一种尺寸均一的琼脂糖凝胶微球及其制备方法.pdf

本发明提供尺寸均一、可控、高亲水性和高度多孔性的琼脂糖凝胶分离介质，以用于生物活性物质的分离纯化等。其特征是(1)将一定量的琼脂糖在加热条件下溶于一定量的水中配制一定浓度的琼脂糖水溶液，将该水相用压力通过微孔膜压入油相中，得到尺寸均一的乳滴；(2)将此乳液转入到冷却装置中采用程序降温和缓慢机械搅拌的条件下冷却至15℃以下使胶凝固化得尺寸均一的琼脂糖凝胶微球。在优化条件下，琼脂糖凝胶微球的直径分布系数控制在11％以内，直径可在1－100微米内自由控制。该技术解决了传统搅拌乳化法制备的琼脂糖凝胶微球粒径不均一、分离时压力变化大导致的分离效果差的问题。本发明利用粒径的均一性特性，达到装柱均匀，从而使分离时压力稳定、提高流速、提高分离效率。

1、  一种尺寸均一的琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于(1)水相(W)是一定浓度的琼脂糖水溶液；(2)油相(O)是溶解了油溶性乳化剂的、和与水互不相溶的油性物质；(3)将水相在一定温度下用压力通过微孔膜压入油相，得到尺寸均一的W/O型乳滴；(4)将尺寸均一的W/O型乳液在缓慢的机械搅拌下程序降温至15℃以下使胶凝固化得琼脂糖凝胶微球。

2、  如权利要求1所述的一种尺寸均一的琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，琼脂糖溶液的浓度范围为0.1wt％-20.0wt％，优选范围为1.0-10.0wt％。

3、  如权利要求1所述的一种尺寸均一的琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，水相与外油相的体积比为1∶1-1∶1000，优选范围为1∶5-1∶100。

4、  如权利要求1所述的一种尺寸均一的琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，水相是在温度高于45℃的条件下用压力通过微孔膜压入油相中，不同浓度的琼脂糖溶液进行膜乳化所需要的温度也不尽相同，浓度越大所需要的温度越高。

5、  如权利要求1所述的一种尺寸均一的琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，尺寸均一的琼脂糖乳液在程序降温和机械搅拌条件下胶凝固化，降温和机械搅拌都要缓慢，降温速度低于2℃/min，搅拌速度在100rpm左右，降温至15℃以下即得琼脂糖凝胶微球。

6、  如权利要求1所述的一种尺寸均一的琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，所使用的微孔膜表面为疏水性。

7、  如权利要求1所述的方法制备的尺寸均一的琼脂糖凝胶微球，其特征在于，凝胶微球的尺寸均一，由下式定义的直径分布系数(CV值)控制在20％以内，在优化条件下可控制在13％以内。
直径可在1-100微米内自由控制，
直径分布系数(Coefficient of Variation，CV)＝{[∑(d_i-d)²/N]^1/2/d}×100％
上式中，d_i为各个凝胶的直径，d为数平均直径，N为用于计算直径的凝胶的数量，N≥200个。

8、  如权利要求7所述的一种尺寸均一的琼脂糖凝胶微球，其特征在于，凝胶之间无合并现象，尺寸非常均一，而且粒径可控，无需进行筛分。

一种尺寸均一的琼脂糖凝胶微球及其制备方法
技术领域
本发明属于生物工程的生化分离领域
背景技术
琼脂糖凝胶是天然多糖类层析介质，早在20世纪60年代就已经出现，它具有理想介质的许多特性：高亲水性、高度多孔性、含较多的可活化羟基、不与生物大分子发生非特异性吸附，是迄今为止应用最广泛的一种层析介质^[1]。由于琼脂糖上含有较多的可活化羟基，可以在一定的条件下接入不同的配基，作为亲和层析、疏水和离子交换色谱的介质，随着研究与应用的不断深入，琼脂糖凝胶不仅作为常压和低压层析的介质，而且已能在中压下操作和实现快速高效层析分离，分离对象涉及蛋白质、核酸、肽类、糖类等水溶性生化物质^[2]-[6]。琼脂糖凝胶除了作为分离介质外，还可以作为活细胞载体，如Shahab Lahooti^[7]等人采用琼脂糖作为羟乙基丙烯酰甲酯与甲基丙烯酰甲酯共聚物微球的内核物质包埋HEK细胞，琼脂糖一方面可以使细胞得到均匀分散，有利于营养物质和代谢产物的扩散，另一方面可以降低微球膜材的浓度，增加膜的通透性，有利于足够的营养物质进入微球内供细胞生长。研究表明琼脂糖的加入有利于被包埋细胞活性的保持和细胞的分裂增殖，实验结果表明与没有琼脂糖相比14天后细胞增殖为其两倍多，这主要是由于琼脂糖凝胶不仅使细胞分散均匀，而且还起到了为细胞提供一种支持底物的作用。Hiroyuki Hayashi^[8]等人采用琼脂糖制备了三层凝胶囊用来包埋B细胞线MIN6，研究结果表明与未包埋的MIN6相比，胰岛素的分泌速度增加了1倍多。
然而目前无论是作为分离介质还是活细胞载体，琼脂糖凝胶的制备方法非常有限，主要是采用超声、机械搅拌、均质乳化等普通的乳化冷凝法和喷射冷凝法，采用这些方法在制备乳液过程中，由于粒径不均一，小的乳滴会被大的乳滴吸收，同时大的乳滴又会因剪切力的作用而被破坏，这会导致最终制得的琼脂糖凝胶微球粒径很不均一，因此在凝胶微球的洗涤和储存过程中，小凝胶珠容易被大凝胶珠吸附，从而形成凝聚物。一般情况下，目前琼脂糖凝胶微球制备结束后，都需要对凝胶进行筛分才能用作分离介质，这不但会造成原材料地浪费，也会导致生产成本的提高，如果能够制备出粒径均一的凝胶微球，将大大简化操作程序，节省原材料，降低生产成本。即使传统乳化方法制备的琼脂糖凝胶微球进行了筛分，其粒径的均一性依然不高，这将为实际应用带来许多困难。由于粒径不均一，在分离过程中小的凝胶珠会在柱子中聚集到大凝胶珠之间的空隙中，使得分离压力增大，严重时会导致分离无法进行。因此有必要研究新型制备方法，制备出粒径均一琼脂糖凝胶微球，以便克服传统制备方法的不足以及由此带来的应用上的缺陷。
发明内容
本发明提供尺寸均一、可控、高亲水性和高度多孔性的琼脂糖凝胶分离介质，以用于生物活性物质的分离纯化等。其特征是(1)将一定量的琼脂糖在加热条件下溶于一定量的水中配制一定浓度的琼脂糖水溶液，将该水相用压力通过微孔膜压入油相中，得到尺寸均一的乳滴；(2)将此乳液转入到冷却装置中采用程序降温和缓慢机械搅拌的条件下冷却至15℃以下使乳滴胶凝固化得尺寸均一的琼脂糖凝胶微球。在优化条件下，琼脂糖凝胶微球的直径分布系数控制在11％以内，直径可在1-100微米内自由控制。
该技术解决了传统搅拌乳化法制备的琼脂糖凝胶微球粒径不均一、分离时压力变化大导致的分离效果差的问题。本发明利用粒径的均一性特性，达到装柱均匀，从而使分离时压力稳定均匀、提高流速、提高分离效率。
本发明提供的尺寸均一的琼脂糖凝胶微球及其制备方法还能够带来下列效应：
(1)本发明提供的琼脂糖凝胶微球除了作为生化分离介质外，还可用于作为活细胞、基因等载体，为细胞增殖和发挥体内的治疗效果提供有利的微观环境，有效避免体内淋巴细胞的识别和免疫排斥作用。
(2)本发明提供的琼脂糖凝胶微球，由于粒径均一并且可控，使用此凝胶微球可以有效开展粒径与不同蛋白质、核酸等大分子物质及其分离效果之间的关系研究，从而找出不同分离物质所需要的最适合的粒径的凝胶微球，如果凝胶微球的尺寸不均一，则无法开展这方面的研究。
(3)采用本发明的制备方法，能够很容易的制备出传统乳化法很难制备的小粒径的凝胶微球，从而实现难分离的生物活性物质的分离。
(4)结合本发明的方法和以往的磁性颗粒等无机物的包埋技术，可以制备磁性的分离介质、高比重分离介质。结合本发明的方法和以往的琼脂糖修饰方法，能够制备各种分离用琼脂糖微球。
(5)本发明提供的制备方法，条件温和，作为活细胞等活性物质载体可望保持其生物活性和生物稳定性。
(6)本发明提供的凝胶微球粒径均一，无需进行筛分，大大简化操作程序，节省原料，从而将大大降低生产成本及后续的分离纯化成本。
附图说明
图1琼脂糖凝胶微球的制备流程。
图2实施例1制备的琼脂糖乳液中乳滴的光学显微照片。
图3实施例1制备的琼脂糖凝胶微球的光学显微照片。
图4比较例1制备的琼脂糖乳液中乳滴的光学显微照片。
图5比较例1制备的琼脂糖凝胶微球的光学显微照片。
图6实施例2采用不同膜孔径制备的琼脂糖乳液中乳滴的光学显微照片。
图7实施例2制备的不同膜孔径的琼脂糖乳液中乳滴粒径与膜孔径之间关系图。
图8实施例2采用不同膜孔径制备的琼脂糖凝胶微球的光学显微照片。
图9实施例2制备的不同膜孔径的琼脂糖凝胶微球粒径与膜孔径之间关系图。
图10实施例3制备的不同琼脂糖浓度的乳液中乳滴的光学显微照片。
图11实施例3制备的不同浓度的琼脂糖乳液中乳滴粒径与琼脂糖浓度之间关系图。
图12实施例3制备的不同琼脂糖浓度的凝胶微球的光学显微照片。
图13实施例3制备的不同琼脂糖浓度凝胶微球粒径与浓度之间的关系图。
具体实施方案
本发明包括尺寸均一的琼脂糖凝胶微球及其制备方法。琼脂糖凝胶微球的制备按图1所示的步骤制备，具体方法和步骤说明如下：
1)W/O型乳液的制备
将一定量的琼脂糖、NaCl以及其它添加剂加入到一定量的水中，并在加热条件下充分溶解作为水相；将一种以上的油溶性乳化剂溶于油性液体，并加热到一定的温度作为油相。将水相通过疏水性多孔膜压入油相，得到尺寸均一的W/O型乳液。
琼脂糖的浓度可根据需要进行配制，不同浓度的琼脂糖溶液膜乳化时所需要的温度也不相同，可根据需要进行合理选择；水相添加剂可包括白蛋白、卵磷脂、葡萄糖、甘露醇等对人体无害的水溶性物质。油相为常温下呈液态，与水不互溶的油性物质，可使用液体石蜡和石油醚、橄榄油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷类碳氢化合物等，一般所选择的油相沸点要比较高，挥发性弱较好。油性乳化剂必须溶解于所使用的油性物质，可使用失水山梨醇倍半油酸酯(Arlaeel83)、甘油醚的聚合物(如PO-500、PO-310)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯(司班85)、失水山梨醇单油酸酯(司班80)、失水山梨醇三硬脂酸酯(司班65)、亲油-亲水嵌段共聚物等。油相中乳化剂的浓度为0.5-10wt％。
水相与油相的体积比为1∶1-1∶1000。
2)琼脂糖凝胶微球的制备
将上述步骤1)所得到的乳液转入到降温装置中，在缓慢的机械搅拌下缓慢降温至15℃以下胶凝固化，并进行洗涤，将所得凝胶微球保存于蒸馏水中。
胶凝固化时降温速度要缓慢，降温幅度为低于2℃/min，降温时采用机械搅拌桨进行缓慢搅拌，转数为50-200rpm。
胶凝固化结束后，将所得凝胶依次用石油醚、丙酮、乙醇、蒸馏水洗涤，并将所得凝胶常温下保存于蒸馏水中。
实施例1
将孔径为5.7μm的疏水性膜置于亲油性的物质中浸润，使孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。准确称取一定量的琼脂糖和一定量的NaCl加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为4％，NaCl的浓度为0.9％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持一定的温度备用。将油溶性乳化剂加入到200ml的液体石蜡中，搅拌至完全溶解并加热至50℃作为油相。趁热迅速将6.0g左右的水相转入到已在油相中预热至50℃的膜乳化装置中，在恒定压力下，通过孔径均一的疏水性微孔膜压入油相中，得到W/O型乳液；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，在搅拌桨的缓慢搅拌下在空气中缓慢降温，降至室温时，用冷水浴进一步降温，然后向水浴中加入少量冰将乳液降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴胶凝固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚、丙酮、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。乳液中乳滴及凝胶微球的平均粒径采用带有标尺的显微镜进行测量，测200个取平均值，其中乳液中乳滴的平均直径为20.55μm，CV值为19.25％，在水中凝胶微球的平均直径为23.04μm，CV值为18.46％。乳滴和凝胶微球的光学显微镜照片分别如图2和图3所示，粒径较为均一。
比较例1(机械搅拌法)
采用与实例1相同的配方，准确称取一定量的琼脂糖和一定量的NaCl加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为4％，NaCl的浓度为0.9％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持一定的温度备用。将油溶性乳化剂加入到200ml的液体石蜡中，搅拌至完全溶解并加热至50℃作为油相。趁热迅速将6.0g左右的水相转入到已在油相中，磁力搅拌1000rpm，30min，得到W/O型乳液；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，在搅拌桨的缓慢搅拌下在空气中缓慢降温，降至室温时，用冷水浴进一步降温，然后向水浴中加入少量冰将乳液降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚、丙酮、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。乳液中乳滴及凝胶微球的平均粒径采用带有标尺的显微镜进行测量，测200个取平均值，其中乳液中乳滴的平均直径为18.47μm，CV值为39.37％，水中的凝胶微球的平均直径为28.08μm，CV值为31.16％。乳滴和凝胶微球的光学显微镜照片分别如图4和图5所示，粒径很不均一。
实施例2
将孔径分别为4.7μm、5.7μm、13μm、19.6μm的疏水性膜置于亲油性的物质中浸润，使孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。准确称取一定量的琼脂糖和一定量的NaCl加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为4％，NaCl的浓度为0.9％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持一定的温度备用。将油溶性乳化剂加入到200ml的液体石蜡中，搅拌至完全溶解并加热至50℃作为油相。趁热迅速将6.0g左右的水相转入到已在油相中预热至50℃的膜乳化装置中，分别在恒定压力下，通过孔径均一的疏水性微孔膜压入油相中，得到W/O型乳液；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，在搅拌桨的缓慢搅拌下在空气中缓慢降温，降至室温时，用冷水浴进一步降温，然后向水浴中加入少量冰将乳液降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴同化。最后将所得凝胶过滤，依次用石油醚、丙酮、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。乳滴及凝胶微球的平均粒径采用带有标尺的显微镜进行测量，测200个取平均值，其中乳液中乳滴的平均直径分别为16.03μm、20.55μm、42.76μm、61.88μm，水中凝胶微球的平均直径分别为17.90μm、23.04μm、50.70μm、62.37μm。乳滴和凝胶微球的光学显微镜照片分别如图6和图8所示，乳滴粒径与膜孔径之间的关系如图7所示，凝胶微球粒径与膜孔径之间的关系如图9所示，由图上可以看出乳滴粒径和凝胶微球粒径与膜的孔径成线性关系，乳滴和凝胶微球的粒径大约是膜孔径的3倍。
实施例3
将孔径为4.7μm的疏水性膜置于亲油性的物质中浸润，使孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。准确称取一定量的琼脂糖和一定量的NaCl加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度分别为2％、4％、6％和8％，NaCl的浓度为0.9％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持一定的温度备用。将油溶性乳化剂加入到200ml的液体石蜡中，搅拌至完全溶解并加热至一定温度作为油相。趁热迅速将6.0g左右的水相转入到已在油相中预热至所需温度的膜乳化装置中，分别在恒定压力下，通过孔径均一的疏水性微孔膜压入油相中，得到W/O型乳液；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，在搅拌桨的缓慢搅拌下在空气中缓慢降温，降至室温时，用冷水浴进一步降温，然后向水浴中加入少量冰将乳液降温至15℃以下，使琼脂糖凝胶胶凝固化。最后将所得凝胶过滤，依次用石油醚、丙酮、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。乳滴及凝胶微球的平均粒径采用带有标尺的显微镜进行测量，测200个取平均值，乳滴的平均粒径分别为17.45μm、16.03μm、16.47μm和16.79μm，CV值分别为12.29％、19.18％、14.96％和19.29％，凝胶微球的平均粒径分别为18.27μm、17.90μm、16.28μm和17.04μm，CV值分别为17.67％、12.59％、13.75％和16.25％。乳滴和凝胶微球的光学显微镜照片分别如图10和图12所示，不同浓度的琼脂糖乳滴和凝胶微球粒径与浓度之间的关系如图11和13所示。乳滴和凝胶微球直径基本不受琼脂糖浓度的影响。
                                        参考文献
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