酸序列，本发明编码蛋白质E多肽的多核苷酸可以用标准克隆和筛选方法获得，例如那些用于以非典型流感嗜血菌菌株3224A(或772)细胞作为起始材料从细菌中克隆和测序染色体DNA片段的方法，随后获得全长克隆。例如，为获得本发明的多核苷酸序列，例如SEQ ID NO:0中给出的多核苷酸序列，通常用放射标记的寡核苷酸(优选衍生自局部序列的17-mer或更长的寡核苷酸)探针对于大肠杆菌或某些其他合适宿主中的非典型流感嗜血菌菌株3224A(或772)的染色体DNA克隆文库进行探测。然后可以用严格杂交条件区分出携带与探针一致的DNA的克隆。用由原始多肽或多核苷酸序列设计的测序引物对杂交鉴定的单个克隆进行测序，可以在两个方向延伸多核苷酸序列从而确定全长基因序列。方便地，例如使用从质粒克隆制备的变性双链DNA来进行此类测序。合适的技术在Maniatis,T.,Fritsch,E.F.和Sambrook等人,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,第二版；Cold Spring Harbor Laboratory出版,Cold Spring Harbor,纽约(1989)中描述。(具体见杂交筛选1.90和变性双链DNA模板测序13.70)。也可以进行直接基因组DNA测序从而获得全长基因序列。如本发明举例的，SEQ ID NO:11所示多核苷酸是在源自非典型流感嗜血菌的DNA文库中发现的。
而且，SEQ ID NO:11所示的各DNA序列包含编码蛋白质的可读框，该蛋白质具有近似于SEQ ID NO:1所示的氨基酸残基数，并具有可以用本领域技术人员熟知的氨基酸残基分子量值计算的推导分子量。
SEQ ID NO:0的多核苷酸的起始密码子和终止密码子之间分别编码SEQ ID NO:1的多肽。
在另一方面，本发明提供分离的多核苷酸，其包含或包括：
(a)多核苷酸序列，其在SEQ ID NO:0的多核苷酸序列的全长上与SEQ ID NO:11的任意多核苷酸序列具有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％同一性或完全同一性；或
(b)多核苷酸序列，其编码多肽，所述多肽在SEQ ID NO:1-10的氨基酸序列(或片段)的全长上与选自SEQ ID NO:1-10的任意氨基酸序列(或其片段)具有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％同一性或100％完全同一性。
获得编码本发明多肽的多核苷酸(包括来自非典型流感嗜血菌以外的种的同源物和直向同源物)的方法包括在严格性杂交条件下(例如使用范围为45-65℃的温度和SDS浓度为0.1-1％)，用包括或包含选自SEQ ID NO:11的任意序列或其片段标记的或可检测的探针筛选适当文库的步骤；和分离含有所述多核苷酸序列的全长基因和/或基因组克隆的步骤。
本发明提供在其全长上与SEQ ID NO:11所示的编码序列(可读框)相同的多核苷酸序列。本发明也提供成熟多肽或其片段本身的编码序列，以及与其他编码序列在同一读码框内的成熟多肽或片段的编码序列，例如编码前导或分泌序列、前-或原-蛋白质序列或前蛋白原序列。本发明的多核苷酸也可以包含至少一个非编码序列，其包括但不限于例如至少一个非编码的5’和3’序列，例如被转录但不被翻译的序列、终止信号(例如rho依赖的和非rho依赖的终止信号)、核糖体结合位点、Kozak序列、稳定mRNA的序列、内含子和多腺苷酸化信号。多核苷酸序列也可以包含编码附加氨基酸的附加编码序列。例如，编码利于融合多肽纯化的标记序列。在本发明的某些实施方案中，标记序列是6-组氨酸肽，如pQE载体(Qiagen,Inc.)所提供的，其在Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA86:821-824(1989)中描述，或者是HA肽标记(Wilson等人，Cell37:767(1984))，两者都可 以用于纯化与它们融合的多肽序列。本发明的多核苷酸也包括但不限于含有结构基因和与其天然结合的控制基因表达的序列的多核苷酸。
SEQ ID NO:1-10的蛋白质E多肽的编码核苷酸序列可以与SEQ ID NO:11的相应多核苷酸编码序列(或包含于SEQ ID NO:11中的相应多核苷酸编码序列)一致。可选择地，其可以是由遗传密码冗余(简并)而得到的任意序列，也编码SEQ ID NO:1-10的多肽。
本文所用术语“编码多肽的多核苷酸”包括具有本发明多肽的编码序列的多核苷酸，该多肽尤其是细菌多肽和更尤其是具有SEQ ID NO:1-10中任一序列所示氨基酸序列的非典型流感嗜血菌蛋白质E多肽或其片段。该术语也包括具有编码多肽的单个连续区或不连续区(例如被整合的噬菌体、整合的插入序列、整合的载体序列、整合的转座子序列间断的多核苷酸，或由于RNA编辑或基因组DNA重组引起间断的多核苷酸)，以及附加区(也可以包括编码和/或非编码序列)的多核苷酸。
本发明还涉及本文所述的多核苷酸的变体，其编码具有SEQ ID NO:1-10的任意序列推导的氨基酸序列的多肽的变体。本发明多核苷酸的片段可以用于例如合成本发明的全长多核苷酸。
优选的片段是编码B细胞表位的那些多核苷酸，例如在实施例10中描述的片段/肽，和包含所述多核苷酸片段的重组、嵌合基因。
更优选的实施方案是蛋白质E变体的编码多核苷酸，该变体具有SEQ ID NO:1-10的任意序列的蛋白质E多肽的氨基酸序列，其中几个、少数、5-10、1-5、1-3、2、1个或没有氨基酸残基以任意组合被取代、修饰、缺失和/或添加。其中尤其优选沉默取代、添加和缺失，即不改变蛋白质E多肽的性质和活性(例如实施例部分所述的性质)。
本发明更优选的实施方案是在其全长上与具有SEQ ID NO:1-10的氨基酸序列所示任一蛋白质E多肽的编码多核苷酸有至少85％同一性的多核苷酸，和与该多核苷酸互补的多核苷酸。可择地，最优选包含在其全长上与蛋白质E多肽的编码多核苷酸有至少90％同一性的区域的多核苷酸和与其互补的多核苷酸。在此方面，尤其优选在其全长上与上述多核苷酸 有至少95％同一性的多核苷酸。此外，在至少95％同一性的多核苷酸中更优选具有至少97％同一性的多核苷酸，和尤其更优选至少98％和至少99％同一性的多核苷酸，更优选至少99％同一性的多核苷酸。
优选的实施方案是基本保留与选自SEQ ID NO:11的DNA序列编码的成熟多肽有相同生物学功能或活性(例如本文实施例部分所述的活性)的多肽的编码多核苷酸。
本发明的某些优选实施方案提供尤其在严格性条件下与蛋白质E多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:11的多核苷酸)杂交的多核苷酸。
本发明还涉及与本文提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸。在此方面，本发明尤其涉及在严格性条件下与本文所述多核苷酸杂交的多核苷酸。本文所用术语“严格性条件”和“严格性杂交条件”指仅在有至少95％和优选至少97％同一性的序列之间发生杂交。严格杂交条件的特异性实例是在42℃孵育过夜，溶液包含：50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.β)、5x Denhardt's溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml剪切的变性鲑精DNA，然后在0.1xSSC中于约65℃洗脱杂交支持物。杂交和洗脱条件是熟知的，并在Sambrook,等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)中、尤其在第11章中举例说明。杂交溶液也可以用于本发明提供的多核苷酸序列。
本发明也提供包括或包含由筛选适当文库而获得的多核苷酸序列的多核苷酸或其片段，该文库含有任意SEQ ID NO:11序列所示多核苷酸序列的完全基因，筛选在严格性杂交条件下以具有SEQ ID NO:11相应序列的所述多核苷酸序列的探针进行；并且分离所述多核苷酸序列。用于获得此类多核苷酸的片段包括例如本文所述的探针和引物。
对于本文别处讨论的本发明的多核苷酸测定，例如本发明的多核苷酸可以用作RNA、cDNA和基因组DNA的杂交探针从而分离编码蛋白质E的全长cDNA和基因组克隆，和分离与蛋白质E基因具有高度同一性、尤其是具有高度序列同一性的其他基因的cDNA和基因组克隆。此类探针通 常包含至少15个核苷酸残基或碱基对。优选地，此类探针具有至少30个核苷酸残基或碱基对，和可以具有至少50个核苷酸残基或碱基对。尤其优选探针具有至少20个核苷酸残基或碱基对，和具有少于30个核苷酸残基或碱基对。
可以通过用SEQ ID NO:11提供的DNA序列来合成寡核苷酸探针进行筛选，从而分离蛋白质E基因的编码区。然后使用具有与本发明基因互补的序列的标记寡核苷酸来筛选cDNA、基因组DNA或mRNA文库，从而确定探针与文库中哪些成员杂交。
有几种可行的并且是本领域技术人员所熟知的方法来获得全长DNA或延伸短DNA，例如基于cDNA末端快速扩增的方法(RACE)(见例如Frohman,等人,PNAS USA85:8998-9002,1988)。该技术的最新改进由MarathonTMtechnology(Clontech Laboratories Inc.)举例说明，例如其具有显著简化的较长cDNA查询。在MarathonTMtechnology中，cDNA从所选组织中提取的mRNA制备，并且各末端连接一个“接头”序列。然后用基因特异的和接头特异的寡核苷酸引物的组合进行核酸扩增(PCR)从而扩增DNA“缺失”的5’末端。
然后用“嵌套”引物重复PCR反应，该引物设计为与扩增产物退火(通常为还与接头序列3’退火的接头特异性引物，和还与所选基因序列5’退火的基因特异性引物)。随后可以通过DNA测序来分析该反应的产物，并且通过将产物直接连接于已有DNA而获得完全序列、或用新的序列信息设计5’引物进行分离的全长PCR，来构建全长DNA。
本发明的多核苷酸和多肽可以用作例如发现治疗和诊断疾病(尤其是人类疾病)的研究试剂和材料，正如本文讨论的关于多核苷酸测定。
本发明的多核苷酸是衍生自SEQ ID NO:11序列的寡核苷酸，其可以用于本文所述的方法，但是优选用于PCR，从而确定本文鉴定的多核苷酸是否在感染组织的细菌中被全部或部分转录。认为此类序列也可以用于诊断病原体达到的感染期和感染类型。
本发明也提供编码多肽的多核苷酸，其中多肽是成熟蛋白质加上附加 氨基或羧基端氨基酸、或成熟多肽内部氨基酸(例如当成熟形式具有多于一条肽链时)。此类序列可以在蛋白质从前体到成熟形式的加工过程中起作用，可以允许蛋白质转运，可以延长或缩短蛋白质半衰期或有利于用于控制测定或生产的蛋白质等等。通常在体内的情况下，附加氨基酸可以通过细胞酶从成熟蛋白质经加工除去。
对于本发明的各个多核苷酸，提供其互补多核苷酸。优选这些互补多核苷酸是和与其互补的各个多核苷酸完全互补的。
具有融合于一个或多个前序列的成熟形式多肽的前体蛋白质可以是多肽的非活性形式。当前序列被除去时，此类非活性前体通常被激活。某些或所有前序列可以在激活之前被除去。通常，此类前体称为前蛋白质。
除标准的A、G、C、T/U代表性核苷酸以外，词语“N”也可以用于描述本发明的特定多核苷酸。“N”指在DNA或RNA序列的该指定位点可以出现4个DNA或RNA核苷酸中的任一个，除此之外优选N不是当与临近核苷酸位点组合和当在正确读码框中读码时会在该读码框中产生提前终止密码子的核酸。
总之，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白质、附加前导序列的成熟蛋白质(指前蛋白质)、具有一个或多个非前蛋白质前导序列的原序列的成熟蛋白质前体；或具有前导序列，以及一个或多个原序列的前蛋白原(原蛋白质的前体)，原序列通常在加工步骤中被除去从而产生激活的和成熟形式的多肽。
本发明的一个方面提供本发明多核苷酸用于治疗或预防目的的用途，尤其是用于基因免疫。
本发明的多核苷酸用于基因免疫的用途优选使用合适的递送方法，例如直接向肌肉中注射质粒DNA(Wolff等人,Hum MoI Genet(1992)1:363,Manthorpe等人,Hum.Gene Ther.(1983)4:419)、用特异蛋白质载体递送DNA复合物(Wu等人,J Biol Chem.(1989)264:16985)、DNA与磷酸钙共沉淀(Benvenisty&Reshef,PNAS USA,(1986)83:9551)、DNA包裹在多种形式的脂质体中(Kaneda等人,Science(1989)243:375)、粒子轰击(Tang 等人,Nature(1992)356:152,Eisenbraun等人,DNA Cell Biol(1993)12:791)和用克隆的逆转录病毒载体进行体内感染(Seeger等人,PNAS USA(1984)81:5849)。
载体、宿主细胞、表达系统
本发明也涉及包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体、用本发明载体产生的基因工程宿主细胞和通过重组技术产生的本发明的多肽产物。也使用无细胞翻译系统用衍生自本发明DNA构建体的RNA产生此类蛋白质。
本发明的重组多肽可以通过本领域技术人员熟知的方法从包含表达系统的基因工程宿主细胞制备。相应地，本发明的另一方面涉及包含本发明的一种或多种多核苷酸的表达系统、以该表达系统产生的基因工程宿主细胞和通过重组技术产生的本发明的多肽产物。
对于本发明的重组多肽产物，可以通过基因工程将表达系统或其部分，或本发明的多核苷酸掺入到宿主细胞中。可以通过许多标准实验室手册中描述的方法有效地将多核苷酸引入宿主细胞中，例如Davis,等人,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986)和Sambrook,等人,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory出版,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)，这些方法例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转介、显微注射、阳离子脂类介导的转染、电穿孔、接合、转导、划痕标记(scrape loading)、冲击引入和感染。
合适宿主的代表性实例包括细菌细胞，例如链球菌属(streptococci)、葡萄球菌属(staphylococci)、肠球菌属(enterococci)、大肠杆菌(E.coll)、链霉菌属(streptomyces)、蓝细菌(cyanobacteria)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)和粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)细胞；真菌细胞，例如酵母、克鲁维酵母属(Kluveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、担子菌纲(basidiomycete)、白假丝 酵母(Candida albicans)和曲霉属(Aspergillus)细胞；昆虫细胞，例如果蝇S2和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞，例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑色素瘤细胞；和植物细胞，例如裸子植物或被子植物细胞。
可以使用极为多样的表达系统来产生本发明的多肽。此类载体包括染色体-、游离型-和病毒-衍生的载体等等，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(例如杆状病毒、乳多空病毒(例如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒、微小RNA病毒、逆转录病毒和α病毒)的载体，和衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件(例如粘粒和噬菌粒)的那些载体。表达系统构建体可以包含调控和引起表达的控制区。通常，此种表达可以使用适合于在宿主中维持、繁殖或表达多核苷酸和/或表达多肽的任意系统或载体。可以通过多种熟知和常规技术将适当的DNA序列插入到表达系统中，例如Sambrook等人,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,(如上)中的技术。
在真核重组表达系统中，为了将翻译的蛋白质分泌到内质网腔、周质空间或细胞外环境去，可以在表达的多肽中掺入适当的分泌信号。这些信号可以是多肽内源的或异源的信号。
本发明的多肽可以通过熟知方法从重组细胞培养物中复性和纯化，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选使用金属离子亲和层析(IMAC)进行纯化。当多肽在细胞内合成、分离和纯化过程中变性时，可以使用蛋白质重折叠的熟知技术恢复活性构象。
表达系统也可以是重组的活微生物，例如病毒或细菌。目的基因可以插入到活的重组病毒或细菌的基因组中。用此类活载体接种和体内感染会导致抗原的体内表达和诱导免疫应答。为此目的使用的病毒和细菌是例如：痘病毒(例如牛痘、禽痘、金丝雀痘(canarypox))、α病毒(辛德比斯病 毒(Sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)、Venezuelian马脑炎病毒(Venezuelian Equine Encephalitis Virus))、腺病毒、腺伴随病毒、微小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)、疱疹病毒(水痘带状病毒等等)、利斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、BCG、链球菌属。这些病毒和细菌可以是有毒的或以多种方式减毒的，从而获得活疫苗。此类活疫苗也形成本发明的部分。
诊断、预测、血清分型和突变测定
本发明也涉及本发明的蛋白质E多核苷酸和多肽用作诊断试剂的用途。在真核生物(尤其是哺乳动物、而且尤其是人类)中检测蛋白质E多核苷酸和/或多肽可以提供诊断疾病、疾病分期或感染生物体对药物的响应的诊断方法。可以通过多种熟知技术和本文提供的方法在核酸或氨基酸水平上检测真核生物、尤其哺乳动物、和尤其人类、尤其那些被含蛋白质E基因或蛋白质的生物体感染或疑似感染的人类。
用于预测、诊断或其他分析的多肽和多核苷酸可以获自推测被感染和/或感染的个体的机体材料。来自任意这些来源的多核苷酸(尤其是DNA或RNA)可以直接用于检测，或在分析之前用PCR或任意其他扩增技术酶性扩增。RNA(尤其mRNA)、cDNA和基因组DNA也可以以相同方式使用。使用扩增，可以通过分析生物体的所选多核苷酸的基因型来表征个体中存在的感染或定居生物体的种和菌株。可以通过与选自相关生物体的参考序列的基因型比较扩增产物的大小变化来检测缺失和插入，相关生物体优选同属不同种或同种不同菌株。可以通过将扩增的DNA和标记的蛋白质E多核苷酸序列杂交来鉴定点突变。对DNA或RNA分别通过DNA酶或RNA酶消化、或通过检测解链温度或复性动力学的差异，来区分完全或显著匹配的序列和不完全或更显著不匹配的双链体。也可以通过与参考序列相比多核苷酸片段在凝胶上电泳迁移率的改变来检测多核苷酸序列的差异。可以使用或不使用变性试剂来进行。也可以通过直接DNA或RNA测序来检测多核苷酸差异。例如见Myers等人,Science,230:1242(1985)。也可以通过核酸酶保护测定(例如RNA酶)、VI和SI保护测定或化学裂解方 法来显示特异位点的序列改变。例如见Cotton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(1985)。
在另一个实施方案中，构建包含蛋白质E核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针阵列从而引导例如遗传突变、血清分型、分类学分类或鉴定的有效筛选。阵列技术方法是熟知的并具有广泛应用性，并且可以用于解决多种分子遗传方面的问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异性(例如见Chee等人,Science,274:610(1996))。
因此，本发明的另一方面涉及诊断药盒，其包含：
(a)本发明的多核苷酸，优选SEQ ID NO:11的任意核苷酸序列，或其片段；
(b)与(a)互补的核苷酸序列；
(c)本发明的多肽，优选SEQ ID NO:1-10的任一多肽或其片段；或
(d)本发明多肽的抗体，优选SEQ ID NO:1-10的任一多肽。
应该理解在任意此类药盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可以包含基本成分。这样的药盒可以用于诊断疾病或对疾病的易感性，等等。
本发明也涉及本发明多核苷酸用作诊断试剂的用途。检测与疾病或致病性相关的本发明多核苷酸(优选SEQ ID NO:11的任意序列)的突变形式，可以提供诊断工具来增加或定义对由多核苷酸表达不足、过表达或表达改变引起的疾病的诊断、病程预测、疾病期确定或疾病易感性确定。可以通过例如本文描述的多种技术在多核苷酸水平上检测携带此类多核苷酸突变的生物体(尤其是感染的生物体)。
来自携带本发明多核苷酸和/或多肽的突变体或多态形式(等位基因变体)生物体的细胞也可以通过多种技术在多核苷酸或多肽水平上被检测，从而例如允许用于血清分型。例如可以用RT-PCR检测RNA中的突变。尤其优选使用结合自动化检测系统的RT-PCR，例如GeneScan。为同样目的PCR中也可以使用RNA、cDNA或基因组DNA。作为一个实例，使用与编码蛋白质E多肽的多核苷酸互补的PCR引物来鉴定和分析突变。
本发明还提供5’和/或3’端除去1、2、3或4个核苷酸的引物。这些引 物可以用于扩增来自个体样品(例如机体材料)的蛋白质E DNA和/或RNA。该引物可以用于扩增从感染个体分离的多核苷酸，然后通过多种技术来阐明这些多核苷酸的序列。以这种方式，可以检测到多核苷酸序列中的突变，并可将其用于诊断和/或预测感染或感染期或病程，或者用于血清分型和/或感染物分类。
本发明还提供诊断疾病、优选细菌感染、更优选由非典型流感嗜血菌引起的感染的方法，其包含从来自个体的样品(例如机体材料)中检测具有SEQ ID NO:11任意序列的多核苷酸的表达水平的提高。可以用任意本领域熟知的多核苷酸定量方法测量蛋白质E多核苷酸表达的增加或减少，例如扩增、PCR、RT-PCR、RNA酶保护、Northern印迹、光谱测定和其他杂交方法。
另外，本发明用于检测与正常对照组织样品相比较蛋白质E多肽过表达的诊断测定可以用于检测例如感染的存在。在来自宿主的样品(例如机体材料)中确定蛋白质E多肽水平所使用的测定技术是本领域技术人员所熟知的。此类测定方法包括放射免疫测定法、竞争性结合测定法、Western印迹分析、抗体夹心测定法、抗体检测和ELISA测定。
本发明的多核苷酸可以用作多核苷酸阵列的成分，优选用于高密度阵列或载网。这些高密度阵列尤其用于诊断和预测目的。例如包含不同基因和还包含本发明一种或多种多核苷酸的一系列点，可以用作例如在杂交或核酸扩增中所用的获自或衍生自机体样品的探针，来确定个体中特定多核苷酸序列或相关序列的存在。此类存在可以表示病原体(尤其是非典型流感嗜血菌)的存在，并且可以用于诊断和/或预测疾病或病程。优选包含SEQ ID NO:11任意多核苷酸序列的多种变体的网格。也优选包含SEQ ID NO:1-10任意多肽序列的编码多核苷酸序列的许多变体。
抗体
本发明的多肽和多核苷酸或其变体、或表达其的细胞可以用作免疫原从而产生分别对此类多肽或多核苷酸特异免疫专一的抗体。可选地，多肽序列中的表位的模拟表位(尤其是肽模拟表位)也可以用作免疫原从而产生 对本发明多肽特异免疫专一的抗体。术语“特异免疫专一”指总体上抗体对本发明的多肽比对现有技术中其他相关多肽具有更高的亲和力。
本发明的某些优选实施方案提供抗蛋白质E多肽或多核苷酸的抗体。
本发明的多肽或多核苷酸的抗体可以通过以下方式获得：以常规方法向动物(优选非人类)施用本发明的多肽和/或多核苷酸、或它们之一或两者的表位携带片段、它们之一或两者的同源物、或表达它们之一或两者的细胞。为制备单克隆抗体，可以使用本领域已知的通过培养传代细胞系产生抗体的任意技术。实例包括多种技术，例如在Kohler,G.和Milstein,C,Nature256:495-497(1975)；Kozbor等人,Immunology Today4:72(1983)；Cole等人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,77-96页，Alan R.Liss,Inc.(1985)中所述。
产生单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)适合于产生本发明多肽或多核苷酸的单链抗体。同时，可以用转基因小鼠、转基因其他生物体或动物(例如其他哺乳动物)来表达对本发明多肽或多核苷酸特异免疫专一的人源化抗体。
可选择地，可以利用噬菌体展示技术从筛选具有抗蛋白质E的人淋巴细胞PCR扩增的v-基因的所有组成成分中或从天然文库中筛选与本发明多肽有结合活性的抗体基因(McCafferty,等人,(1990),Nature348,552-554；Marks,等人,(1992)Biotechnology10,779-783)。也可以通过例如链改组来改良这些抗体的亲和力(Clackson等人,(1991)Nature352:628)。
上述抗体可以用于分离或鉴定表达本发明多肽或多核苷酸的克隆，从而通过例如亲和层析来纯化该多肽或多核苷酸。
因此，除此之外蛋白质E多肽或蛋白质E多核苷酸的抗体可以用于治疗感染，尤其是细菌感染。
包括抗原的、表位的或免疫的等同变体的多肽变体构成本发明的特定方面。
优选地，修饰抗体或其变体，使其在个体中具有较小的免疫原性。例如，如果个体是人类，那么抗体最优选是“人源化的”，其中互补决定区 或杂交瘤衍生的抗体区被移植到人单克隆抗体中，例如在Jones等人(1986),Nature321,522-525或Tempest等人,(1991)Biotechnology9,266-273中描述的。
拮抗剂和激动剂-测定和分子
本发明的多肽和多核苷酸也可以用于评测小分子底物和配体的结合，例如在细胞、无细胞制剂、化学文库和天然产物混合物中。这些底物和配体可以是天然底物和配体、或是结构或功能模拟物。例如见Coligan等人,Current Protocols in Immunology1(2)，第5章(1991)。
筛选方法可以通过标记直接或间接与候选化合物结合的方式从而简单地测量候选化合物与多肽或多核苷酸的结合、或与细胞或细胞膜携带的多肽或多核苷酸的结合、或多肽的融合蛋白质的结合。可选择地，筛选方法包括与标记的竞争物竞争。此外，这些筛选方法使用适合于包含多肽或多核苷酸的细胞的检测系统，可以测试候选化合物是否通过激活或抑制多肽或多核苷酸从而产生信号。通常在存在已知激动剂时测定激活的抑制剂，并且在存在候选化合物时观察激动剂对激活的作用。组成型激活的多肽和/或组成型表达的多肽和多核苷酸可以用于反转激动剂或抑制剂的筛选方法，该方法在缺乏激动剂或抑制剂的情况下，通过测试候选化合物是否抑制多肽或多核苷酸(视情况而定)的激活。此外，筛选方法可以简单地包括将候选化合物与含本发明多肽或多核苷酸的溶液混合的步骤，从而形成混合物，测量混合物中蛋白质E多肽和/或多核苷酸的活性，并且将其与标准相比较。上述融合蛋白质(例如Fc部分和蛋白质E多肽形成的融合蛋白质)也可以用于高通量筛选测定从而鉴定本发明多肽和系统发育和/或功能上相关的多肽的拮抗剂(见D.Bennett等人,J MoI Recognition,8:52-58(1995)；和K.Johanson等人,J Biol Chem,270(16):9459-9471(1995))。
与本发明的多肽结合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和抗体也可以用于检测细胞中所加入的化合物对mRNA和/或多肽产生的作用的构型筛选方法。例如，可以用单克隆和多克隆抗体通过本领域已知的标准方法构建 ELISA测定方法来测量多肽的分泌或结合细胞的水平。可以用该方法从适当处理的细胞或组织中发现抑制或增强多肽产生的因子(也分别称为拮抗剂或激动剂)。
本发明也提供筛选化合物的方法，以鉴定那些增强(激动剂)或阻断(拮抗剂)蛋白质E多肽或多核苷酸作用的化合物，尤其是那些制菌和/或杀菌的化合物。筛选方法可以包括高通量技术。例如，为筛选激动剂或拮抗剂，含有蛋白质E多肽和该多肽的标记底物或配体的合成反应混合物、细胞区室(例如细胞膜、胞外被膜或细胞壁)、或任意其制品在缺乏或存在可能是蛋白质E激动剂或拮抗剂的候选分子的情况下孵育。候选分子激动或拮抗蛋白质E多肽的能力反映在减少标记配体的结合或降低来自该底物的产物的产生。自然结合的分子(即不需诱导蛋白质E多肽的作用)最可能是好的拮抗剂。结合良好并且根据具体情况，增加从底物产生产物的速率、增加信号转导或增加化学通道活性的分子是激动剂。根据具体情况，可以通过使用报告系统来增进从底物产生产物的速率或水平、信号转导、或化学通道活性的检测。在此方面可以使用的报告系统包括但不限于显色法、转换为产物的标记底物、负责改变蛋白质E多核苷酸或多肽活性的报告基因和本领域公知的结合测定。
蛋白质E激动剂测定方法的另一个实例是竞争性测定，即在对竞争性抑制测定合适的条件下，将蛋白质E和可能的激动剂与蛋白质E结合分子、重组蛋白质E结合分子、天然底物或配体、或模拟底物或配体相结合。例如通过放射性或显色化合物可以将蛋白质E标记，从而精确地确定结合于结合分子或转换为产物的蛋白质E分子的量，来评价可能的拮抗剂的效应。
可能的拮抗剂包括结合于本发明多核苷酸和/或多肽并由此抑制或消减其活性或表达的有机小分子、肽、多肽和抗体。可能的拮抗剂也可以是与结合分子结合于相同位点的有机小分子、肽、多肽(例如紧密相关的蛋白质)或抗体，例如不诱导蛋白质E诱导的活性的结合分子，从而通过排除蛋白质E多肽和/或多核苷酸的结合来阻止其作用或表达。
可能的拮抗剂包括结合并占据多肽结合位点的小分子，由此阻止细胞 结合分子的结合，从而阻止正常的生物活性。小分子的实例包括但不限于有机小分子、肽或肽类分子。其他可能的拮抗剂包括反义分子(这些分子的描述见Okano,J.Neurochem.56:560(1991)；OLIGODEOXY-NUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION,CRC出版,Boca Raton,FL(1988))。优选的可能拮抗剂包括蛋白质E的相关化合物和变体。
本发明的另一方面涉及包含本发明多肽的基因工程可溶融合蛋白质，或其片段，和多种亚类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重链或轻链恒定区的多个部分。优选免疫球蛋白是人IgG(优选IgG1)的重链的恒定部分，其中融合发生在铰链区。在特定实施方案中，通过掺入可被血液凝固因子Xa切割的切割序列可容易地将Fc部分除去。此外，本发明涉及通过基因工程制备这些融合蛋白质的方法，和其用于药物筛选、诊断和治疗的用途。本发明的另一方面也涉及编码此类融合蛋白质的多核苷酸。融合蛋白质技术的实例可以在国际专利申请WO94/29458号和WO94/22914号中找到。
本文提供的各多核苷酸序列可以用于抗菌化合物的发现和开发。表达的编码蛋白质可以用作筛选抗菌药物的靶。另外，编码该编码蛋白质氨基末端区域、或SD序列或其他有利于各自mRNA翻译的序列的多核苷酸序列可以用于构建反义序列从而控制目的编码序列的表达。
本发明也提供本发明的多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂用于干涉病原体与真核(优选哺乳动物)宿主之间造成感染后遗症的原始物理相互作用的用途。具体地，本发明的分子可以用于：预防细菌(尤其是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌)粘附于真核生物(优选哺乳动物)内在装置或创伤部位的细胞外基质蛋白质；阻断与真核生物(优选哺乳动物)细胞外基质蛋白质的细菌粘附和介导组织损伤的细菌蛋白质E蛋白质之间的细菌粘附，和/或阻断原始感染的正常发病进程，而不是通过植入内在装置或通过其他外科技术。
本发明的另一方面还提供蛋白质E激动剂和拮抗剂，优选制菌或杀菌的激动剂和拮抗剂。
本发明的拮抗剂和激动剂可以用于例如预防、抑制和/或治疗疾病。
本发明的另一方面涉及本发明多肽的模拟表位。模拟表位是极为类似于(序列上或结构上)天然肽的肽序列，其能够被识别天然肽的抗体识别；或当其与合适载体配对时能够产生识别天然肽的抗体。
可以通过所选氨基酸的添加、缺失或取代来设计用于特定目的的肽模拟表位。因此，为易于与蛋白质载体结合的目的可以对肽进行修饰。例如，为了某些化学结合方法期望包括末端半胱氨酸。另外，为了结合于蛋白质载体的肽期望包括肽结合端远端的疏水末端，从而使肽游离的非结合末端保持与载体蛋白质表面的结合。由此肽呈现最接近整体天然分子中发现的肽的构象。例如可以将肽改变为具有N-端半胱氨酸和C-端疏水酰胺尾。可选择地，添加或取代一个或多个氨基酸(反向序列)的D-立体异构体，从而可以产生有益的衍生物，例如增强肽稳定性的衍生物。模拟表位也可以是天然肽序列的逆向序列，即序列的方向是反向的。模拟表位也可以是特征上逆向相反的。逆向相反和逆向相反的肽在WO 95/24916和WO94/05311中描述。
可选择地，肽模拟表位可以用能够结合于本发明多肽的抗体通过例如噬菌体展示技术(EP 0 552 267 Bl)来鉴定。该技术产生大量模拟天然肽结构的肽序列，因此能够结合天然肽的抗体，而不必需其本身具有与天然肽显著同源的序列。
疫苗
本发明的另一方面涉及在个体(尤其哺乳动物，优选人类)中诱导免疫应答的方法，其包含以足够产生抗体和/或T细胞免疫应答的蛋白质E多核苷酸和/或多肽、或其片段或变体接种个体，从而使所述个体防御感染、尤其是细菌感染和最尤其是非典型流感嗜血菌感染。本发明也提供此类免疫应答减缓细菌复制的方法。本发明另一方面涉及在个体中诱导免疫应答的方法，其包含向该个体递送核酸载体、序列或核酶从而指导蛋白质E多核苷酸和/或多肽、或其片段或变体的表达，在体内表达蛋白质E多核苷酸和/或多肽、或其片段或变体来诱导免疫应答，例如产生抗体和/或T细胞 (包括例如产生细胞因子的T细胞或细胞毒T细胞)免疫应答，从而不论个体是否罹患疾病，都可以在所述个体(优选人类)中防御疾病。施用基因的一个实例是通过包被颗粒或其他途径加速其进入目的细胞中。此类核酸载体可以包含DNA、RNA、核酶、修饰的核酸、DNA/RNA杂化物、DNA-蛋白质复合物或RNA-蛋白质复合物。
本发明的另一方面涉及引入个体(优选人类)后能够在其中诱导免疫应答的免疫组合物，其在该个体中诱导对蛋白质E多核苷酸和/或编码多肽的免疫应答，其中组合物包含重组蛋白质E多核苷酸和/或编码多肽，和/或包含编码和表达所述蛋白质E多核苷酸和/或编码多肽、或本发明其他多肽的抗原的DNA和/或RNA。免疫应答可以在治疗上或预防上应用，并且形成抗体免疫和/或细胞免疫，例如由CTL或CD4+T细胞引起的细胞免疫。
蛋白质E多肽或其片段可以与辅助蛋白质(co-protein)或化学部分融合，这些部分本身可以产生或不产生抗体，但是能够稳定第一蛋白质和产生具有抗原和/或免疫性质、优选防护性质的融合或修饰蛋白质。因此，融合的重组蛋白质优选还包含抗原性辅助蛋白质，例如脂蛋白或来自流感嗜血菌的蛋白质D(EP 594610)、谷胱甘肽转移酶(GST)或β-半乳糖苷酶、或任意其他使蛋白质溶解和利于其产生和纯化的相对大的辅助蛋白质。而且，辅助蛋白质可以充当佐剂从而引起接受蛋白质的生物体的免疫系统产生全身性刺激。辅助蛋白质可以附加到第一蛋白质的氨基-或羧基-末端。
本发明的疫苗组合物、蛋白质E多肽和/或多核苷酸，或其片段、模拟表位或变体，可以存在于载体中，例如上述活的重组载体中，例如活的细菌载体。
对于蛋白质E多肽，非活载体也是合适的，例如细菌外膜小泡或“疱(blebs)”。OM疱衍生自革兰氏阴性细菌的双层膜的外膜，并且在许多革兰氏阴性细菌中被证明(Zhou,L等人1998.FEMS Microbiol.Lett.163:223-228)，包括C.trachomatis和C.psittaci。报道过的产生疱的细菌病原体的非详尽名单也包括：百日咳博德特式菌(Bordetella pertussis)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、羊布鲁氏菌(Brucella ovis)、大肠杆菌、流感嗜血菌、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)、粘膜炎莫拉菌、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)。
疱的优点在于提供天然构象的外膜蛋白质，并因此尤其可用于疫苗。针对疫苗用途，疱也可以通过改造细菌以修饰一个或多个外膜上分子的表达而得到改良。因此例如可以引入或上调目的免疫原性蛋白质(例如蛋白质E多肽)在外膜上的表达(例如通过改变启动子)。替代的或另外的，可下调不相关的(例如非保护性抗原或免疫显性但是可变的蛋白质)或有害的(例如毒性分子例如LPS、或自身免疫应答的可能诱导物)外膜分子的表达。这些途径在下面更详细的论述。
蛋白质E基因的非编码侧翼区包含对于基因表达重要的调控元件。此类调控在转录和翻译水平上发生。在基因可读框上游或下游的这些区域的序列可以通过DNA测序而获得。该序列信息可以确定可能的调控基序，例如不同的启动子元件、终止子序列、可诱导序列元件、阻抑物、负责相转变的元件、SD序列、具有可能涉及调控的二级结构的区域、以及其他类型的调控基序或序列。该序列是本发明的另一方面。
这些序列信息调控蛋白质E基因的天然表达。可以通过改变启动子、SD序列、可能的阻抑或操纵元件或其他相关元件来实现基因表达的上调。同样，可以通过相似类型的修饰来实现表达的下调。可选择地，通过改变相转变序列，可以将基因的表达置于相转变控制下，或与该调控解耦合。对于另一途径，可以将基因的表达置于一个或多个可诱导元件的控制下，从而调控表达。此类调控的实例包括但不限于变温诱导、添加诱导底物(如所选的糖类或其衍生物、微量元素、维生素、辅助因子、金属离子等等)。
上述此类修饰可以通过几种不同方法引入。基因表达中涉及的序列修饰可以在体内通过随机诱变进行，随后筛选所希望的表型。另一途径包括分离目的区域和通过随机诱变、或位点定向取代、插入或缺失诱变对其进行修饰。然后将修饰的区域通过同源重组再插入到细菌基因组中，并评测 对基因表达的作用。在另一途径中，可以使用目的区域的序列信息来取代或删除所有或部分天然调控序列。在此情况下，分离和修饰靶向的调控区，使其包含另一基因的调控元件、不同基因的调控元件的组合、合成的调控区或任意其他调控区，或者删除野生型调控序列的所选部分。这些修饰的序列随后可以通过同源重组再插入到细菌基因组中。可以用于上调基因表达的优选的启动子的非详尽名单包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌的启动子porA、porB、lbpB、tbpB、pllO、lst、hpuAB；ompCD、copB、lbpB、ompE、UspA1；UspA2；来自粘膜炎莫拉菌的TbpB；来自流感嗜血菌的p1、p2、p4、p5、p6、lpD、tbpB、D15、Hia、Hmw1、Hmw2。
在一个实施例中，可以通过用强启动子交换其启动子(通过分离基因的上游序列，体外修饰该序列并通过同源重组再引入基因组)来调节基因的表达。可以在细菌和从细菌脱落(制造)的外膜囊泡中获得上调的表达。
在其他实施例中，所述途径可以用于为疫苗应用产生具有改良性质的重组细菌菌株。这些可以是(但不限于)减毒菌株、所选抗原表达增加的菌株、敲除(或降低表达)干涉免疫应答的基因的菌株、免疫显性蛋白质调节性表达的菌株、外膜囊泡调节性脱落的菌株。
因此，本发明也提供蛋白质E基因的修饰的上游区域，该修饰的上游区域包含改变位于外膜的蛋白质E蛋白质表达水平的异源调控元件。本发明此方面的上游区域包括蛋白质E基因的上游序列。该上游区域刚好起始于蛋白质E基因的上游，并且通常延续到基因ATG起始密码子上游不超过约1000bp的位点。对于基因位于多顺反子序列(操纵子)中的情况，上游区域可以刚好起始于目的基因前面、或操纵子中第一基因的前面。优选地，本发明此方面的修饰的上游区域在ATG上游500到700bp之间的位点包含异源启动子。
所公开的上游区域上调蛋白质E基因表达的用途、通过同源重组实现该目的的方法(例如本文引入参考的WO01/09350中所述)、包含适合于此目的的上游序列的载体和如此改变的宿主细胞都是本发明的另外方面。
因此，本发明提供在修饰的细菌疱中的蛋白质E多肽。本发明还提供能够产生基于非活膜疱载体的修饰的宿主细胞。本发明还提供包含蛋白质E基因的核酸载体，该蛋白质E基因具有含异源调控元件的修饰的上游区域。
本发明还提供制备本发明的宿主细胞和细菌疱的方法。
本发明也提供包含本发明多肽和/或多核苷酸和免疫刺激性DNA序列的组合物(尤其是疫苗组合物)和方法，例如Sato,Y.等人Science273:352(1996)中描述的。
本发明也提供在感染非典型流感嗜血菌的动物模型的此类基因免疫实验中使用的多核苷酸构建体中，使用所述编码细菌细胞表面蛋白质的不可变区的多核苷酸或其特定片段的方法。此类实验尤其用于鉴定能够产生预防或治疗性免疫应答的蛋白质表位。相信此途径允许衍生自成功抵抗或清除感染的动物的必需器官的有特定价值的单克隆抗体的此后制备，也允许开发哺乳动物(尤其是人类)中细菌感染的预防药物或治疗方法，尤其是对于非典型流感嗜血菌感染。
本发明也包括包含本发明的免疫原性重组多肽和/或多核苷酸以及合适载体(例如可药用载体)的疫苗制剂。由于多肽和多核苷酸可能在胃中被破坏，因此优选肠胃外施用，包括例如皮下施用、肌肉内施用、静脉施用或真皮内施用。适合于肠胃外施用的制剂包括水的和非水的无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲液、制菌化合物，以及使制剂与体液(优选血液)等渗的溶质；和水的和非水的无菌混悬液，其可以包括悬浮剂或增稠剂。该制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以于冻干条件储存，在使用前仅需要添加无菌液体载体。
本发明的疫苗制剂也可以包括用于增强制剂免疫原性的佐剂系统。优选的佐剂系统优先引起TH1型应答。
免疫应答可以大致分为两种极端种类，即体液或细胞介导的免疫应答(通常分别以抗体和细胞效应子保护机制来表征)。这些应答的分类称为TH1型应答(细胞介导的应答)和TH2型免疫应答(体液应答)。
极端TH1型免疫应答的特征在于产生抗原特异的单元型限制性细胞毒T淋巴细胞，和天然杀伤细胞应答。在小鼠中，TH1型应答通常的特征在于产生IgG2a亚型的抗体，在人类中这些相应于IgG1型抗体。TH2型免疫应答的特征在于产生广泛的免疫球蛋白同种型，包括小鼠中的IgG1、IgA和IgM。
认为这两种类型的免疫应答发展的推动力是细胞因子。高水平的TH1型细胞因子倾向于诱导对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的TH2型细胞因子倾向于诱导对抗原的体液免疫应答。
TH1和TH2型免疫应答的差别不是绝对的。事实上，应描述为个体主要支持TH1免疫应答或主要支持TH2免疫应答。然而，通常方便地认为细胞因子家族为Mosmann和Coffman描述的小鼠CD4+ve T细胞克隆(Mosmann,T.R.和Coffman,R.L.(1989)THl and TH2cells:different patterns of lymphoklne secretion lead to different functional properties.Annual Review of Immunology,7,l45-173页)。通常，TH1型应答伴随T淋巴细胞产生的INF-γ和IL-2细胞因子。通常直接伴随TH1型免疫应答的诱导的其他细胞因子不是由T细胞产生，例如IL-12。相反，TH2型应答伴随IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌。
已知某些疫苗佐剂尤其适合于刺激TH1或TH2型细胞因子应答。通常接种或感染以后最好的免疫应答TH1:TH2平衡指示剂包括直接测量抗原再刺激以后体外T淋巴细胞产生的TH1或TH2细胞因子，和/或测量抗原特异性抗体应答的IgG1:IgG2a比率。
因此，当抗原在体外再刺激时，TH1型佐剂优先刺激分离的T细胞群体以产生高水平的TH1型细胞因子，并促进CD8+细胞毒T淋巴细胞和伴随TH1型同种型的抗原特异性免疫球蛋白应答的发展。
能够优选刺激TH1细胞应答的佐剂在国际专利申请WO 94/00153号和WO 95/17209号中描述。
3去氧酰化单磷酸类脂A(De-O-acylated monophosphoryl lipid A，3D-MPL)就是此类佐剂之一。这从GB2220211(Ribi)获知。化学上其是3 去氧酰化单磷酸类脂A与4、5或6个酰化链的混合物，并且由Ribi Immunochem,Montana制造。3去氧酰化单磷酸类脂A的优选形式在欧洲专利0 689 454Bl(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公开。
优选地，3D-MPL颗粒足够小以致于可以通过0.22微米膜过滤除菌(欧洲专利0 689 454号)。
3D-MPL以10μg-100μg每剂量、优选25-50μg每剂量的范围存在，其中抗原通常以每剂量2-50μg范围存在。
另一个优选的佐剂包含QS21，其为获自Quillaja Saponaria Molina树皮的HPLC纯化的非毒性级分。任选可以将其与3去氧酰化单磷酰脂A(3D-MPL)混合，任选地与载体一起。
产生QS21的方法在美国专利5,057,540号中公开。
先前已经描述了包含QS21的非反应原性的佐剂制剂(WO96/33739)。已表明此类包含QS21和胆固醇的制剂当与抗原配制到一起时是成功刺激TH1的佐剂。
优先刺激TH1细胞应答的其他佐剂包括免疫调节寡核苷酸，例如WO96/02555中公开的未甲基化的CpG序列。
如上所述的不同的刺激TH1的佐剂的组合也估计是优先刺激TH1细胞应答的佐剂。例如QS21可以与3D-MPL配制在一起。QS21:3D-MPL的比例通常是1:10到10:1的级别；优选1:5到5:1和通常基本为1:1。优选的最佳协同作用的范围是3D-MPL:QS21为2.5:1到1:1。
在本发明的疫苗组合物中也优选存在载体。载体可以是水包油乳剂，或铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝。Preferably a carrier is also present in the vaccine composition according to the invention.The carrier may be an oil in water emulsion,or an aluminium salt,such as aluminium phosphate or aluminium hydroxide.
优选的水包油乳剂包含代谢油，例如角鲨烯、α生育酚和吐温80。在尤其优选的方面，在该乳剂中本发明的疫苗组合物中的抗原与QS21和3D-MPL组合。另外的水包油乳剂可以包含span85和/或磷脂酰胆碱和/ 或辛酸甘油酯。
人类通常施用的QS21和3D-MPL在疫苗中以每剂量1-200μg、例如10-100μg、优选10-50μg的范围存在。通常水包油乳剂包含2-10％的角鲨烯、2-10％的α生育酚和0.3-3％的吐温80。角鲨烯:α生育酚的优选比例等于或小于1，因为这样会提供更稳定的乳剂。Span85也可以以1％的水平存在。某些情况下有利的是本发明的疫苗还包含稳定剂。
无毒水包油乳剂优选在水载体中包含无毒油(例如鲨烷或角鲨烯)、乳化剂(例如吐温80)。水载体可以是例如磷酸盐缓冲盐水。
在水包油乳剂中包含QS21、3D-MPL和生育酚的尤其有效的佐剂制剂在WO95/17210中描述。
虽然本发明参考特定蛋白质E多肽和多核苷酸进行描述，但是应该理解其覆盖天然存在的多肽和多核苷酸的片段，和具有添加、缺失或取代而基本上不影响重组多肽或多核苷酸的免疫原性的类似多肽和多核苷酸。优选的片段/肽在实施例10中描述。
本发明也提供包含本发明疫苗制剂与其他抗原组合的多价疫苗组合物，其中其他抗原尤其是用于治疗中耳炎的抗原。此类多价疫苗组合物可以包括上述诱导TH1的佐剂。
在优选实施方案中，本发明的多肽、片段和免疫原与一个或多个如下抗原组配制：(a)一个或多个肺炎球菌荚膜多糖(纯的或结合于载体蛋白质)；(b)一个或多个可以使宿主防御粘膜炎莫拉菌感染的抗原；(c)一个或多个能够使宿主防御肺炎链球菌感染的蛋白质抗原；(d)一个或多个其他非典型流感嗜血菌蛋白质抗原；(e)一个或多个能够使宿主防御RSV的抗原；和(f)一个或多个能使宿主防御流感病毒的抗原。优选组a)和b)；b)和c)；b)、d)和a)和/或c)；b)、d)、e)、f)、和a)和/或c)的组合。此类疫苗可以有利地用作综合中耳炎疫苗(global otitis media vaccine)。
肺炎球菌荚膜多糖抗原优选选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最优选选自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F 和23F)。
优选的肺炎球菌蛋白质抗原是外露于肺炎球菌外表面的那些肺炎球菌蛋白质(在肺炎球菌生活周期过程的至少部分中能够被宿主的免疫系统识别)，或者是由肺炎球菌分泌或释放的蛋白质。最优选的蛋白质是毒素、黏附素、2-组分信号转导物、或肺炎链球菌的脂蛋白，或其片段。尤其优选的蛋白质包括但不限于：肺炎球菌溶血素(优选通过化学处理或突变而去毒)[Mitchell等人Nucleic Acids Res.1990年7月11日；18(13):4010"Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types1and2.",Mitchell等人Biochim Biophys Acta1989年1月23日；1007(1):67-72"Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coll:rapid purification and biological properties.",WO96/05859(A.Cyanamid),WO 90/06951(Paton等人),WO 99/03884(NAVA)]；PspA和其跨膜缺失变体(WO92/14488；WO 99/53940；US5804193–Briles等人)；PspC和其跨膜缺失变体(WO 99/53940；WO97/09994–Briles等人)；PsaA和其跨膜缺失变体(Berry&Paton,Infect Immun1996年12月；64(12):5255-62"Sequence heterogeneity of PsaA,a37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae")；肺炎球菌胆碱结合蛋白质和其跨膜缺失变体；CbpA和其跨膜缺失变体(WO 97/41151；WO 99/51266)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Infect.Immun.199664:3544)；HSP70(WO 96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato等人FEMS Microbiol Lett1998,164:207-14)；M类蛋白质,SB专利申请EP0837130号；和黏附素18627(SB专利申请EP0834568号)。更优选的肺炎球菌蛋白质抗原在WO 98/18931中公开，尤其是WO 98/18930和PCT/US99/30390中选择的蛋白质抗原。
包括在组合疫苗(尤其是预防中耳炎)之内的优选的粘膜炎莫拉菌蛋白质抗原是：OMP106[WO 97/41731(Antex)和WO 96/34960(PMC)]；OMP21；LbpA和/或LbpB[WO 98/55606(PMC)]；TbpA和/或TbpB[WO 97/13785和WO 97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME,等人(1993) Infect.Immun.61:2003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO 93/03761(University of Texas)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EPOO/01468)；lipo06(GB9917977.2)；lipo10(GB9918208.1)；lipo11(GB9918302.2)；lipo18(GB9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)；和OmpE。
包括在组合疫苗(尤其是预防中耳炎)之内的更优选的非典型流感嗜血菌蛋白质抗原包括：丝束蛋白[(US5766608-Ohio State Research Foundation)]和含其肽的融合物[例如LBl(f)肽融合物；US5843464(OSU)或WO 99/64067]；OMP26[WO 97/01638(Cortecs)]；P6[EP281673(纽约州立大学)]；蛋白质D(EP 594610)；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO 94/12641)；P2；P5(WO 94/26304)；NlpC2(BASB205)[WO 02/30971]；Slp(BASB203)[WO 02/30960]；和iOMP1681(BASB210)[WO 02/34772]。
优选的流感病毒抗原包括在蛋或MDCK细胞、或Vero细胞或完整流感病毒体中生长的完整、活的或灭活的病毒、裂解的流感病毒(如在R.Gluck,Vaccine,1992,10,915-920中描述)、或其纯化的或重组的蛋白质，例如HA、NP、NA或M蛋白质、或其组合。
优选的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白质、或其衍生物。
组合物、药盒和施用方法
本发明的另一方面提供包含蛋白质E多核苷酸和/或蛋白质E多肽的组合物，用于向细胞或多细胞生物体施用。
本发明也涉及包含本文所述多核苷酸和/或多肽，或其激动剂或拮抗剂的组合物。本发明的多肽和多核苷酸可以与用于细胞、组织或生物体的有菌或无菌载体组合应用，例如适合于个体施用的药用载体。此类组合物包含例如介质添加剂或治疗有效量的本发明多肽和/或多核苷酸和可药用载体或赋形剂。此类载体可以包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、 甘油、乙醇和其组合。制剂应当适合于施用方式。本发明还涉及包含充满一种或多种上述本发明组合物成分的一种或多种容器的诊断和药物包装和药盒。
本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可以单独使用或与其他化合物(例如治疗化合物)组合使用。
药物组合物可以以任意有效方便的方式施用，包括例如通过局部、口腔、肛门、阴道、静脉、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内等途径施用。
作为治疗或预防，可以向个体施用作为可注射组合物的活性试剂，例如无菌水分散系，优选等渗的。
本发明的另一方面提供包含药学有效量的多肽和/或多核苷酸的药物组合物，例如本发明的多肽和/或多核苷酸、激动或拮抗肽或小分子化合物的可溶形式，其与可药用载体或赋形剂组合。此类载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、和其组合。本发明还涉及包含充满一种或多种上述本发明组合物成分的一种或多种容器的药物包装和药盒。本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可以单独使用或与其他化合物(例如治疗化合物)组合使用。
组合物应适合于施用途径，例如通过全身或经口途径。优选的全身施用形式包括注射，通常通过静脉注射。也可使用其他注射途径，例如皮下的、肌内的或腹膜内的注射。全身施用的可选方式包括使用渗透剂(例如胆盐或夫西地孢酸或其他去污剂)经粘膜和经皮施用。另外，如果本发明的多肽或其他化合物以肠溶剂或微囊制剂形式制备，那么也可以经口施用。这些化合物也可以局部和/或定位施用，形式为软膏剂、糊剂、凝胶剂、溶液剂、粉末剂等等。
对于向哺乳动物(尤其人类)施用，预期活性试剂的每日剂量水平为0.01mg/kg到10mg/kg，通常约为1mg/kg。无论如何，医师将会确定最适合个体并随具体个体的年龄、体重和反应而改变的实际剂量。上述剂量为一般情况的实例。当然，有应用更高或更低剂量范围的个体实例，这些也在本发明的范畴之内。
所需的剂量范围依赖于肽的选择、施用途径、制剂的本性、受试者的自然条件、和主治医师的判断。然而，合适的剂量是在0.1-100μg/kg受试者的范围内。
疫苗组合物方便地为可注射的形式。可以使用常规佐剂从而增强免疫应答。免疫接种的合适单位剂量是0.5-5μg抗原/kg，并且该剂量优选施用1-3次，中间间隔1-3周。用所示剂量范围，没有观察到本发明化合物防碍其施用于合适个体的有害毒理学作用。
然而，考虑到多种有效化合物和多种施用途径的不同功效，所需的剂量预期有广泛改变。例如经口施用预期比静脉注射需要更高的剂量。正如本领域所熟知的，这些剂量水平的改变可以用标准的优化实验程序来校正。
序列数据库、有形介质中的序列、和算法
多核苷酸和多肽序列形成有价值的信息资源，用其可以确定它们的2-和3-维结构，也可以鉴定其他相似同源性的序列。最有利于这些途径的是通过将序列储存到计算机可读介质中，然后将储存的数据用于已知的大分子结构程序或用熟知的查询工具(例如GCG程序包)在序列数据库中查询。
本发明也提供分析特征序列或字符串的方法，尤其是基因序列或编码蛋白质的序列。优选的序列分析方法包括例如序列同源性分析方法(例如同一性和相似性分析)、DNA、RNA和蛋白质结构分析、序列集合、支序分析、序列基序分析、可读框确定、核酸碱基判定、密码子使用分析、核酸碱基修整、和测序色谱峰分析。
提供基于计算机的方法进行同源性鉴定。该方法包含如下步骤：在计算机可读介质中提供包含本发明多核苷酸序列的第一多核苷酸序列；和将所述第一多核苷酸序列与至少一个第二多核苷酸或多肽序列进行比较从而鉴定同源性。
也提供基于计算机的方法进行同源性鉴定，所述方法包含如下步骤：在计算机可读介质中提供包含本发明多肽序列的第一多肽序列；和将所述第一多肽序列与至少一个第二多核苷酸或多肽序列进行比较从而鉴定同 源性。
本说明书中引用的所有的出版物和参考文献、包括但不限于专利和专利申请在本文完整引入作为参考，就如同每一出版物或参考文献在本文明确和单独地完整引入作为参考一样。本申请书优先要求的任意专利申请也以上述出版物和参考文献的方式在本文完整引入作为参考。
定义
“同一性”如本领域所知的，是两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系，根据具体情况通过比较序列来确定。本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间序列相关性的程度，根据具体情况通过此类序列的字符串之间的匹配来确定。“同一性”可以通过已知方法容易地计算，包括但不限于(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编著,Oxford University出版,纽约,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编著,Academic出版,纽约,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第一部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著,Humana出版,新泽西州,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heine,G.,Academic出版,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编著,M Stockton出版,纽约,1991；和Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中描述的方法。确定同一性的方法是给出测试序列之间最大的匹配。而且，确定同一性的方法被编成可公开获得的计算机程序。确定两序列之间同一性的计算机程序方法包括但不限于CGC程序包中的GAP程序(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.215:403-410(1990)和FASTA(Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA85；2444-2448(1988))。BLAST家族程序是可以从NCBI和其他来源可公开获得的(BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda,MD20894；Altschul,S.等人,J.MoI.Biol.215:403-410(1990))。也可以使用熟 知的Smith Waterman算法来确定同一性。
多肽序列比较的参数包括如下：
算法：Needleman和Wunsch,J.MoI Biol.48:443-453(1970)
比较矩阵：BLOSSUM62来自Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992)
空位罚分：8
空位长度罚分：2
使用这些参数的程序是可以作为“空位”程序从Genetics Computer Group,Madison WI公开获得的。上述参数是肽比较的缺省参数(对于末端空位没有罚分)。
多核苷酸比较的参数包括如下：
算法：Needleman和Wunsch,J.MoI Biol.48:443-453(1970)
比较矩阵：匹配＝+10，不匹配＝0
空位罚分：50
空位长度罚分：3
可获得：来自Genetics Computer Group,Madison WI的“空位”程序。这些是核酸比对的缺省参数。
根据具体情况多核苷酸和多肽“同一性”的优选含意在下面(1)和(2)中提供。
(1)多核苷酸实施方案还包括分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:11参考序列具有至少50、60、70、80、85、90、95、97或100％同一性的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可以与SEQ ID NO:11参考序列是相同的，或可以包括与参考序列相比有高达特定整数的核苷酸改变，其中所述改变是选自至少一个核苷酸缺失、取代(包括转换和颠倒)、或插入，并且其中所述改变可以出现在参考核苷酸序列的5’或3’末端位点或这些末端位点之间的任意位置，单独分散于参考序列的核苷酸之中或分散在参考序列中一个或多个连续基团中，并且其中所述的核苷酸改变数的确定是通过将定义同一性百分比的整数除以100再乘以SEQ ID NO:11的核苷酸总 数，然后用所述SEQ ID NO:11核苷酸总数减去该乘积，或：
nn≤xn-(xn·y)
其中nn是核苷酸改变数，Xn是SEQ ID NO:11的核苷酸总数，y对于50％是0.50、对于60％是0.60、对于70％是0.70、对于80％是0.80、对于85％是0.85、对于90％是0.90、对于95％是0.95、对于97％是0.97或对于100％是1.00，并且·是乘法操作的符号，并且其中任意非整数的xn和y的乘积在从xn减去之前要四舍五入为最接近的整数。编码SEQ ID NO:1-10的多肽的多核苷酸序列的改变会在编码序列中产生无义的、错义的或移码突变，由此在此类改变后多核苷酸编码的多肽发生改变。
例如，本发明的多核苷酸序列可以与SEQ ID NO:11参考序列是相同的，即同一性100％，或者其可以包括与参考序列相比较高达特定整数的核酸改变，从而使同一性百分比小于100％。此类改变选自至少一个核酸缺失、取代(包括转换和颠倒)、或插入，并且其中所述改变可以出现在参考多核苷酸序列的5’或3’末端位点或这些末端位点之间的任意位置，单独分散于参考序列的核酸之中或分散在参考序列中一个或多个连续基团中。给定同一性百分比的核苷酸改变数的确定是通过将定义同一性百分比的整数除以100再乘以SEQ ID NO:11的核酸总数，然后用所述SEQ ID NO:11核酸总数减去该乘积，或：
nn≤xn-(xn·y)
其中nn是核酸改变数，xn是SEQ ID NO:11的核酸总数，y例如对于70％是0.70、对于80％是0.80、对于85％是0.85等等，·是乘法操作的符号，并且其中任意非整数的Xn和y的乘积在从Xn减去之前要四舍五入为最接近的整数。
(2)多肽实施方案还包括分离的多肽，其包含与SEQ ID NO:1-10多肽参考序列具有至少50、60、70、80、85、90、95、97或100％同一性的多肽，其中所述多肽序列可以与SEQ ID NO:1-10参考序列是相同的，或可以包括与参考序列相比较高达特定整数的氨基酸改变，其中所述改变选自至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)、或插入，并且其中 所述改变可以出现在参考多肽序列的氨基或羧基末端位点或这些末端位点之间的任意位置，单独分散于参考序列的氨基酸之中或分散在参考序列中一个或多个连续基团中，并且其中所述的氨基酸改变数的确定是通过将定义同一性百分比的整数除以100再乘以SEQ ID NO:1-10的氨基酸总数，然后用所述SEQ ID NO:1-10氨基酸总数减去该乘积，或：
na≤xa-(xa·y)
其中na是氨基酸改变数，Xa是SEQ ID NO:1-10的氨基酸总数，y对于50％是0.50、对于60％是0.60、对于70％是0.70、对于80％是0.80、对于85％是0.85、对于90％是0.90、对于95％是0.95、对于97％是0.97或对于100％是1.00，并且·是乘法操作的符号，并且其中任意非整数的xa和y的乘积在从xa减去之前要四舍五入为最接近的整数。
例如，本发明的多肽序列可以与SEQ ID NO:1-10参考序列是相同的，即同一性100％，或者其可以包括与参考序列相比较高达特定整数的氨基酸改变，从而使同一性百分比小于100％。此类改变选自至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)、或插入，并且其中所述改变可以出现在参考多肽序列的氨基或羧基末端位点或这些末端位点之间的任意位置，单独分散于参考序列的氨基酸之中或分散在参考序列中一个或多个连续基团中。给定同一性百分比的氨基酸改变数的确定是通过将定义同一性百分比的整数除以100再乘以SEQ ID NO:1-10的氨基酸总数，然后用所述SEQ ID NO:1-10氨基酸总数减去该乘积，或：
na≤xa-(xa·y)
其中na是氨基酸改变数，Xa是SEQ ID NO:1-10的氨基酸总数，y例如对于70％是0.70、对于80％是0.80、对于85％是0.85等等，并且·是乘法操作的符号，并且其中任意非整数的xa和y的乘积在从xa减去之前要四舍五入为最接近的整数。
本文所用“个体”当指生物体时，指多细胞真核生物，包括但不限于后生动物、哺乳动物、ovid、牛科(bovid)、猿、灵长类和人类。
“分离的”指从天然状态“通过人工”改变，即如果其天然存在，那 么从其原始环境改变或移出、或同时进行。例如在活的生物体中天然存在的多核苷酸或多肽就不是“分离的”，但是从其天然状态的共存材料中分离的相同的多核苷酸或多肽是“分离的”，正如该术语在本文中的应用。而且，通过转化、基因操作或任意其他组合方法引入到生物体中的多核苷酸或多肽，即使其仍然存在于所述生物体中，其也是“分离的”，该生物体可以是活的或无生命的。
“多核苷酸”通常指任意多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是包括单链和双链区域的未修饰RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“变体”指与参考多核苷酸或多肽不同但是保留基本特性的多核苷酸或多肽。通常多核苷酸变体与其他参考多核苷酸在核苷酸序列上有所不同。变体的核苷酸序列的改变可以改变或不改变参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改变可以在参考序列编码的多肽中导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。通常多肽变体与其他参考多肽在氨基酸序列上有所不同。通常差异是有限的，从而使参考多肽序列和变体在许多区域中整体上接近相似和相同。变体和参考多肽在氨基酸序列上的不同可以是任意组合的一个或多个取代、添加、缺失。取代或插入的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码所编码的。多核苷酸或多肽变体可以天然存在(例如等位变体)，或其可以不是天然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽变体可以通过诱变技术形成或直接合成。
“疾病”指由细菌感染引起或与细菌感染相关的任意疾病，包括例如婴儿和儿童的中耳炎、老年肺炎、鼻窦炎、医源性感染和侵入性疾病、听觉丧失的慢性中耳炎、中耳积水、听觉神经损伤、语音学习迟缓、上呼吸道感染和中耳发炎。
实验部分
除非另外详细说明，下面的实施例用标准技术进行，这些技术是本领域技术人员熟知和常规使用的。实施例是为了说明而不是限制本发明。
本研究描述命名为流感嗜血菌的蛋白质E(pE)的新的外膜蛋白质和新 的截短的重组pE(A)的分离、纯化、表征、克隆和表达，该蛋白质通过使用人IgD(λ)骨髓瘤血清而发现。
材料和方法
试剂
b型流感嗜血菌菌株MinnA和NTHi3655获自Robert S.Munson Jr.(Washington University School of Medicine(St.Louis,Mo)。非典型流感嗜血菌菌株NTHi772是从本系临床上的鼻咽擦洗培养物中分离的(2)。也分析了一系列不同嗜血菌属物种并在表1中描述。人IgD骨髓瘤血清(whole serum)IgD(λ)购自The Binding Site(Birmingham,英国)。为产生特异性抗pE抗血清，用200μg在完全弗氏佐剂(Difco,Becton Dickinson,Heidelberg,德国)中乳化的重组pE22-160[pE(A)]或结合于匙孔血蓝蛋白(KLH)的pE41-68肽对兔进行肌肉内免疫，并且在18天和36天用等剂量的在不完全弗氏佐剂中的蛋白质强化。2到3周后取血。通过用pE(A)或缀合于CnBr-琼脂糖的特异性pE肽(pE41-68)进行亲和层析来分离得到的多克隆抗体(11)。辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人IgD来自Biosource(Camarillo,CA)。兔抗人IgD pAb来自Dakopatts(Gentofte,丹麦)。
异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的小鼠抗人IgD、HRP缀合的兔抗人轻链(K和λ)、和FITC缀合的猪抗兔多克隆免疫球蛋白购自Dakopatts。
蛋白质E的提取和纯化
b型流感嗜血菌(MinnA)在补充NAD和氯高铁血红素(Sigma,St.Louis,MO)各10μg/ml的脑心浸液(BHI)培养基(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)中生长过夜。洗涤细菌两次后在含0.5％(Calbiochem Novabiochena,Bedford,MA)的0.05M Tris-HCl-缓冲液(pH8.8)中提取细菌。细菌悬液经磁力搅拌在37℃混合2小时。在4℃、8000x g离心20分钟以后，上清用无菌滤器(0.45μm；Sterivex-HV,Millipore)过滤。在0.5％中提取的流感嗜血菌应用于以含6M尿素的0.05M Tris-HCl(pH 8.8)平衡的Q-琼脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech)。该柱在相同缓冲液中用0至1M NaCl线性梯度洗脱。将用IgD(λ)骨髓瘤血清检测的级分混合，在Spectraphor薄膜管(分子量截留6-8,000；Spectrum,Laguna hills,CA)中向0.05M Tris-HCl,pH8.8透析，并且在Ym100圆盘膜(分子量截留10,000；Amicon,Beverly,MA)上浓缩。
膜上蛋白质的SDS-PAGE和检测(Western印迹)
用10％Bis-Tris凝胶以电泳缓冲液(MES)、样品缓冲液(LDS)和转膜缓冲液，以及来自Novex(San Diego,CA)的印迹仪器在150恒压下SDS-PAGE。样品按常规在100℃加热10分钟。凝胶用考马斯亮蓝R-250(13；Bio-Rad,Sundbyberg,瑞典)染色。蛋白质条带从凝胶向immobilon-P膜(Millipore,Bedford,MA)的电泳转移在30V进行2-3小时。转移以后，immobilon-P膜用含5％奶粉和0.05％吐温20的PBS(PBS-Tween)封闭。在PBS-Tween中洗涤几次之后，膜与纯化的IgD骨髓瘤蛋白质(0.5μg/ml,人IgD(λ)骨髓瘤)在含2％奶粉的PBS-Tween中在室温孵育1小时。用PBS-Tween洗涤几次之后，加入1/1000稀释的HRP缀合的山羊抗人IgD。室温孵育40分钟，然后再进行几次另外的PBS-Tween洗涤，最后用ECL Western印迹检测试剂(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)进行显影。
二维SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-D PAGE)和Western印迹
离子交换层析之后，提取的流感嗜血菌(MinnA)用IPGphor IEF系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行等电聚焦(IEF)(5,12)。使用标准物凝胶定标(gel calibration，目录号161-0320；Bio-Rad)。2-D聚丙烯酰胺凝胶经120mA过夜电转移到Immobilon-PVDF滤膜(filter)上(0.45mm；Millipore,Bedford,US)。饱和以后，进行上述孵育、封闭和洗涤步骤。
氨基酸序列分析
用应用生物系统(Foster City,CA)470A气液固相序列分析仪进行自动氨基酸序列分析。
流感嗜血菌基因组文库的构建
通过使用改进的Berns和Thomas方法(2,13)从772菌株制备染色体DNA。简言之，从40μg以Sau3A部分消化1小时的DNA构建流感嗜血菌772基因组文库。切割的DNA用蔗糖梯度分级(14)。将包含合适大小(2-7kbp)DNA片段的级分混合，将DNA连接到BamHI消化的pUC18中，然后用基因脉冲器(Bio-Rad,Richmond CA)经电穿孔转化到大肠杆菌JM83中。将细菌涂布到补充氨苄青霉素和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)的LB琼脂上。
克隆免疫测定、DNA分离和测序
通过干滤膜覆盖在琼脂表面将在LB琼脂上过夜培养的大肠杆菌转化体转移到硝化纤维素滤膜(Sartorius,德国)上。平板放置15分钟，通过暴露于饱和氯仿蒸汽20分钟来裂解细胞。在含卵清蛋白的Tris平衡盐(50mM Tris-盐酸化物、154mM NaCl、1.5％卵清蛋白[pH7.4])中孵育滤膜30分钟从而将滤膜上剩余的蛋白质结合位点封闭。封闭以后，滤膜与人IgD(λ)一起孵育30分钟。洗涤后，加入HRP缀合的抗人IgD多克隆抗体，并与滤膜一起孵育30分钟。所有的孵育在室温下进行。最后，滤膜用4-氯-1-萘酚和H2O2进行显影。挑取阳性克隆，并纯化含NTHi772基因组DNA的pUC18质粒DNA。得到的NTHi772DNA插入片段用侧翼序列M13+和M13-和BigDye末端循环测序仪第2.0版即时反应测序试剂盒(Perkin-Elmer,Foster City,Ca)进行测序。获得的插入序列(3.55kbp)相应于含编码蛋白质HI0175、HI0176、HI0177、和最终HI0178的DNA的一段序列(15)。
DNA克隆和蛋白质表达
所有的构建体使用PCR扩增的片段制备。用含NTHi772基因组DNA(HI0175到HI0178)的pUC18作为模板。Taq DNA聚合酶来自Roche(Mannheim,德国)，PCR条件按制造商所推荐。克隆了4个预测蛋白质HI0175到HI0178的可读框，但是本文仅包括克隆HID(HI0178)过程的描述。pE22-160[称为pE(A)]缺少包括谷氨酰胺21氨基酸残基的内源信号肽，用引物5’-ctcaggatccaaaggctgaacaaaatgatgtg-3’和 5’-ggtgcagattaagcttttttttatcaactg-3’进行PCR扩增并引入限制酶位点BamHI和HindIII。为了融合由载体编码的6组氨酸残基，将pE22-160终止密码子突变。将获得的pe基因的417bp可读框连接到pET26(+)(Novagen,Darmstadt,德国)中。为了避免假定的毒性，首先将获得的质粒转化到宿主大肠杆菌DH5α中。此后，将编码pE和pE(A)的质粒转化到表达宿主BL21(DE3)中。除全长pE和pE(A)以外，也制备了一系列截短的pE变体。概要在图8中显示。所有构建体使用包含BamHI和HindIII的引物。截短变体的过程如上所述。所有构建体用BigDye末端循环测序仪第2.0版即时反应测序试剂盒(Perkin-Elmer,Foster City,Ca)进行测序。
为产生重组蛋白质，细菌生长到对数中期(OD600为0.6-0.8)，随后用1mM异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导得到pE(A)的过表达。当OD600达到1.5到1.7时，收集细菌并根据标准方法分离包涵体。重组蛋白质还可以用镍柱通过亲和层析纯化。纯化的重组蛋白质随后用SDS-PAGE进行分析。
流感嗜血菌DNA纯化、PCR条件和测序
临床分离的流感嗜血菌的基因组DNA用Dneasy组织试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)分离。Taq DNA聚合酶来自Roche(Mannheim,德国)，且PCR条件按制造商所推荐。为分离pe基因，使用分别与HI0177和HI0179侧翼基因退火的引物对5’-gcatttattaggtcagtttattg-3’和5’-gaaggattatttctgatgcag-3’。获得的PCR产物(948bp)通过基因步行法用上述除5’-cttgggttacttaccgcttg-3’和5’-gtgttaaacttaacgtatg-3’以外的引物进行测序。用染料末端循环测序试剂盒(CEQ DTCS试剂盒,Beckman Coulter,Stockholm,瑞士)在Beckman CEQ2000上进行毛细管电泳。获得的DNA序列的编辑和比对用PHRED(CodonCode,Deadham,USA)和SEQUENCHER(MedProbe,Oslo,挪威)进行。
pE缺失的流感嗜血菌(NTHi3655Δpe)的制备
用分离自NTHi772的基因组DNA作为模板。包含部分HI0177和HI0179基因的pe的5’和3’末端作为两个盒(分别为815bp和836bp)用 DyNAzymeTMII DNA聚合酶(Finnzymes,Espoo,Finland)来扩增，除在两个盒中特异引入的序列以外，分别引入限制酶位点XhoI和EcoRI、EcoRI和SpEI(18)。消化得到的PCR片段，并将其克隆到pBluescript SK(+/-)中。从pUC4K中通过EcoRI限制酶位点获得卡那霉素抗性基因盒(1282bp)。PCR产物经消化后，连接到含部分HI0177和HI0179基因的截短的pe基因片段中。根据heriott等人的M-IV方法转化流感嗜血菌菌株Eagan和RM804(19)。通过PCR验证得到的突变体，并用Western印迹和流式细胞术分析pE表达。
分子生物学软件
得到的序列与可获得的流感嗜血菌KW20基因组(http://www.tigr.org)进行比较(15)。用环球网预测服务器中心的生物序列分析SignalP1.1版(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)推测信号肽(16)。用Kyte和Doolittle的方法分析pE疏水性谱。
动物、手术操作和大鼠中耳炎模型
使用体重200-250g的健康雄性Sprague-Dawley大鼠。在手术之前通过耳显微镜确定所有动物没有中耳感染。在介入时，静脉内施用美索比妥(ElIi Lilly and Company,Indianapolis,IN)或腹膜内施用水合氯醛(apoteksbolaget,Lund,瑞典)麻醉大鼠。用于动物实验的细菌的培养如上所述。通过离心收集以后，在新鲜的培养基中重悬细菌，对于NTHi3655和相应pE突变体细菌浓度为2x1010克隆形成单位(cfu)。制备物在冰上保存直到使用。为诱导急性中耳炎(AOM)，从颈腹侧正中切口延伸到达中耳，向中耳腔缓慢滴入约0.05ml细菌悬液。在手术3天和5天后进行耳显微镜观察。具有化脓性渗出物的中耳炎(即不透明渗出物并且在第3天通常可见血管显著膨胀)称为AOM。
结果
由IgD(λ)骨髓瘤血清检测的流感嗜血菌蛋白质E(pE)的提取和分离
先前认为非典型流感嗜血菌(NTHi)不结合IgD(19)，而有荚膜的流感嗜血菌与IgD强烈结合。我们发现IgD(λ)骨髓瘤血清也特异性地结合于 NTHi。NtHi772的典型流式细胞术谱在图1中显示。当存在IgD(λ)骨髓瘤蛋白质时，与没有IgD的对照相比较有强烈的位移和增强的荧光。
为详细分析由IgD(λ)骨髓瘤检测的流感嗜血菌外膜蛋白质，将外膜部分在去污剂中溶解。图1B表明在Western印迹上表观分子量为约16kDa的蛋白质具有非常强的IgD结合活性。然而，在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE上检测不到相应IgD结合活性的明显蛋白质条带。用Q-琼脂糖柱分离以后，相同的外膜提取物应用于2维凝胶电泳和银染色(图1C)。作为平行，用人IgD(λ)作为探针进行相应的Western印迹。由此圈定pE定位的区域。然而，没有检测到可见的蛋白质(图1C)。
蛋白质E克隆和缺乏pE的非典型流感嗜血菌突变体的制备
由于分离以后在2-D分析中没有检测到任何蛋白质，因此我们使用非典型流感嗜血菌(NTHi)菌株772构建流感嗜血菌DNA文库。包含2-7kbp范围的片段的基因组DNA连接到pUC18中，随后转化到大肠杆菌JM83中。用包括人IgD(λ)和HRP缀合的抗人IgD多克隆抗体的克隆免疫测定法来分析转化物的IgD结合。在测试的20000个克隆中发现3个阳性克隆，将它们用IgD(λ)进行第二轮筛选。我们将一个阳性克隆测序，发现了3.55kb的插入序列，其包含编码根据流感嗜血菌KW20物理图谱的4个蛋白质HI0175到HI0178的DNA(15)。为了进一步验证与IgD(λ)的特异性相互作用，所选的转化细胞也用流式细胞术分析。如图2B所示，与仅转化空载体的阴性对照大肠杆菌相比较，通过IgD(λ)检测到含有相应于HI0175到HI0178编码序列的流感嗜血菌772基因组DNA的大肠杆菌JM83(图2A)。
除分析大肠杆菌JM83克隆以外，将4个流感嗜血菌蛋白质(HI0175到HI0178)克隆到表达载体pET26(+)中，并在大肠杆菌BL21DE3中产生这些蛋白质。获得的重组蛋白质用IgD(λ)在Western印迹上分析，发现HI0178是唯一能用IgD(λ)检测的蛋白质(数据未显示)。
在pE编码基因中引入卡那霉素抗性基因盒从而将非典型流感嗜血菌(NTHi3655)突变。获得的突变体用PCR确认，并通过Western印迹用特 异性抗pE抗血清分析外膜蛋白质来证实pE表达的缺失(数据未显示)。NTHi3655Δpe突变体也用流式细胞术测定，并发现当用兔抗pE单克隆抗血清和FITC缀合的山羊抗兔二抗pAb分析时，突变体与相应NTHi3655野生型相比较，荧光明确减少(图2C和D)。
在所有流感嗜血菌中检测到蛋白质E，而其他亚种为阴性
为了分析临床分离物的pE表达和NTHi典型菌株，我们开发了包括IgD(λ)血清和直接抗人IgD的FITC缀合二抗的直接结合流式细胞术测定。在最初的实验中，分析在不同时间点收集的细菌的pE表达。没有检测到对数生长期和静止期细菌之间pE表达的差异，提示NTHi表面pE不依赖于生长期。因此在所有进一步分析中使用静止期的细菌。分析每个细菌细胞的平均荧光强度(mfi)，我们的研究中总共包括22个NTHi菌株。不同的NTHi菌株之间荧光强度不同，尽管在使用IgD(λ)骨髓瘤血清作为检测抗体的该具体测定中多数NTHi中检测到pE(图3)。
在其他实验中，使用特异性兔抗pE抗体检测表面外露的pE。特异抗pE抗血清也在有荚膜的流感嗜血菌、埃及嗜血菌(H.aegypticus)和溶血嗜血菌(H.haemolyticus)菌株中特异性识别pE(数据未显示)。
为了进一步分析pE表达水平，处理的多种嗜血菌属物种的外膜提取物用IgD(λ)作为检测抗体在Western印迹中测试(表1)。在这些实验中，高表达和低表达的嗜血菌菌株之间没有发现差异，即在Western印迹中，所有菌株展现相同强度的pE，并在相应于16kDa的相同位置。Western印迹表明有荚膜的流感嗜血菌(a到f型)也表达pE(表1)。例如，在图4中，4个b型荚膜流感嗜血菌(Hib)中的pE表达与NTHi相比较。埃及嗜血菌和溶血嗜血菌表达pE(表1)，而其他相关嗜血菌属物种在流式细胞术中呈阴性(图3)，Western印迹分析没有检测到pE。特异抗pE抗血清也在有荚膜的菌株中特异性识别pE(数据未显示)。
表1
通过IgD(λ)检测重组产生的pE22-160[pE(A)]
在最初的实验中，我们试图制备重组pE，但是仅获得微小的浓度。为了使蛋白质产量最大化，构建了包括第22位赖氨酸到第160位赖氨酸氨基酸残基的截短的pE片段。包括第21位谷氨酰胺氨基酸的N末端信号肽被除去，并且除来自载体pET26(+)的9个残基以外用前导肽取代(图5A)。截短的pE22-160称为pE(A)(图5B)。为了确定相对于“野生型”pE的重组蛋白质产物，用IgD(λ)作为探针通过SDS-PAGE和Western印迹分析重组表达的pE(A)和从NTHi772分离的pE。如图5D中所示，值得注意的是 在SDS-PAGE中重组pE(A)相当于野生型pE。此外，用IgD(λ)抗血清可以检测到低至0.01μg的大肠杆菌中产生的pE(A)(图5E)。
用pE(A)免疫兔，如材料和方法中详述的免疫接种程序完成以后，在包含预测的免疫显性肽(pE41-68氨基酸)的柱上纯化抗pE抗血清。获得的抗体可以在细菌表面(图2C)和Western印迹中(数据未显示)清楚地检测到pE。
蛋白质e基因的DNA序列和可读框
来自NTHi772菌株的pE1-160的DNA和氨基酸序列在图6中概述。可读框(ORF)长度为160个氨基酸，并且预测的信号肽长度为20个氨基酸。计算机分析表明信号肽酶识别第18位丙氨酸到第22位赖氨酸的氨基酸残基，并在第20位异亮氨酸和第21位谷氨酰胺残基之间切割(38)。同时，HID亲水性图(39)显示pE具有疏水的信号肽，而剩余的分子主要是亲水的(图7)。
为了详细确定信号肽切割位点，将重组全长pE进行埃德曼降解。然而，pE多肽链的氨基末端可能被封闭。该失败的一个可能的解释是第一个氨基酸是焦谷氨酰残基，正如先前所描述的粘膜炎莫拉菌UspA家族蛋白质(11)。然而，用焦谷氨酸氨肽酶除去该假定残基的尝试失败了。与全长pE1-160相反，缺失内源流感嗜血菌信号肽的pE(A)(pE22-160)的N末端序列(图5)可以成功地由埃德曼降解来表征，并含有预测的载体序列，即在大肠杆菌中信号肽酶在正确位置切割(图5A)。
将在一系列不同嗜血菌属物种(包括NTHi和有荚膜的流感嗜血菌)中的蛋白质E测序(表1)。有趣的是，pE是非常保守的。仅有几个氨基酸点突变，并且这些突变在多数菌株中以特定方式进行(图6和表2)。
表2.当与参考菌株a)流感嗜血菌Rd相比较时，不同嗜血菌属物种中pe基因的点突变
a)用侧翼引物测序有荚膜流感嗜血菌a型(n＝2)、b型(n＝2)、c型(n＝2)、d型(Ti＝I)、e型(n＝2)和f型(n＝3)、NTHi(n＝8)、流感嗜血菌biovar aegypticus(n＝6)和埃及嗜血菌(n＝5)中的pe基因。
b)NTHi772(Sequence ID No:1)
c)Rd指定为流感嗜血菌菌株Rd
可以容易地在大肠杆菌中制备的pE的不同片段
衍生自全长pE的8个cDNA序列克隆到pET26b(+)中并在大肠杆菌中表达。得到的蛋白质在镍树脂上与组氨酸标记亲和来纯化(图8)。重组蛋白质覆盖全部成熟pE蛋白质产物，并且它们每个的长度和位点在图8A中表明，纯化产物在图8B中概述。
pE是大鼠急性中耳炎(AOM)的重要毒力因子
为研究pE作为NTHi毒力因子的作用，用105-109NTHi3655Δpe或相应野生型NTHi3655刺激大鼠中耳(图9)。有趣的是，与野生型细菌相比较，诱导相似AOM所需要的NTHi3655Δpe要多100-1000倍。因此，pE是NTHi诱导的AOM的重要毒力因子。pE在定义种群中具有高免疫原性。
为了在儿童和献血者中测量抗体水平，从大肠杆菌中纯化重组pE(A)(图5B)并用于ELISA。抗pE(A)抗体的ELISA分析结果在图9中显示。小于6个月的儿童中可检测到抗pE(A)的IgG和IgA。在5-10岁儿童中，IgG抗体显示峰水平。相反，IgA抗体随年龄增加而逐渐增加，并且在70-80年龄组中检测到最高值。
有用的表位
蛋白质的B细胞表位主要定位于其表面。为预测蛋白质E多肽的B细胞表位，将两种方法组合使用：2D结构预测和抗原性指数预测。用PSIPREQ程序(来自David Jones,Brunei Bioinformatics Group,Dept.Biological Sciences,Brunei University,Uxbridge UB8 3PH,UK)进行2D结构预测。基于Jameson和Wolf(CABIOS4:181-186[1988])所述方法计算抗原性指数。在该程序中使用的参数是抗原性指数和抗原性肽的最小长度。最小为5个连续氨基酸的抗原性指数0.9用作该程序的阈值。包含好的、可能的B细胞表位的肽在表3中列出。这些(优选缀合或重组结合于更大的蛋白质)可以用于防御NTHi感染的疫苗组合物，其可以是天然蛋白质E(SEQ ID NO:1或上述表2中所示的其天然同源物)多肽的含保守性突变(优选与表3的序列具有70、80、85、95、99或100％同一性)的类似肽、或包含5个或更多(例如6、7、8、9、10、11、12、15、20或25)个氨基酸的截短形式、或在N-和/或C-末端包含例如1、2、3、5、10个其他氨基酸的延长形式，其保持了能够在宿主中引起对抗蛋白质E多肽的免疫应答的有效表位。
表3：SEQ ID NO:1(或其天然同源物)的可能的B细胞表位
结论
外露于表面的嗜血菌外膜蛋白质pE是NTHi诱导的AOM的重要毒力因子，其在定义种群中具有高免疫原性，并且因此成为对于多种人类疾病非常合适的疫苗候选者。
参考文献
1.Ruan,M.,M.Akkoyunlu,A.Grubb和A.Forsgren.1990.Protein D of Haemophilus influenzae.A novel bacterial surface protein with affinity for human IgD.J.Immunol.145:3379.
2.Janson,H.,L.-O.Heden,A.Grubb,M.Ruan和A.Forsgren.1991.Protein D,an immunoglobulin D-binding protein of Haemophilius influenzae:cloning,nucleotide sequence,and expression in Escherichia coli.Infect.Immun.59:119.
3.Janson,H.,A.Melhus,A.Hermansson和A.Forsgren.1994.Protein D,the glycerophosphodiester phosphodiesterase from Haemophilus influenzae with affinity for human immunoglobulin D,influences virulence in a rat otitis model.Infect.Immun.62:4848.
4.Janson,H.,B.Carlen,A.Cervin,A.Forsgren,A. Bjδrk-Magnusdottir,S.Lindberg和T.Runer.1999.Effects on the ciliated epithelium of protein D-producing and-nonproducing nontypeable Haemophilus influenzae in nasopharyngeal tissue cultures.J.Infect.Dis.180:737.
5.Ahren,I.L.,H.Janson,A.Forsgren,K.Riesbeck.2001.Protein D expression promotes the adherence and internalization of non-typeable Haemophilus influenzae into human monocytic cells.Microb.Pathog.31:151.
6.Forsgren,A.和Grubb,A.(1979)Many bacterial species bind human IgD.J.Immunol.122,1468-1472.
7.Banck,G.和Forsgren,A.(1978)Many bacterial species are mitogenic for human blood lymphocytes.Scand.J.Immunol.8,347-354.
8.Calvert,J.E.和Calogeres,A.(1986)Characteristics of human B cells responsive to the T-independent mitogen Branhamella catarrhalis.Immunology58,37-41.
9.Forsgren,A.,Penta,A.,Schlossman,S.F.和Tedder,T.F.(1988)Branhamella catarrhalis activates human B lymphocytes following interactions with surface IgD and class I major histocompatibility complex antigens.Cell.Immunol.112,78-88.
10.Sasaki,K.和Munson Jr.,R.S.(1993)Protein D of Haemophilus influenzae is not a universal immunoglobulin D-binding protein.Infect.Immun.61,3026-3031.
11.Forsgren,A.,M.Brant,A.Mollenkvist,A.Muyombwe,H.Janson,N.Woin和K.Riesbeck,.2001.Isolation and characterization of a novel IgD-binding protein from Moraxella catarrhalis.J.Immunol.167:2112.
12.Gorg,A.,C.Obermaier,G.Boguth,W.Weiss.1999.Recent developments in two-dimensional gel electrophoresis with immobilized pH gradients:wide pH gradients up to pH12,longer separation distances and simplified procedures.Electrophoresis20:712.
13.Berns,K.I.和C.A.Thomas,Jr.1965.Isolation og high molecular weight DNA from Haemophilus influenzae.J.MoI.Biol.11:476.
14.Clark-Curtiss,J.E.,W.R.Jacobs,M.A.Docherty,L.R.Ritchie和R.Curtiss,第三版，1985.Molecular analysis of DNA and construction of genomic libraries of Mycobacterium leprae.J Bacteriol.161:1093.
15.Fleischmann,R.D.,M.D.Adams,0-White,R.A.Clayton,E.F.Kirkness,A.R.Kerlavage,C.J.BuIt,J.F.Tomb,B.A.Dougherty,J.M.Merrick等人，1995.Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd.Science269:496.
16.Nielsen,H.,J.Engelbrecht,S.Brunak和G.von Heijne.1997.Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites.Protein Engineering10:1.
17.Kyte,J.和R.F.Doolittle.1982.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.J.MoI.Biol.157:105.
18.Poje,G.和J.R.Redfield.2003.Transformation of Haemophilus influenzae.Methods.MoI.Med.71:57-70.
19.Hussain,M.,K.Becker,C.Von Eiff,J.Schrenzel,G.Peters和M.Herrmann.2001.J.Bacterial183(23):6778-6786.