鲍鱼内脏酸性多糖、含有其的保健品和应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210439232.8	申请日：	2012.11.06
公开号：	CN102898538A	公开日：	2013.01.30
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C08B 37/00申请日:20121106\|\|\|公开
IPC分类号：	C08B37/00; A61K31/737; A61P1/16; A61P35/00; A23L1/09	主分类号：	C08B37/00
申请人：	中国海洋大学
发明人：	王玉明; 李国云; 武风娟; 薛长湖; 薛勇; 李兆杰; 徐杰; 王静凤; 常耀光; 唐庆娟
地址：	266100 山东省青岛市崂山区松岭路238号
优先权：
专利代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350	代理人：	汤东凤
PDF下载：	PDF下载

内容摘要

本发明提供了一种鲍鱼内脏酸性多糖，所述多糖的主链主要由鼠李糖和葡萄糖醛酸构成，主链中的鼠李糖的C-2位或C-3位被硫酸酯化，所述主链中的鼠李糖连接有鼠李糖或半乳糖从而形成支链结构。本发明从鲍鱼内脏提取的鲍鱼内脏酸性多糖在体外可显著促进HepG2细胞的增殖，且其作用呈一定的剂量依赖性，通过研究鲍鱼内脏酸性多糖对氧化损伤的HepG2细胞的修复作用及体内对四氯化碳致急性肝损伤大鼠肝组织修复作用实验表明，鲍鱼内脏酸性多糖可以作为一种保肝护肝的功能因子。

权利要求书

权利要求书一种鲍鱼内脏酸性多糖，其特征在于：所述多糖主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖构成。
如权利要求1所述的鲍鱼内脏酸性多糖，其特征在于：所述多糖的主链主要由鼠李糖和葡萄糖醛酸构成，主链中的鼠李糖的2位或3位被硫酸酯化，所述主链中的鼠李糖连接有鼠李糖或半乳糖从而形成支链结构。
如权利要求1或2所述的鲍鱼内脏酸性多糖，其特征在于：所述多糖的主链主要有→3)‑β‑D‑GlcpA‑(1→4)‑α‑L‑Rhap‑(3SO4)‑(1→(I)和→3)‑β‑D‑GlcpA‑(1→4)‑α‑L‑Rhap‑(2SO4)‑(1→(II)两种结构单元，所述两种结构单元的比例为2:1，主链I中硫酸化鼠李糖C‑2上连接有支链α‑L‑Rhap，主链II的硫酸化鼠李糖的C‑3位连接着支链α‑L‑Rhap‑(4SO4)‑(1→3)‑β‑D‑Galp，所述多糖的主结构为式1所示，

式1。
如权利要求1至3所述的鲍鱼内脏酸性多糖，其特征在于：所述鲍鱼内脏酸性多糖的平均分子量为32.5Kda。
一种用于促进肝细胞的增殖或用于修复人体或动物体体内急性肝损伤的药物或保健品，其特征在于，包括：权利要求1至4所述的鲍鱼内脏酸性多糖。
权利要求1至4所述的鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于促进人体或动物体肝细胞的增殖的药物或保健品中的应用。
权利要求1至4所述的鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于修复人体或动物体体内急性肝损伤的药物或保健品中的应用。

说明书

说明书鲍鱼内脏酸性多糖、含有其的保健品和应用
技术领域
本发明涉及一种多糖，尤其涉及一种从鲍鱼内脏提取新型酸性多糖。
背景技术
鲍隶属软体动物门（Mollusca）、腹足纲（Gastropoda）、前鳃亚纲（Prosobranchia）、原始腹足目（Archaeogastropoda）、鲍科（Haliotidae）、鲍属（Haliotis），全世界各海区已命名的鲍鱼有216种，常见种类约30种，在中国沿海分布主要有7种。皱纹盘鲍与杂色鲍分别为我国北方与南方的代表品种，与杂色鲍相比皱纹盘鲍经济价值更高，并以山东沿海所产的鲍鱼最为著名，史称“登莱鳆鱼”。鲍鱼内脏占鲍鱼总重的15~25%，作为鲍鱼加工过程中的废弃物，多被丢弃或做成饲料，不仅对环境造成污染，同时也降低了鲍鱼的价值，
糖类是组成生物高分子家族中的一个最丰富多彩的成员，现已从天然产物中分离出了300多余种多糖类化合物，它们广泛的存在于各种植物、动物和微生物组织中，具有许多重要的功用。多糖是由多个单糖或其衍生物聚合而成的大分子活性化合物，是一切有生命的有机体必不可少的成分，同维持生物机能密切相关。多糖是非特异性的免疫调节剂，具有抗肿瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗辐射、降血糖、降血脂等生物学活性，多糖正逐渐成为当今功能性食品开发的重要方向之一。多糖作为药物始于1934年，六十年代后，多糖作为广谱免疫促进剂引起了人们极大的兴趣。八十年代又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性的作用，能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长和衰老。近二十年来，由于分子生物学和细胞生物学的发展，发现多糖及缀合物参与细胞的各种生命现象，它作为支持组织和能量来源的传统观念已被突破。
鲍鱼内脏酸性多糖是鲍鱼内脏主要组成成分，其结构复杂，且因鲍鱼种类和生长环境的不同而有差别。近年来，朱蓓薇等从鲍鱼内脏中提取了鲍鱼内脏酸性多糖ACPI和ACPII，两者均有由鼠李糖、岩藻糖、木糖、半乳糖、甘露糖组成，证明其具有抗肿瘤，提高机体免疫力，抗氧化等多种生理活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是在于提供一种新型的鲍鱼内脏酸性多糖，所述多糖是从鲍鱼内脏提取出的多糖，其在人体或动物体外可以明显促进HepG2细胞增殖，并可以修复氧化损伤的HepG2细胞，在人体或动物体内可改善四氯化碳等药物导致急性肝损伤的肝功能情况，从而可以用于组织器官损伤后的修复。
本发明提供了一种鲍鱼内脏酸性多糖，所述多糖主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖组成。
其中，所述鲍鱼内脏酸性多糖的主链主要由鼠李糖和葡萄糖醛酸构成，主链中的鼠李糖的C‑2位或C‑3位被硫酸酯化，所述主链中的鼠李糖连接有鼠李糖或半乳糖从而形成支链结构。
其中，所述鲍鱼内脏酸性多糖的主链主要有→3)‑β‑D‑GlcpA‑(1→4)‑α‑L‑Rhap‑(3SO4)‑(1→(I)和→3)‑β‑D‑GlcpA‑(1→4)‑α‑L‑Rhap‑(2SO4)‑(1→(II)两种结构单元，所述两种结构单元的比例为2:1，主链I中硫酸化鼠李糖C‑2上连接有支链α‑L‑Rhap，主链II的硫酸化鼠李糖的C‑3位连接着支链α‑L‑Rhap‑(4SO4)‑(1→3)‑β‑D‑Galp，所述多糖的主结构为式1所示，

式1。
其中，所述多糖的平均分子量为32.5Kda。
本发明还提供了上述多糖的提取方法，分离纯化方法及结构鉴定方法。
本发明还提供了一种用于促进肝细胞的增殖的药物或保健品，其包括上述的鲍鱼内脏酸性多糖。
本发明提供了一种用于修复体内急性肝损伤的药物或保健品，其包括上述的鲍鱼内脏酸性多糖。
本发明还提供了上述鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于促进肝细胞的增殖的药物或保健品中的应用。
本发明还提供了上述鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于修复体内急性肝损伤的药物或保健品中的应用。
本发明有益的技术效果在于：
本发明从鲍鱼内脏提取的鲍鱼内脏酸性多糖在体外可显著促进HepG2细胞的增殖，且其作用呈一定的剂量依赖性，通过研究鲍鱼内脏酸性多糖对氧化损伤的HepG2细胞的修复作用及体内对四氯化碳致急性肝损伤大鼠肝组织修复作用实验表明，鲍鱼内脏酸性多糖可以作为一种保肝护肝的功能因子。
附图说明
附图1鲍鱼内脏酸性多糖的主要结构单元；
附图2鲍鱼内脏酸性多糖酸水解物的高效液相分离图谱;
附图3鲍鱼内脏酸性多糖的红外光谱;
附图4鲍鱼内脏酸性多糖的1H NMR;
附图5鲍鱼内脏酸性多糖的DEPT谱图;
附图6鲍鱼内脏酸性多糖的部分HMQC图谱;
附图7鲍鱼内脏酸性多糖的1H‑1H COSY谱图;
附图8鲍鱼内脏酸性多糖体外HepG2细胞的增殖作用;
附图9鲍鱼内脏酸性多糖对四氯化碳损伤后大鼠血清ALT和AST的影响;
附图10鲍鱼内脏酸性多糖对四氯化碳损伤后大鼠肝脏甘油三酯含量的影响;
附图11鲍鱼内脏酸性多糖对四氯化碳损伤后大鼠肝脏HE染色结果（400×）。
具体实施方式
本发明提供了一种从鲍鱼内脏提取的酸性多糖，所述鲍鱼内脏酸性多糖主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖组成。
所述多糖的主链包括鼠李糖和葡萄糖醛酸，主链中的鼠李糖的C‑2位或C‑3位被硫酸酯化。
进一步，所述鲍鱼内脏酸性多糖的主链仅由鼠李糖和葡萄糖醛酸构成。
所述主链中的鼠李糖连接有鼠李糖或半乳糖从而形成支链结构。
所述多糖的主链主要有→3)‑β‑D‑GlcpA‑(1→4)‑α‑L‑Rhap‑(3SO4)‑(1→(I)和→3)‑β‑D‑GlcpA‑(1→4)‑α‑L‑Rhap‑(2SO4)‑(1→(II)两种结构单元，所述两种结构单元的比例为2:1，主链I中硫酸化鼠李糖C‑2上连接有支链α‑L‑Rhap，主链II的硫酸化鼠李糖的C‑3位连接着支链α‑L‑Rhap‑(4SO4)‑(1→3)‑β‑D‑Galp，所述多糖的主结构为式1所示，

式1。
本发明提供的上述鲍鱼内脏酸性多糖是从鲍鱼内脏提取出的多糖。
所述鲍鱼内脏酸性多糖的平均分子量为32.5Kda。
本发明还提供了上述鲍鱼内脏酸性多糖的提取方法，分离纯化方法和鉴定方法。
本发明还提供了一种用于促进肝细胞的增殖的药物或保健品，其包括上述的鲍鱼内脏酸性多糖。
本发明提供了一种用于修复体内急性肝细胞损伤的药物或保健品，其包括上述的鲍鱼内脏酸性多糖。
本发明还提供了上述的鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于促进肝细胞的增殖的药物或保健品中的应用。
本发明还提供了上述的鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于修复体内急性肝损伤的药物或保健品中的应用。
以下采用实施例和附图来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1：鲍鱼内脏酸性多糖的提取及分离纯化，依次进行以下步骤：
1)、将100g干鲍鱼内脏磨成粉状物，加入2000mL的混合氯仿‑甲醇（V:V，2:1）的混合溶液，浸泡12h，过滤，滤渣烘干。
2）、取步骤1）烘干所得鲍鱼内脏粉末，加入3000mL混合缓冲液，并加入10g木瓜蛋白酶，于60℃水浴下搅拌反应24h，该混合缓冲溶液的制备方法如下：在每升0.1M乙酸‑乙酸钠缓冲溶液(pH6.0)中加入5mmol的EDTA和5mmol的半胱氨酸。
3)、将步骤2)所得的酶解后产物离心(2000g，15min，20℃)，向所得上清液中加入80mL质量浓度为10％的氯化十六烷基吡啶(CPC)水溶液，室温下放置24小时后，离心(2000g，15min)，弃去上清液。
4)、将步骤3)所得的沉淀溶解于1500mL的NaCl的乙醇水溶液(NaCl的浓度为3mol/L，乙醇:水＝100:15,v/v)中，再加入3000mL 95％(体积浓度)乙醇溶液，4℃放置24小时，离心(2000g，15min)，沉淀分别用100mL80％和95％(均为体积浓度)乙醇溶液洗2次，最后将沉淀于60℃干燥2小时，用蒸馏水溶解，用截流分子量为3500Da的透析袋脱盐，浓缩，冻干(于‑62℃)，得鲍鱼内脏粗多糖7.6g，提取率约为15.2％。
5)、将鲍鱼内脏粗多糖经过DEAE‑52阴离子交换柱和S‑200凝胶过滤柱分离纯化，具体的分离步骤如下：
将约1.0g鲍鱼内脏粗多糖溶于约30mL 0.1M NaAc‑HAc（pH 6.0）缓冲溶液，过DEAE‑52阴离子交换柱(2.6×20cm)，采用0‑1.2mol/L NaCl缓冲盐溶液（0.1M NaAc‑HAc，pH6.0）进行梯度洗脱，收集馏分5mL/管，用硫酸苯酚和Folin‑酚测定多糖和蛋白质含量，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集样品，流动水透析24h，蒸馏水透析24h，冻干。
取上述分离的多糖约100mg溶于1mL超纯水中，过Sephacryl S‑200凝胶柱（1.6×100cm），采用0.2mol/L NaCl进行洗脱，收集馏分2min/管，根据苯酚‑硫酸法检测管中的多糖含量，收集峰尖样品，流动水透析24h，蒸馏水透析24h，冻干，得到鲍鱼内脏酸性多糖纯品。所得多糖通过液相TSK4000柱子检测纯度和分子量，结果表明鲍鱼内脏酸性多糖的平均分子量约为32.5KDa，纯度为99.1%。
实施例2对实施例1所得的鲍鱼内脏酸性多糖进行结构解析
1）、取上述实施例1所得鲍鱼内脏酸性多糖2.0mg于安培瓶中，加入1mL 2mol·L‑1TFA，充氮气封管,110℃下水解8h。随后冷却至室温，50℃的温度下挥干TFA,逐次分别以2mol·L‑1、0.3mol·L‑1NaOH溶液调至中性，超纯水定容至1mL，取450μL并50μL内标物乳糖进行PMP衍生化。色谱条件：色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪、色谱柱：ZORBAX EclipseXDB‑C18分离柱（4.6×150mm,5μm）、检测器：紫外检测器，245nm、流速：1.0mL·min‑1、柱温：25℃、流动相：溶剂A:10%(V/V)乙腈+0.1mol·L‑1乙酸铵‑乙酸缓冲液(pH 5.5)，溶剂B:25%(V/V)乙腈+0.1mol·L‑1乙酸铵‑乙酸缓冲液(pH 5.5)、梯度模式：时间梯度:0→40min，浓度梯度：45→100%溶剂B、进样体积：10μL。见图2，结果表明鲍鱼内脏酸性多糖的单糖组成为鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸（GlcA）和半乳糖（Gal），其比例为6.40:3.69:1.0。
2）、取上述实施例1所得鲍鱼内脏酸性多糖2mg，加1mL浓度2mol·L‑1TFA 110℃的温度下水解10h，80℃左右挥干TFA，以超纯水超声溶解，定容到25mL，取2.5mL采用离子色谱法测定硫酸基含量，以硫酸钾作标准品建立标准曲线，结果表明获得的鲍鱼内脏酸性多糖的硫酸基为15.2%。
3）、上述实施例1所得鲍鱼内脏酸性多糖与KBr压制成片，使用Vector22型傅立叶红外光谱仪，扫描4000～400cm‑1波数范围的光谱吸收值。结果见图3，结果表明鲍鱼内脏酸性多糖在3600‑3200cm‑1都出现了一个宽的O‑H伸缩振动峰，在2936cm‑1附近的吸收峰为鼠李糖甲基的吸收峰，在1641cm‑1和1389cm‑1附近(羧基C=O伸缩，C‑O伸缩)处有吸收，说明鲍鱼内脏酸性多糖中含有糖醛酸，这与单糖组成分析结果相一致，1231（S＝O的伸缩振动峰）和843cm‑1（C‑O‑S的伸缩振动峰）处有强烈吸收，进一步表明鲍鱼内脏酸性多糖富含硫酸基；1051cm‑1处强吸收峰为C‑O‑C或C‑O‑H的伸缩振动。
4）、取上述实施例1中所得的鲍鱼内脏酸性多糖50mg，以0.5mL D2O(浓度为99.96%)连续交换2次，经0.5mL D2O(浓度为99.96%)溶解后，用Bruker AVANCE III 600核磁共振波谱仪测定1H NMR，DEPT，1H‑1H COSY，TOCSY，NOESY，1H‑13C HMQC，HMBC。测定条件：60℃，600MHz；内标：DSS。对于糖化合物来说，1H NMR谱（图4）中C‑1上的质子(H‑1)信号通常在δ4.5～5.6ppm，较易解析，其他C‑2～C‑6的质子信号均集中在δ3.2～4.8ppm，互相重叠交叉，解析困难。在δ1.1ppm左右应为‑CH3，在鲍鱼内脏酸性多糖中该处的信号峰较高，结合单糖组成，该处应为Rha‑CH3的质子。集中在δ3.2～4.6ppm是C‑2～C‑6的质子信号，其互相重叠交叉，解析困难。化学位移在4.60ppm左右的1H应该为β‑D‑GlcUA1H，化学位移在5.0ppm及5.32ppm左右的信号峰的应为α构型鼠李糖的异头氢化学位移数据。
在鲍鱼内脏酸性多糖的DEPT谱（图5）中，其高场区（δ0～50）出现1个碳信号（δ16.85），为Rha‑CH3碳信号。在δ65～78之间信号峰较为复杂，很难分，应为C‑2，C‑3，C‑4的化学位移，在δ78.59的碳信号应为C‑2，C‑3，C‑4中某个碳上有取代基，在δ63.2处的信号峰为仲碳，应归属为Gal‑C‑2说明C‑6上发生了取代；在δ98～106之间出现的信号峰为异头碳区，该区信号较复杂，较难确定异头碳数目，需进一步借助二维谱图鉴定。
鲍鱼内脏酸性多糖的HMQC谱异头碳区信号（图6）确定鲍鱼内脏酸性多糖中主要含有7种糖单元，并根据异头碳信号对应确定7种异头氢信号，结合1H‑1H TOCSY谱（图7），从1H‑1H COSY中异头氢信号出发，顺次确定H‑2，H‑3，H‑4，H‑5，H‑6信号，确定各糖单元氢的化学位移，再根据HMQC谱对各糖单元的碳信号进行归属，见表所示。
糖残基A‑D的异头氢化学位移大于4.80，C‑6位为甲基，说明A‑D均为α构型鼠李糖（α‑L‑Rha）；糖残基F、G的异头氢化学位移小于4.80，H‑2化学位移较低，说明为β‑D‑GlcA；糖残基E应为β‑D‑Gal。对于硫酸基团的取代位置归属，由于硫酸酯化会导致碳和氢信号均会向低场移动糖残基A‑4(C4/H4,80.1/4.64),B‑2(C2/H2,80.3/4.27),D‑3(C3/H3,4.53/80.7),说明A，B，D分别为α‑L‑Rha(4SO4),α‑L‑Rha(2SO4),α‑L‑Rha(3SO4)。
进一步借助1H‑1H NOESY和1H‑13C HMBC异核间1H‑1H和1H‑13C耦合相关信号（表2）确定糖残基间的连接方式和连接顺序。如表所示，通过NOE信号可以观察到异头氢与连接糖残基位连接氢的相关信号，即：A H‑1/E H‑3,B H‑1/G H‑3,C H‑1/D H‑2,D H‑1/F H‑3,E H‑1/B H‑3,F H‑1/D H‑4,G H‑1/BH‑4，确定了残基间的连接方式为，A(1→4)E,B(1→3)G,C(1→2)D,D(1→3)F,E(1→3)B,F(1→4)D,G(1→4)B。1H‑13C HMBC进一步确定了NOESY谱所确定的信息，并且同时包括异头碳与连接糖残基位连接氢的相关信号，异头氢与连接糖残基位连接碳的相关信号，如表2所示。结合硫酸基取代位点以及确定的糖残基之间的连接方式和连接顺序，最终确定鲍鱼内脏酸性多糖主要由以下两个结构单元I和II构成，并根据1H NMR中对应异头氢信号的积分比，确定两个结构单元的比例为2:1。
表1鲍鱼内脏酸性多糖的1H和13C的化学位移归属

表2鲍鱼内脏酸性多糖NOESY谱和HMBC谱的归属

综合上述分析可得出如下结论：
因此，本发明中的鲍鱼内脏酸性多糖的主要结构单元如图1中式1所示，主要包括I和II两种结构单元，其比例为2：1，是首次从青岛产鲍鱼内脏中分离得到的一种结构新颖的酸性多糖。
实施例3鲍鱼内脏酸性多糖促进细胞增殖活性
1）、MTT法检测多糖对HepG2细胞的增殖作用将处于对数生长期的HepG2细胞，用RPMI–1640完全培养基（含10%新生牛血清）制成密度为2×104个·mL‑1的细胞悬液，接种于96孔培养板内，100μL/孔。待24h贴壁后更换成浓度分别为25μg·mL‑1，50μg·mL‑1，100μg·mL‑1，200μg·mL‑1和400μg·mL‑1的多糖，每个浓度设4个复孔，200μL/孔。空白对照组加等量的完全培养基。37℃、5%CO2条件下分别培养24h、48h和72h后，弃去培养基，加入MTT液（PBS液配制，终浓度为0.5mg·mL‑1）。继续培养4h后，吸去上清液，加入酸化异丙醇，吹打至蓝色结晶物完全溶解，酶标仪测570nm各孔吸光度（A）。MTT/%=A570(样品组)/A570(空白对照组)×100%。
2）、EdU法检测多糖对HepG2细胞的增殖指数
细胞布板和培养条件同上。加样品培养48h后，弃培养基，每孔加入100μL50μM的EdU培养基孵育2h，弃培养液，PBS清洗细胞2次，每次5min。然后每孔加入100μL含4%多聚甲醛的PBS细胞固定液室温孵育30min，使细胞固定，之后经EdU染色，在荧光显微镜下拍照，具体按照IX‑51型倒置荧光显微镜系统和Edu荧光显微镜检测试剂盒说明进行程序设置和实验操作。
见图8，图中a为MTT测定体外对HepG2细胞增殖的影响，图b为Edu法测定对HepG2细胞的增殖指数，MTT实验和EdU实验结果显示，与对照组相比，鲍鱼内脏酸性多糖的细胞存活率明显增加，且呈现一定的剂量‑效应关系，说明其具有良好的增殖效果。
实施例4鲍鱼内脏酸性多糖对肝损伤的修复作用
1）、体外鲍鱼内脏酸性多糖对氧化损伤的hepG2细胞修复作用
取对数生长期的HepG2细胞，经0.25%胰酶消化，用RPMI完全培养基(含10%新生牛血清)制成密度为1×105个/mL的细胞悬液，加入96孔培养板，每孔100μL。培养24h后，加入200μL叔丁基过氧化氢（t‑BHP），t‑BHP作用浓度为200μmol/L，对照组加入等量的无血清培养基，培养4h，弃掉培养液，PBS清洗2‑3遍，弃培养液，加入200μL不同浓度的鲍鱼内脏酸性多糖，对照组和模型组加入等量的培养基（含2%血清），孵育24h后，MTT法检测细胞存活率。
实验数据以x±SE表示，采用SPSS11.0软件进行ONE WAY ANOVA分析，以P<0.05为有显著差异。
实验结果显示鲍鱼内脏酸性多糖对叔丁基过氧化氢引起的HepG2细胞的氧化损伤具有显著的修复作用。
表3鲍鱼内脏酸性多糖对氧化损伤HepG2细胞的修复效果
正常组模型组 50ug/mL 100ug/mL 修复作用 100±3.0 57.5±2.4# 85.4±2.0* 110±3.0**
*P＜0.05,**P＜0.01，与模型组比较；#P＜0.05，与正常组比较
2）、鲍鱼内脏酸性多糖对四氯化碳致大鼠急性肝损伤的修复作用
实验动物为SD大鼠，雄性，体重180g‑200g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2009‑0007。大鼠基础饲料适应性喂养1周后，按体重随机分为4组：正常组、模型组、鲍鱼内脏酸性多糖低剂量组和鲍鱼内脏酸性多糖高剂量组，每组9只。各组分别于每日9时灌胃相应受试物。鲍鱼内脏酸性多糖低剂量组和高剂量组分别按照（100mg/kg）、（300mg/kg）的剂量灌胃鲍鱼内脏酸性多糖，正常和模型组分别灌胃相同体积的生理盐水，连续5天。实验第1天和第4天，灌胃前1h分别对模型组、鲍鱼多糖剂量组腹腔注射体积分数为50%的CCl4花生油，2ml/kg B.W.，正常组注射相同体积的花生油。
实验第7天，乙醚麻醉大鼠后，腹主动脉取全血处死，测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性。；取左叶肝组织，10%中性甲醛固定作病理切片，进行HE染色，在光镜下观察肝组织的病理学变化。肝脏脂肪按Folch等的方法抽提，肝脏TC和TG由试剂盒测定。
见图9，10，灌胃鲍鱼内脏酸性多糖有效地抑制了血清中肝损伤指示酶ALT和AST的活性，并能改善肝脏功能受损所伴随的脂肪过度蓄积。
见图11，组织学观察显示正常组大鼠肝脏呈红褐色，质地柔软；在光镜下观察到肝细胞结构完整，未见变性、坏死等明显病理改变，肝小叶界限清晰，核质分布均匀。模型组大鼠肝脏体积增大，模型组中央静脉周围因细胞凋亡产生的间隙明显增大，剂量组显著改善。模型组大量细胞核固缩、溶解等细胞凋亡迹象，剂量组明显改善，特别是高剂量组，高剂量组的切片中存在增殖细胞。所以鲍鱼内脏酸性多糖对于四氯化碳引起的急性肝损伤具有一定的改善作用。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

资源描述

《鲍鱼内脏酸性多糖、含有其的保健品和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《鲍鱼内脏酸性多糖、含有其的保健品和应用.pdf（16页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102898538 A(43)申请公布日 2013.01.30CN102898538A*CN102898538A*(21)申请号 201210439232.8(22)申请日 2012.11.06C08B 37/00(2006.01)A61K 31/737(2006.01)A61P 1/16(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A23L 1/09(2006.01)(71)申请人中国海洋大学地址 266100 山东省青岛市崂山区松岭路238号(72)发明人王玉明李国云武风娟薛长湖薛勇李兆杰徐杰王静凤常耀光唐庆娟(74)专利代理机构北京科亿知。

2、识产权代理事务所(普通合伙) 11350代理人汤东凤(54) 发明名称鲍鱼内脏酸性多糖、含有其的保健品和应用(57) 摘要本发明提供了一种鲍鱼内脏酸性多糖，所述多糖的主链主要由鼠李糖和葡萄糖醛酸构成，主链中的鼠李糖的C-2位或C-3位被硫酸酯化，所述主链中的鼠李糖连接有鼠李糖或半乳糖从而形成支链结构。本发明从鲍鱼内脏提取的鲍鱼内脏酸性多糖在体外可显著促进HepG2细胞的增殖，且其作用呈一定的剂量依赖性，通过研究鲍鱼内脏酸性多糖对氧化损伤的HepG2细胞的修复作用及体内对四氯化碳致急性肝损伤大鼠肝组织修复作用实验表明，鲍鱼内脏酸性多糖可以作为一种保肝护肝的功能因子。(51)Int.Cl.权利要求。

3、书1页说明书8页附图6页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 8 页附图 6 页1/1页21.一种鲍鱼内脏酸性多糖，其特征在于：所述多糖主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖构成。2.如权利要求1所述的鲍鱼内脏酸性多糖，其特征在于：所述多糖的主链主要由鼠李糖和葡萄糖醛酸构成，主链中的鼠李糖的2位或3位被硫酸酯化，所述主链中的鼠李糖连接有鼠李糖或半乳糖从而形成支链结构。3.如权利要求1或2所述的鲍鱼内脏酸性多糖，其特征在于：所述多糖的主链主要有3)-D-GlcpA-(14)-L-Rhap-(3SO4)-(1(I)和3)-D-GlcpA-(14)-L-。

4、Rhap-(2SO4)-(1(II)两种结构单元，所述两种结构单元的比例为2:1，主链I中硫酸化鼠李糖C-2上连接有支链-L-Rhap，主链II的硫酸化鼠李糖的C-3位连接着支链-L-Rhap-(4SO4)-(13)-D-Galp，所述多糖的主结构为式1所示，式1。4.如权利要求1至3所述的鲍鱼内脏酸性多糖，其特征在于：所述鲍鱼内脏酸性多糖的平均分子量为32.5Kda。5.一种用于促进肝细胞的增殖或用于修复人体或动物体体内急性肝损伤的药物或保健品，其特征在于，包括：权利要求1至4所述的鲍鱼内脏酸性多糖。6.权利要求1至4所述的鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于促进人体或动物体肝细胞的增殖的药物或保健品。

5、中的应用。7.权利要求1至4所述的鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于修复人体或动物体体内急性肝损伤的药物或保健品中的应用。权利要求书CN 102898538 A1/8页3鲍鱼内脏酸性多糖、含有其的保健品和应用技术领域0001 本发明涉及一种多糖，尤其涉及一种从鲍鱼内脏提取新型酸性多糖。背景技术0002 鲍隶属软体动物门（Mollusca）、腹足纲（Gastropoda）、前鳃亚纲（Prosobranchia）、原始腹足目（Archaeogastropoda）、鲍科（Haliotidae）、鲍属（Haliotis），全世界各海区已命名的鲍鱼有216种，常见种类约30种，在中国沿海分布主要有7种。

6、。皱纹盘鲍与杂色鲍分别为我国北方与南方的代表品种，与杂色鲍相比皱纹盘鲍经济价值更高，并以山东沿海所产的鲍鱼最为著名，史称“登莱鳆鱼”。鲍鱼内脏占鲍鱼总重的1525%，作为鲍鱼加工过程中的废弃物，多被丢弃或做成饲料，不仅对环境造成污染，同时也降低了鲍鱼的价值，0003 糖类是组成生物高分子家族中的一个最丰富多彩的成员，现已从天然产物中分离出了300多余种多糖类化合物，它们广泛的存在于各种植物、动物和微生物组织中，具有许多重要的功用。多糖是由多个单糖或其衍生物聚合而成的大分子活性化合物，是一切有生命的有机体必不可少的成分，同维持生物机能密切相关。多糖是非特异性的免疫调节剂，具有抗肿瘤、抗炎、抗凝血。

7、、抗病毒、抗辐射、降血糖、降血脂等生物学活性，多糖正逐渐成为当今功能性食品开发的重要方向之一。多糖作为药物始于1934年，六十年代后，多糖作为广谱免疫促进剂引起了人们极大的兴趣。八十年代又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性的作用，能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长和衰老。近二十年来，由于分子生物学和细胞生物学的发展，发现多糖及缀合物参与细胞的各种生命现象，它作为支持组织和能量来源的传统观念已被突破。0004 鲍鱼内脏酸性多糖是鲍鱼内脏主要组成成分，其结构复杂，且因鲍鱼种类和生长环境的不同而有差别。近年来，朱蓓薇等从鲍鱼内脏中提取了鲍鱼内脏酸性多糖ACPI和ACPII，两者均有由鼠李糖、岩。

8、藻糖、木糖、半乳糖、甘露糖组成，证明其具有抗肿瘤，提高机体免疫力，抗氧化等多种生理活性。发明内容0005 本发明所要解决的技术问题是在于提供一种新型的鲍鱼内脏酸性多糖，所述多糖是从鲍鱼内脏提取出的多糖，其在人体或动物体外可以明显促进HepG2细胞增殖，并可以修复氧化损伤的HepG2细胞，在人体或动物体内可改善四氯化碳等药物导致急性肝损伤的肝功能情况，从而可以用于组织器官损伤后的修复。0006 本发明提供了一种鲍鱼内脏酸性多糖，所述多糖主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖组成。0007 其中，所述鲍鱼内脏酸性多糖的主链主要由鼠李糖和葡萄糖醛酸构成，主链中的鼠李糖的C-2位或C-3位被硫酸酯化，所述主。

9、链中的鼠李糖连接有鼠李糖或半乳糖从而形成支链结构。说明书CN 102898538 A2/8页40008 其中，所述鲍鱼内脏酸性多糖的主链主要有3)-D-GlcpA-(14)-L-Rhap-(3SO4)-(1(I)和3)-D-GlcpA-(14)-L-Rhap-(2SO4)-(1(II)两种结构单元，所述两种结构单元的比例为2:1，主链I中硫酸化鼠李糖C-2上连接有支链-L-Rhap，主链II的硫酸化鼠李糖的C-3位连接着支链-L-Rhap-(4SO4)-(13)-D-Galp，所述多糖的主结构为式1所示，0009 0010 式1。0011 其中，所述多糖的平均分子量为32.5Kda。001。

10、2 本发明还提供了上述多糖的提取方法，分离纯化方法及结构鉴定方法。0013 本发明还提供了一种用于促进肝细胞的增殖的药物或保健品，其包括上述的鲍鱼内脏酸性多糖。0014 本发明提供了一种用于修复体内急性肝损伤的药物或保健品，其包括上述的鲍鱼内脏酸性多糖。0015 本发明还提供了上述鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于促进肝细胞的增殖的药物或保健品中的应用。0016 本发明还提供了上述鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于修复体内急性肝损伤的药物或保健品中的应用。0017 本发明有益的技术效果在于：0018 本发明从鲍鱼内脏提取的鲍鱼内脏酸性多糖在体外可显著促进HepG2细胞的增殖，且其作用呈一定的剂量依赖性，通过研。

11、究鲍鱼内脏酸性多糖对氧化损伤的HepG2细胞的修复作用及体内对四氯化碳致急性肝损伤大鼠肝组织修复作用实验表明，鲍鱼内脏酸性多糖可以作为一种保肝护肝的功能因子。附图说明0019 附图1鲍鱼内脏酸性多糖的主要结构单元；0020 附图2鲍鱼内脏酸性多糖酸水解物的高效液相分离图谱;0021 附图3鲍鱼内脏酸性多糖的红外光谱;0022 附图4鲍鱼内脏酸性多糖的1H NMR;说明书CN 102898538 A3/8页50023 附图5鲍鱼内脏酸性多糖的DEPT谱图;0024 附图6鲍鱼内脏酸性多糖的部分HMQC图谱;0025 附图7鲍鱼内脏酸性多糖的1H-1H COSY谱图;0026 附图8鲍鱼内脏酸。

12、性多糖体外HepG2细胞的增殖作用;0027 附图9鲍鱼内脏酸性多糖对四氯化碳损伤后大鼠血清ALT和AST的影响;0028 附图10鲍鱼内脏酸性多糖对四氯化碳损伤后大鼠肝脏甘油三酯含量的影响;0029 附图11鲍鱼内脏酸性多糖对四氯化碳损伤后大鼠肝脏HE染色结果（400）。具体实施方式0030 本发明提供了一种从鲍鱼内脏提取的酸性多糖，所述鲍鱼内脏酸性多糖主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖组成。0031 所述多糖的主链包括鼠李糖和葡萄糖醛酸，主链中的鼠李糖的C-2位或C-3位被硫酸酯化。0032 进一步，所述鲍鱼内脏酸性多糖的主链仅由鼠李糖和葡萄糖醛酸构成。0033 所述主链中的鼠李糖连接有鼠李。

13、糖或半乳糖从而形成支链结构。0034 所述多糖的主链主要有3)-D-GlcpA-(14)-L-Rhap-(3SO4)-(1(I)和3)-D-GlcpA-(14)-L-Rhap-(2SO4)-(1(II)两种结构单元，所述两种结构单元的比例为2:1，主链I中硫酸化鼠李糖C-2上连接有支链-L-Rhap，主链II的硫酸化鼠李糖的C-3位连接着支链-L-Rhap-(4SO4)-(13)-D-Galp，所述多糖的主结构为式1所示，0035 0036 式1。0037 本发明提供的上述鲍鱼内脏酸性多糖是从鲍鱼内脏提取出的多糖。0038 所述鲍鱼内脏酸性多糖的平均分子量为32.5Kda。0039 本发明还提。

14、供了上述鲍鱼内脏酸性多糖的提取方法，分离纯化方法和鉴定方法。0040 本发明还提供了一种用于促进肝细胞的增殖的药物或保健品，其包括上述的鲍鱼内脏酸性多糖。0041 本发明提供了一种用于修复体内急性肝细胞损伤的药物或保健品，其包括上述的说明书CN 102898538 A4/8页6鲍鱼内脏酸性多糖。0042 本发明还提供了上述的鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于促进肝细胞的增殖的药物或保健品中的应用。0043 本发明还提供了上述的鲍鱼内脏酸性多糖在制备用于修复体内急性肝损伤的药物或保健品中的应用。0044 以下采用实施例和附图来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达。

15、成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。0045 实施例1：鲍鱼内脏酸性多糖的提取及分离纯化，依次进行以下步骤：0046 1)、将100g干鲍鱼内脏磨成粉状物，加入2000mL的混合氯仿-甲醇（V:V，2:1）的混合溶液，浸泡12h，过滤，滤渣烘干。0047 2）、取步骤1）烘干所得鲍鱼内脏粉末，加入3000mL混合缓冲液，并加入10g木瓜蛋白酶，于60水浴下搅拌反应24h，该混合缓冲溶液的制备方法如下：在每升0.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH6.0)中加入5mmol的EDTA和5mmol的半胱氨酸。0048 3)、将步骤2)所得的酶解后产物离心(2000g，15min，20)，向所得上清液。

16、中加入80mL质量浓度为10的氯化十六烷基吡啶(CPC)水溶液，室温下放置24小时后，离心(2000g，15min)，弃去上清液。0049 4)、将步骤3)所得的沉淀溶解于1500mL的NaCl的乙醇水溶液(NaCl的浓度为3mol/L，乙醇:水100:15,v/v)中，再加入3000mL 95(体积浓度)乙醇溶液，4放置24小时，离心(2000g，15min)，沉淀分别用100mL80和95(均为体积浓度)乙醇溶液洗2次，最后将沉淀于60干燥2小时，用蒸馏水溶解，用截流分子量为3500Da的透析袋脱盐，浓缩，冻干(于-62)，得鲍鱼内脏粗多糖7.6g，提取率约为15.2。0050 5)、将鲍。

17、鱼内脏粗多糖经过DEAE-52阴离子交换柱和S-200凝胶过滤柱分离纯化，具体的分离步骤如下：0051 将约1.0g鲍鱼内脏粗多糖溶于约30mL 0.1M NaAc-HAc（pH 6.0）缓冲溶液，过DEAE-52阴离子交换柱(2.620cm)，采用0-1.2mol/L NaCl缓冲盐溶液（0.1M NaAc-HAc，pH6.0）进行梯度洗脱，收集馏分5mL/管，用硫酸苯酚和Folin-酚测定多糖和蛋白质含量，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集样品，流动水透析24h，蒸馏水透析24h，冻干。0052 取上述分离的多糖约100mg溶于1mL超纯水中，过Sephacryl S-200凝胶柱（1.610。

18、0cm），采用0.2mol/L NaCl进行洗脱，收集馏分2min/管，根据苯酚-硫酸法检测管中的多糖含量，收集峰尖样品，流动水透析24h，蒸馏水透析24h，冻干，得到鲍鱼内脏酸性多糖纯品。所得多糖通过液相TSK4000柱子检测纯度和分子量，结果表明鲍鱼内脏酸性多糖的平均分子量约为32.5KDa，纯度为99.1%。0053 实施例2对实施例1所得的鲍鱼内脏酸性多糖进行结构解析0054 1）、取上述实施例1所得鲍鱼内脏酸性多糖2.0mg于安培瓶中，加入1mL 2molL-1TFA，充氮气封管,110下水解8h。随后冷却至室温，50的温度下挥干TFA,逐次分别以2molL-1、0.3molL-1N。

19、aOH溶液调至中性，超纯水定容至1mL，取450L并50L内标物乳糖进行PMP衍生化。色谱条件：色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪、色谱柱：ZORBAX EclipseXDB-C18分离柱（4.6150mm,5m）、检测器：紫外检测器，245nm、流速：1.0mLmin-1、柱温：25、流动相：溶剂A:10%(V/V)乙腈+0.1molL-1乙酸铵-乙酸说明书CN 102898538 A5/8页7缓冲液(pH 5.5)，溶剂B:25%(V/V)乙腈+0.1molL-1乙酸铵-乙酸缓冲液(pH 5.5)、梯度模式：时间梯度:040min，浓度梯度：45100%溶剂B、进样体积：1。

20、0L。见图2，结果表明鲍鱼内脏酸性多糖的单糖组成为鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸（GlcA）和半乳糖（Gal），其比例为6.40:3.69:1.0。0055 2）、取上述实施例1所得鲍鱼内脏酸性多糖2mg，加1mL浓度2molL-1TFA 110的温度下水解10h，80左右挥干TFA，以超纯水超声溶解，定容到25mL，取2.5mL采用离子色谱法测定硫酸基含量，以硫酸钾作标准品建立标准曲线，结果表明获得的鲍鱼内脏酸性多糖的硫酸基为15.2%。0056 3）、上述实施例1所得鲍鱼内脏酸性多糖与KBr压制成片，使用Vector22型傅立叶红外光谱仪，扫描4000400cm-1波数范围的光谱吸收值。结果。

21、见图3，结果表明鲍鱼内脏酸性多糖在3600-3200cm-1都出现了一个宽的O-H伸缩振动峰，在2936cm-1附近的吸收峰为鼠李糖甲基的吸收峰，在1641cm-1和1389cm-1附近(羧基C=O伸缩，C-O伸缩)处有吸收，说明鲍鱼内脏酸性多糖中含有糖醛酸，这与单糖组成分析结果相一致，1231（SO的伸缩振动峰）和843cm-1（C-O-S的伸缩振动峰）处有强烈吸收，进一步表明鲍鱼内脏酸性多糖富含硫酸基；1051cm-1处强吸收峰为C-O-C或C-O-H的伸缩振动。0057 4）、取上述实施例1中所得的鲍鱼内脏酸性多糖50mg，以0.5mL D2O(浓度为99.96%)连续交换2次，经0.5。

22、mL D2O(浓度为99.96%)溶解后，用Bruker AVANCE III 600核磁共振波谱仪测定1H NMR，DEPT，1H-1H COSY，TOCSY，NOESY，1H-13C HMQC，HMBC。测定条件：60，600MHz；内标：DSS。对于糖化合物来说，1H NMR谱（图4）中C-1上的质子(H-1)信号通常在4.55.6ppm，较易解析，其他C-2C-6的质子信号均集中在3.24.8ppm，互相重叠交叉，解析困难。在1.1ppm左右应为-CH3，在鲍鱼内脏酸性多糖中该处的信号峰较高，结合单糖组成，该处应为Rha-CH3的质子。集中在3.24.6ppm是C-2C-6的质子信号，。

23、其互相重叠交叉，解析困难。化学位移在4.60ppm左右的1H应该为-D-GlcUA1H，化学位移在5.0ppm及5.32ppm左右的信号峰的应为构型鼠李糖的异头氢化学位移数据。0058 在鲍鱼内脏酸性多糖的DEPT谱（图5）中，其高场区（050）出现1个碳信号（16.85），为Rha-CH3碳信号。在6578之间信号峰较为复杂，很难分，应为C-2，C-3，C-4的化学位移，在78.59的碳信号应为C-2，C-3，C-4中某个碳上有取代基，在63.2处的信号峰为仲碳，应归属为Gal-C-2说明C-6上发生了取代；在98106之间出现的信号峰为异头碳区，该区信号较复杂，较难确定异头碳数目，需进一步。

24、借助二维谱图鉴定。0059 鲍鱼内脏酸性多糖的HMQC谱异头碳区信号（图6）确定鲍鱼内脏酸性多糖中主要含有7种糖单元，并根据异头碳信号对应确定7种异头氢信号，结合1H-1H TOCSY谱（图7），从1H-1H COSY中异头氢信号出发，顺次确定H-2，H-3，H-4，H-5，H-6信号，确定各糖单元氢的化学位移，再根据HMQC谱对各糖单元的碳信号进行归属，见表所示。0060 糖残基A-D的异头氢化学位移大于4.80，C-6位为甲基，说明A-D均为构型鼠李糖（-L-Rha）；糖残基F、G的异头氢化学位移小于4.80，H-2化学位移较低，说明为-D-GlcA；糖残基E应为-D-Gal。对于硫酸基团。

25、的取代位置归属，由于硫酸酯化会导致碳和氢信号均会向低场移动糖残基A-4(C4/H4,80.1/4.64),B-2(C2/H2,80.3/4.27),D-3(C3/H3,4.53/80.7),说明A，B，D分别为-L-Rha(4SO4),-L-Rha(2说明书CN 102898538 A6/8页8SO4),-L-Rha(3SO4)。0061 进一步借助1H-1H NOESY和1H-13C HMBC异核间1H-1H和1H-13C耦合相关信号（表2）确定糖残基间的连接方式和连接顺序。如表所示，通过NOE信号可以观察到异头氢与连接糖残基位连接氢的相关信号，即：A H-1/E H-3,B H-1/G。

26、 H-3,C H-1/D H-2,D H-1/F H-3,E H-1/B H-3,F H-1/D H-4,G H-1/BH-4，确定了残基间的连接方式为，A(14)E,B(13)G,C(12)D,D(13)F,E(13)B,F(14)D,G(14)B。1H-13C HMBC进一步确定了NOESY谱所确定的信息，并且同时包括异头碳与连接糖残基位连接氢的相关信号，异头氢与连接糖残基位连接碳的相关信号，如表2所示。结合硫酸基取代位点以及确定的糖残基之间的连接方式和连接顺序，最终确定鲍鱼内脏酸性多糖主要由以下两个结构单元I和II构成，并根据1H NMR中对应异头氢信号的积分比，确定两个结构单元的比例为。

27、2:1。0062 表1鲍鱼内脏酸性多糖的1H和13C的化学位移归属0063 0064 表2鲍鱼内脏酸性多糖NOESY谱和HMBC谱的归属0065 说明书CN 102898538 A7/8页90066 0067 综合上述分析可得出如下结论：0068 因此，本发明中的鲍鱼内脏酸性多糖的主要结构单元如图1中式1所示，主要包括I和II两种结构单元，其比例为2：1，是首次从青岛产鲍鱼内脏中分离得到的一种结构新颖的酸性多糖。0069 实施例3鲍鱼内脏酸性多糖促进细胞增殖活性0070 1）、MTT法检测多糖对HepG2细胞的增殖作用将处于对数生长期的HepG2细胞，用RPMI1640完全培养基（含10%。

28、新生牛血清）制成密度为2104个mL-1的细胞悬液，接种于96孔培养板内，100L/孔。待24h贴壁后更换成浓度分别为25g mL-1，50g mL-1，100g mL-1，200g mL-1和400g mL-1的多糖，每个浓度设4个复孔，200L/孔。空白对照组加等量的完全培养基。37、5%CO2条件下分别培养24h、48h和72h后，弃去培养基，加入MTT液（PBS液配制，终浓度为0.5mgmL-1）。继续培养4h后，吸去上清液，加入酸化异丙醇，吹打至蓝色结晶物完全溶解，酶标仪测570nm各孔吸光度（A）。MTT/%=A570(样品组)/A570(空白对照组)100%。0071 2）、Ed。

29、U法检测多糖对HepG2细胞的增殖指数0072 细胞布板和培养条件同上。加样品培养48h后，弃培养基，每孔加入100L50M的EdU培养基孵育2h，弃培养液，PBS清洗细胞2次，每次5min。然后每孔加入100L含4%多聚甲醛的PBS细胞固定液室温孵育30min，使细胞固定，之后经EdU染色，在荧光显微镜下拍照，具体按照IX-51型倒置荧光显微镜系统和Edu荧光显微镜检测试剂盒说明进行程序设置和实验操作。0073 见图8，图中a为MTT测定体外对HepG2细胞增殖的影响，图b为Edu法测定对HepG2细胞的增殖指数，MTT实验和EdU实验结果显示，与对照组相比，鲍鱼内脏酸性多糖的细胞存活率明显。

30、增加，且呈现一定的剂量-效应关系，说明其具有良好的增殖效果。0074 实施例4鲍鱼内脏酸性多糖对肝损伤的修复作用0075 1）、体外鲍鱼内脏酸性多糖对氧化损伤的hepG2细胞修复作用0076 取对数生长期的HepG2细胞，经0.25%胰酶消化，用RPMI完全培养基(含10%新生牛血清)制成密度为1105个/mL的细胞悬液，加入96孔培养板，每孔100L。培养24h后，加入200L叔丁基过氧化氢（t-BHP），t-BHP作用浓度为200mol/L，对照组加入等量的无血清培养基，培养4h，弃掉培养液，PBS清洗2-3遍，弃培养液，加入200L不同浓度的说明书CN 102898538 A8/8页。

31、10鲍鱼内脏酸性多糖，对照组和模型组加入等量的培养基（含2%血清），孵育24h后，MTT法检测细胞存活率。0077 实验数据以xSE表示，采用SPSS11.0软件进行ONE WAY ANOVA分析，以P0.05为有显著差异。0078 实验结果显示鲍鱼内脏酸性多糖对叔丁基过氧化氢引起的HepG2细胞的氧化损伤具有显著的修复作用。0079 表3鲍鱼内脏酸性多糖对氧化损伤HepG2细胞的修复效果0080 正常组模型组 50ug/mL 100ug/mL修复作用 1003.0 57.52.4# 85.42.0*1103.0*0081 *P0.05,*P0.01，与模型组比较；#P0.05，与正常组比较。

32、0082 2）、鲍鱼内脏酸性多糖对四氯化碳致大鼠急性肝损伤的修复作用0083 实验动物为SD大鼠，雄性，体重180g-200g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2009-0007。大鼠基础饲料适应性喂养1周后，按体重随机分为4组：正常组、模型组、鲍鱼内脏酸性多糖低剂量组和鲍鱼内脏酸性多糖高剂量组，每组9只。各组分别于每日9时灌胃相应受试物。鲍鱼内脏酸性多糖低剂量组和高剂量组分别按照（100mg/kg）、（300mg/kg）的剂量灌胃鲍鱼内脏酸性多糖，正常和模型组分别灌胃相同体积的生理盐水，连续5天。实验第1天和第4天，灌胃前1h分别对模型组、鲍鱼多糖剂量组腹腔注射。

33、体积分数为50%的CCl4花生油，2ml/kg B.W.，正常组注射相同体积的花生油。0084 实验第7天，乙醚麻醉大鼠后，腹主动脉取全血处死，测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性。；取左叶肝组织，10%中性甲醛固定作病理切片，进行HE染色，在光镜下观察肝组织的病理学变化。肝脏脂肪按Folch等的方法抽提，肝脏TC和TG由试剂盒测定。0085 见图9，10，灌胃鲍鱼内脏酸性多糖有效地抑制了血清中肝损伤指示酶ALT和AST的活性，并能改善肝脏功能受损所伴随的脂肪过度蓄积。0086 见图11，组织学观察显示正常组大鼠肝脏呈红褐色，质地柔软；在光镜下观察到肝细胞结构完整，未见变性。

34、、坏死等明显病理改变，肝小叶界限清晰，核质分布均匀。模型组大鼠肝脏体积增大，模型组中央静脉周围因细胞凋亡产生的间隙明显增大，剂量组显著改善。模型组大量细胞核固缩、溶解等细胞凋亡迹象，剂量组明显改善，特别是高剂量组，高剂量组的切片中存在增殖细胞。所以鲍鱼内脏酸性多糖对于四氯化碳引起的急性肝损伤具有一定的改善作用。0087 所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。0088 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。说明书CN 102898538 A10。

展开阅读全文