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1、10申请公布号CN104312944A43申请公布日20150128CN104312944A21申请号201410495939X22申请日20140924C12N1/20200601C02F3/34200601B09C1/10200601C12R1/01200601C02F103/0620060171申请人华南理工大学地址511458广东省广州市南沙区环市大道南路25号华工大广州产研院72发明人党志李静华郭楚玲何丽媛易筱筠卢桂宁杨琛74专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245代理人宫爱鹏54发明名称一种微生物制剂及其制备方法和应用57摘要本发明公开了一种微生物制剂及其制备方法和应用。
2、，该微生物制剂由烷烃降解菌GS3C、菲降解菌GY2B和芘降解菌GP3B三菌株组成或者由其中的GS3C和GP3B两菌株组成；所述GS3C、GY2B、GP3B已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为CCTCCNOM207169、CCTCCNOM206019、CCTCCNOM207167。本发明所提供的微生物制剂可在石油污染水体和土壤生物修复中应用；水体中降解石油，其去除率可达692，且对石油中的烷烃和芳烃类化合物都有较强的降解能力。以不灭菌的玉米秸秆为载体固定混合菌GMIX3，水体培养3D对石油的去除率达到982。51INTCL权利要求书1页说明书8页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局。
3、12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图6页10申请公布号CN104312944ACN104312944A1/1页21一种微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂由烷烃降解菌GS3CBURKHOLDERIACEPACIA、菲降解菌GY2BSPHINGOMONASSP和芘降解菌GP3BPANDORAEAPNOMENUSA三菌株组成或者由其中的GS3C和GP3B两菌株组成；所述GS3C、GY2B、GP3B已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为CCTCCNOM207169、CCTCCNOM206019、CCTCCNOM207167。2根据权利要求1所述的微生物制剂，其特征在于，将所述菌株混合。
4、制成固定化微生物制剂。3根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述固定化微生物制剂的制备将所述菌株混合后进行扩大培养，得到的扩大培养液再与载体进行混合培养，即得到固定化微生物制剂，所述载体为农业废弃物。4权利要求13任一项所述微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1将单菌株在石油培养基中梯度驯化培养；2驯化过的单菌株利用富集培养基扩大培养，离心洗涤，用无菌水配置OD600为05的菌悬液；3将单菌株的菌悬液等体积混合，即得到微生物制剂。5根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤A将微生物制剂按体积百分数26的量接入2000MG/L的石油培养基，调节PH为7，30培养。
5、57天，即得混合菌的扩大培养液；B将扩大培养液与载体按质量比1135混合均匀，30下共培养3天，即制得固定化微生物制剂。6根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的石油培养基的配制方法50ML磷酸盐缓冲液，浓度225GL1的MGSO4水溶液30ML，浓度364GL1的CACL2水溶液10ML，浓度025GL1的FECL3水溶液10ML，10ML微量元素溶液，2000MG石油，调PH为70，蒸馏水定容至1L；所述的富集培养基为10G蛋白胨，5G牛肉膏，5GNACL，调PH为70，蒸馏水定容至1L。7根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的配方为85GL1KH2PO4，2。
6、175GL1K2HPO4H2O，334GL1NA2HPO412H2O，50GL1NH4CL；所述微量元素溶液的配方为399MGL1MNSO4H2O，428MGL1ZNSO4H2O，347MGL1NH46MO7O244H2O，所述的石油为轻质油，密度为0863GCM31。8根据权利要求47任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的载体经如下预处理载体为玉米秸秆、稻草秸秆或木屑，经风干，机械破碎，过0209MM孔径的筛网，水洗至无色，60烘干12H以上。9根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的梯度驯化依次增加石油的浓度为500MG/L、1000MG/L、1500MG/L和2000MG/L；。
7、同时，逐渐减少单菌株相应的原始碳源浓度，其中GS3C菌的正十六烷1500MG/L、1000MG/L、500MG/L和0；GY2B菌的菲100MG/L、50MG/L、10MG/L和0，GP3B菌的芘15MG/L、10MG/L、5MG/L和0。10权利要求13任一项所述的微生物制剂在石油污染水体和土壤生物修复中的应用。权利要求书CN104312944A1/8页3一种微生物制剂及其制备方法和应用技术领域0001本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一种混合菌株微生物制剂及其制法和应用。背景技术0002石油是人类生产和生活中不可缺少的重要能源和工业原料。随着石油的广泛应用，石油的开采、冶炼。
8、、加工、运输、储存等过程中的泄漏，以及含油废水废物的排放，造成了严重的环境污染。大量的石油及其加工品进入水体，导致水体缺氧，破坏生态系统平衡，若进入土壤，则破坏土壤结构，影响土壤通透性，导致土壤肥力下降，同时还能直接损害植物根部，阻碍根的呼吸与吸收，影响作物生长甚至死亡，从而直接影响人类生产和生活。石油中的多环芳烃PAHS具有严重的致癌变、致突变、致畸变“三致”作用，可在作物中积累，不仅影响粮食质量和产量，还可通过食物链危害生物和人类健康。因此,对石油污染水体和土壤进行治理，是摆在我们面前急需解决的问题。0003生物修复技术以处理成本低、无二次污染等优势，逐渐成为治理石油污染的重要方法。石油是。
9、由饱和烃、芳香烃类化合物和少量的沥青质、树脂类等组成的复杂混合物，而单菌株往往只能代谢一种或几种有限的石油组分。混合菌群之间的共生、协同等作用可以使混合菌对石油的降解效果往往高于单株菌。目前对菌群构建的研究只是把分离得到的单菌种简单随意地组合成菌群，很难达到预期的目标。因此，利用可降解石油不同组分烷烃和芳香烃的优势菌种间的协同作用，可以优化组合出高效的降解菌群。0004投加高效降解菌进行实地修复时，常常受到各种因素土壤理化性质、环境因素、生物物种间竞争和捕食等的干扰，导致投加菌数量迅速降低、无活性或者死亡，影响对石油的修复效果。0005固定化微生物技术采用物理或化学手段将游离细胞微生物固定在多。
10、孔性的载体上，使微生物高度密集并保持其生物活性功能，减少外界不利因素对微生物的干扰，能有效改善传统生物修复技术的不足，有利于对石油污染的实地生物修复。发明内容0006本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高效石油降解菌群的构建方法及其固定化方法和应用。本发明针对上述现有石油污染生物修复技术所面临的问题，设计降解机理互补、协同作用好的混合菌剂，并将其固定化，对石油污染的水体和土壤进行修复应用。0007本发明目的通过以下技术方案来实现0008一种微生物制剂，由烷烃降解菌GS3CBURKHOLDERIACEPACIA、菲降解菌GY2BSPHINGOMONASSP和芘降解菌GP3BPAND。
11、ORAEAPNOMENUSA三菌株组成或者由其中的GS3C和GP3B两菌株组成；所述GS3C于2007年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，地址武汉市武昌洛枷山，武汉大学，邮编430072，保藏编号为说明书CN104312944A2/8页4CCTCCNOM207169；GY2B于2006年2月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM206019；GP3B于2006年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM207167。0009将所述菌株混合制成固定化微生物制剂。0010所述固定化微生物制剂的制备将所述菌株混合后进行扩大培养，得。
12、到的扩大培养液再与载体进行混合培养，即得到固定化微生物制剂，所述载体为农业废弃物。0011上述微生物制剂的制备方法，包括以下步骤00121将单菌株在石油培养基中梯度驯化培养；00132驯化过的单菌株利用富集培养基扩大培养，离心洗涤，用无菌水配置OD600为05的菌悬液；00143将单菌株的菌悬液等体积混合，即得到微生物制剂。上述制备方法还包括如下步骤0015A将微生物制剂按体积百分数26的量接入2000MG/L的石油培养基，调节PH为7，30培养57天，即得混合菌的扩大培养液；0016B将扩大培养液与载体按质量比1135混合均匀，30下共培养3天，即制得固定化微生物制剂。0017所述的石油培养。
13、基的配制方法50ML磷酸盐缓冲液，浓度225GL1的MGSO4水溶液30ML，浓度364GL1的CACL2水溶液10ML，浓度025GL1的FECL3水溶液10ML，10ML微量元素溶液，2000MG石油，调PH为70，蒸馏水定容至1L；0018所述的富集培养基为10G蛋白胨，5G牛肉膏，5GNACL，调PH为70，蒸馏水定容至1L。0019所述磷酸盐缓冲液的配方为85GL1KH2PO4，2175GL1K2HPO4H2O，334GL1NA2HPO412H2O，50GL1NH4CL；0020所述微量元素溶液的配方为399MGL1MNSO4H2O，428MGL1ZNSO4H2O，347MGL1NH。
14、46MO7O244H2O，所述的石油为轻质油，密度为0863GCM31。0021所述的载体经如下预处理载体为玉米秸秆、稻草秸秆或木屑，经风干，机械破碎，过0209MM孔径的筛网，水洗至无色，60烘干12H以上。0022所述的梯度驯化依次增加石油的浓度为500MG/L、1000MG/L、1500MG/L和2000MG/L；同时，逐渐减少单菌株相应的原始碳源浓度其中GS3C菌的正十六烷1500MG/L、1000MG/L、500MG/L和0；GY2B菌的菲100MG/L、50MG/L、10MG/L和0，GP3B菌的芘15MG/L、10MG/L、5MG/L和0。0023所述的微生物制剂在石油污染水体和。
15、土壤生物修复中的应用。微生物制剂的添加量为26W/W。在土壤生物修复中的应用中，作为优选方案，还同时加入26W/W的表面活性剂量和/或051W/W的无机复合肥剂量。所述表面活性剂为阴非离子混合表面活性剂SDSTX100，摩尔比为21，配置的添加液中TX100浓度为29MMOL/L，SDS浓度为58MMOL/L。0024所述烷烃降解菌GS3C，其原始碳源为十六烷；菲降解菌GY2B，其原始碳源为菲；芘降解菌GP3B，其原始碳源为芘。0025本发明相对于现有技术的有益效果和优点说明书CN104312944A3/8页500261本发明所提供的微生物制剂由烷烃降解菌GS3C、菲降解菌GY2B和芘降解菌G。
16、P3B经石油驯化和重组构建而成的高效石油降解菌群，可降解石油不同组分的优势菌株优化组合构建功能菌群，能更有效地和广泛地降解石油组分；其最佳混合比为111，最佳条件为温度30，初始PH值70，接种量4，石油初始浓度2000MG/L，水体中降解石油5D，其去除率达692，且对石油中的烷烃和芳烃类化合物都有较强的降解能力。以不灭菌的玉米秸秆为载体固定混合菌GMIX3，水体培养3D对石油的去除率达到982。将固定化混合菌剂GMIX3以2W/W分3次加入石油污染浓度为137545MG/KG的土壤中60天可将石油去除530。00272利用的固定化载体价格低廉，废物回收利用，加入土壤后，不仅可保护和稳定微生。
17、物，而且膨松土壤使得更多氧分子进入，吸附部分有机物与微生物充分接触，从而有利于微生物降解土壤中石油各组分，实现对石油污染土壤的生物修复。附图说明0028图1各单菌株降解石油的GCMS谱图；0029图2组合的混合菌降解石油的GCMS谱图；0030图3构建的高效石油降解菌群GMIX3降解石油的离子碎片图；0031图4构建的高效石油降解菌群GMIX3的最佳生长和降解条件；0032图5构建的高效石油降解菌群GMIX3降解水体中石油的动力学曲线图；0033图6构建的高效石油降解菌群GMIX3降解石油过程中的GCMS谱图；0034图7秸秆固定化GMIX3与未固定化GMIX3对石油的降解效率对比图；0035。
18、图8构建的高效石油降解菌群GMIX3及其固定化菌剂的电子显微镜照片，A未灭菌玉米秸秆，B灭菌玉米秸秆，C固定化前的混合菌GMIX3，D玉米秸秆固定化GMIX3，E玉米秸秆与GMIX3简单混合；0036图9构建的高效石油降解菌群GMIX3的固定化制剂去除水体中石油的动力学曲线图。具体实施方式0037以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，但并不构成对本发明的限制。0038实施例10039优化最佳菌株组合0040菌株组合优化包括以下步骤0041A石油组分降解单菌株在无机盐培养基中梯度驯化培养；所述的梯度驯化依次增加碳源石油的浓度为500MG/L、1000MG/L、1500MG/L和2000MG。
19、/L；同时，逐渐减少单菌株相应的原始碳源浓度，其中GS3C菌的正十六烷1500MG/L、1000MG/L、500MG/L和0；GY2B菌的菲100MG/L、50MG/L、10MG/L和0，GP3B菌的芘15MG/L、10MG/L、5MG/L和0；0042所述的无机盐培养基的配制方法50ML磷酸盐缓冲液85GL1KH2PO4，2175GL1K2HPO4H2O，334GL1NA2HPO412H2O，50GL1NH4CL，30MLMGSO4水溶液225GL1，10MLCACL2水溶液364GL1，10MLFECL3水溶液025GL1，10ML微量元素溶液399MGL1MNSO4H2O，428MGL1。
20、ZNSO4H2O，347MGL1NH46MO7O244H2O，说明书CN104312944A4/8页6调PH为70，蒸馏水定容至1L。0043所述的石油为轻质油，密度为0863GCM31。0044B驯化过的单菌株利用富集培养基扩大培养，离心洗涤，用无菌水配置OD600为05的菌悬液；所述的富集培养基10G蛋白胨，5G牛肉膏，5GNACL，1L蒸馏水，调PH为70；0045C将单菌株的菌悬液按表1所述的不同组合等体积混合，分别按4体积百分数的总量接入2000MG/L的石油培养基上述无机盐培养基中添加2000MG/L的石油，调节PH为7，30培养，测量其在5天后对石油的去除率和石油组分去除情况，以。
21、得到降解效果最佳的混合菌剂。0046不同组合的菌株5天对石油的去除率如表1所示，不同组合的菌株5天对石油组分去除情况如图1图3所示。0047结果如下00481不同组合的菌株5天对石油的去除率0049四种单菌株其中GP3A为PSEUDOMONAS，于2006年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM207166经过长期的驯化后都能以石油为唯一碳源进行生长繁殖，对石油的去除率都达到30以上。0050但是，把可以利用石油的单菌株随意进行组合后，不一定有好的降解效果。有些组合的菌株对石油的降解效果比单菌株差，但是构建的混合菌组G3和G8效果最佳，比单菌株的去除率提高近30，。
22、分别命名为GMIX2和GMIX3。如表1所示。高效石油降解菌群GMIX2和GMIX3包含了能利用石油组分中的烷烃类化合物的菌株烷烃降解菌GS3C和芳烃类化合物的菌株菲降解菌GY2B和芘降解菌GP3B，这些菌通过共代谢作用，可以在降解过程中产生协同效应来提高对石油的去除。0051表10052说明书CN104312944A5/8页700532不同组合的菌株5天内对石油组分的去除情况0054GS3C能基本去除石油中的直链烷烃化合物，GY2B对芳烃类化合物有很好的降解效果。GP3B对烷烃类和芳烃类化合物的降解效果一般，如图1所示。将降解效果较好的混合菌组G1、G3GMIX2、G8GMIX3和G11培养。
23、液中的残油进行GCMS分析，如图2所示，这四组混合菌均包含有烷烃降解菌GS3C，能将石油中的直链烷烃类化合物基本去除，剩余一些难降解的支链烷烃。同时又含有芳烃类降解菌株，有利于混合菌对石油的完全去除。其中G8GMIX3对石油的总去除率最高，且对芳烃类化合物的降解效果显著，对萘同系物的去除率达到9922，对菲同系物的去除率达到8602，如图3所示。混合菌G8GMIX3中包含有对芳烃类化合物有强降解能力的鞘氨醇单胞菌GY2B，在混合体系中GY2B依然发挥了其降解特性。综上所述，烷烃类降解菌GS3C和芳烃类降解菌GY2B和GP3B可共生且协同降解石油组分中的烷烃类和芳烃类化合物，有利于对石油组分的完。
24、全降解。0055实施例20056高效石油降解菌群GMIX3的最佳生长和降解条件0057分别测试了高效石油降解菌群GMIX3中三株菌的不同比例、环境温度、培养液初始PH、接种量和不同初始石油浓度对石油的去除率和菌的生长量的影响，优化出高效石油降解菌群GMIX3的最佳降解条件为三株菌的最佳混合比为111OD600为05的母液；最适生长条件为温度30，培养液初始PH值70，接种量4，石油初始浓度2000MG/L。在最说明书CN104312944A6/8页8佳条件下，水体中降解石油5D，其去除率达692，且对石油中的烷烃和芳烃类化合物都有较强的降解能力。如图4所示。0058实施例30059高效石油降解。
25、菌群GMIX3降解石油随时间的变化。0060混合菌GMIX3在培养初期生长缓慢，进入对数期后，对石油的降解效果逐步增强。第4D时，混合菌的生长量激增，对石油的去除率达到了6804。第5天石油去除率达到最大值692。此后微生物生长进入稳定期和衰亡期，老龄菌增多，幼龄菌减少，反应体系中的菌体活性减弱，并且剩余的石油组分较难被生物降解，混合菌对石油的降解速率越来越低。如图5所示。0061GCMS图谱显示，如图6所示，随着降解时间的增加，混合菌GMIX3对石油的去除效果越来越明显。在降解初期第1天时，混合菌GMIX3对石油去除效果不明显。到第3天时，谱图中优势峰为姥鲛烷峰PRISTANE3530MIN。
26、和植烷峰4026MIN，按总峰面积计算去除率达到6248，大部分碳数C20的直链烷烃类化合物被去除，混合菌对长链烷烃化合物的降解效果较差。第5天时，直链烷烃类化合物已经被基本去除，去除率达到8315，剩余一些难降解的支链烷烃类如姥鲛烷、植烷等。此后随着降解天数的增加，混合菌对石油的降解速率越来越低。0062实施例40063高效石油降解菌群GMIX3的固定化制剂与未固定化的对比及其电子显微镜结构。0064固定化微生物制剂的制备，包括以下步骤00651石油组分降解单菌株在石油培养基中梯度驯化培养；所述的梯度驯化依次增加石油的浓度为500MG/L、1000MG/L、1500MG/L和2000MG/L。
27、；同时，逐渐减少单菌株相应的原始碳源浓度，其中GS3C菌的正十六烷1500MG/L、1000MG/L、500MG/L和0；GY2B菌的菲100MG/L、50MG/L、10MG/L和0，GP3B菌的芘15MG/L、10MG/L、5MG/L和0；0066所述的石油培养基的配制方法50ML磷酸盐缓冲液85GL1KH2PO4，2175GL1K2HPO4H2O，334GL1NA2HPO412H2O，50GL1NH4CL，30MLMGSO4水溶液225GL1，10MLCACL2水溶液364GL1，10MLFECL3水溶液025GL1，10ML微量元素溶液399MGL1MNSO4H2O，428MGL1ZNS。
28、O4H2O，347MGL1NH46MO7O244H2O，2000MG石油，调PH为70，蒸馏水定容至1L。0067所述的石油为轻质油，密度为0863GCM31。00682驯化过的单菌株利用富集培养基扩大培养，离心洗涤，用无菌水配置OD600为05的菌悬液；所述的富集培养基10G蛋白胨，5G牛肉膏，5GNACL，1L蒸馏水，调PH为70；00693将单菌株的菌悬液等体积混合，即为本发明的高效微生物制剂；00704扩大培养将高效微生物制剂按4体积百分数的量接入2000MG/L的石油培养基，调节PH为7，30培养5天，即可得高效石油降解菌群的扩大培养液；00715固定化制剂载体玉米秸秆/稻草秸秆经风。
29、干，机械破碎，过0209MM孔径的筛网，自来水洗涤至无色，60烘干12H以上；将上述扩大培养液与载体玉米秸秆/稻草秸秆按质量比35混合均匀，30下共培养3天，即为高效石油降解菌群的固定化制剂。00726以2030G/L载体干重的菌剂量加入石油培养基中石油初始浓度为说明书CN104312944A7/8页92000MG/L并以相同质量的玉米秸秆、稻草秸秆分别和高效石油降解菌群GMIX3简单混合配成载体与菌液的混合物，以只有游离状态的GMIX3为对照，置于30、转速为180R/MIN的摇床振荡培养3D，测其石油去除率。0073如图7所示，采用稻草/玉米秸秆固定化混合菌GMIX3的效果高于未固定化过的。
30、游离菌GMIX3，也高于稻草/玉米秸秆与GMIX3的简单混合物。稻草/玉米秸秆对石油有一定的分散作用，同时还能将石油吸附到秸秆表面。只加入秸秆的石油培养基，石油都分散到溶液中形成大量的油/水界面，有利于界面上石油的生物降解。经过固定化的混合菌GMIX3表现了很强的石油去除效果，比未固定化的游离混合菌GMIX3提高了近40，稻草秸秆固定化GMIX3第3天的石油去除率达到了9095，玉米秸秆固定化GMIX3第3天的石油去除率达到了9598。混合菌经过固定化后，大量微生物被吸附到秸秆内的空隙中形成高浓度菌群，而培养基中还有少量悬浮的微生物，两部分微生物同时对石油进行降解，使得石油的去除效果得到很大的。
31、提升。秸秆是否经过灭菌处理对石油的去除效果也有一定的影响。不灭菌的效果都比灭菌的效果要好。秸秆类物质一般含有约1625的木质素，它是纤维素的外围基质，起着赋予纤维机械强度以及保护纤维素免遭破坏的作用。但是在温度为120，压力维持在01015MPA的高温高压状态下灭菌30分钟后，部分木质素受到了高温蒸汽的破坏，秸秆上的吸附位减少，对石油和混合菌的吸附能力下降，影响了对石油的去除效果。0074由扫描电子显微镜图8所示，未灭菌的秸秆表面经过破碎机而造成部分碎裂，暴露出秸秆内部紧密排列的中空纤维素管，秸秆内的木质素未被破坏，仍能支撑起秸秆内多片层结构的中空纤维素管，使秸秆具有较大的比表面积，较多的吸附。
32、位点，有利于吸附混合菌GMIX3进行表面吸附固定化，秸秆内的中空纤维素管还有利于底物和代谢产物的扩散，为维持微生物正常生理代谢提供了足够的空间和氧气。秸秆与GMIX3的混合物因未进行固定化，秸秆表面吸附的微生物量较少且吸附得不牢固，容易被冲洗下去。经过固定化的混合菌GMIX3能吸附在中空纤维素管内部以及秸秆的缝隙间，混合菌菌体密度明显未固定化中的高，而且混合菌成团状生长，菌体形态均匀表面光滑。0075总之，采用秸秆固定化混合菌GMIX3的效果高于未固定化过的游离菌GMIX3，也高于秸秆与GMIX3的简单混合物。不灭菌的秸秆作为载体固定混合菌GMIX3后，既利用了秸秆对石油的分散和吸附作用，又充。
33、分利用了混合菌对石油的生物降解作用，促进石油的去除效果，能更有效的把石油从环境中清除。0076实施例50077高效石油降解菌群GMIX3固定化制剂对水体中石油的降解情况。0078以2030G/L载体干重的高效石油降解菌群的固定化菌剂量加入石油培养基中石油初始浓度为2000MG/L，置于30、转速为180R/MIN的摇床振荡培养，不同时间点取样测其石油去除率。0079如图9所示，玉米秸秆固定化GMIX3对石油的去除率随着时间的增加而逐渐增大。在降解1D后，对石油的去除率已经达到了8439，比游离混合菌GMIX3在1D时的去除率提高了近60，显著强化了混合菌的降解速率。降解3D后，对石油的去除率达。
34、到了9381，此后随着时间的增加对石油的去除效果趋于平缓。以玉米秸秆为例，但不仅限于玉米秸秆。0080实施例6说明书CN104312944A8/8页100081高效石油降解菌群GMIX3固定化制剂对土壤中石油的降解情况。0082采用正交实验设计，利用高效石油降解菌群GMIX3固定化制剂对石油污染土壤进行修复实验，将GMIX3固定化制剂投加总量、菌剂投加次数、表面活性剂用量和无机复合肥量设置为四个因素，每个因素三个水平。实验用土壤为某炼油厂附近实际污染的土壤，PH为4143，有机质含量约为4，CNP为11641，属于砂质粘壤土。实验在尺寸为170MM/120MM/150MM的盆钵中进行，每个盆钵。
35、装15KG的土，置于实际环境条件温度2734；相对湿度4070。高效石油降解菌群GMIX3固定化制剂含有总菌量约298108CFU/G载体此处为木屑，但是不仅局限于木屑。菌剂投加时间点分别为初始、第7天和第14天。表面活性剂为阴非离子混合表面活性剂SDSTX100，摩尔比为21，配置的添加液中TX100浓度为29MMOL/L，SDS浓度为58MMOL/L。无机复合肥为恩泰克稳定性长效复合肥，氮磷钾比例22711，总养分40含硝态氮，属于硫酸钾型复合肥，相应剂量的三分二磨碎后直接加入土壤作为缓释肥，剩下的三分之一溶于水溶液注入土壤作为速效肥。每23天翻耕土壤并补水至20左右。2个月后，测量总石油。
36、烃的变化。0083如表2所示，石油去除效果最佳的条件为2W/W的石油降解菌群GMIX3固定化制剂分3次加入，且加入6V/W的SDSTRITONX100摩尔比为21，60天可将酸性土壤中的总石油烃浓度从137545MG/KG降低至64646MG/KG，去除了53。当土壤中的CNP为11641时，无需加入无机复合肥，因为无机复合肥含有一定盐成分，不利于微生物的生长繁殖。制剂投加量和投加次数对去除土壤中的石油均有显著性的影响。0084表2008500860087上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104312944A101/6页11图1说明书附图CN104312944A112/6页12图2图3说明书附图CN104312944A123/6页13图4说明书附图CN104312944A134/6页14图5图6说明书附图CN104312944A145/6页15图7说明书附图CN104312944A156/6页16图8图9说明书附图CN104312944A16。