托法替布中间体杂质、托法替布杂质及其合成方法,以及托法替布的质量监控方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种托法替布中间体杂质、托法替布杂质及其合成方法以及托法替布的质量监控方法。
背景技术
2012年11月6日，由美国辉瑞公司开发的托法替布(tofacitinib)柠檬酸盐(商品名:Xeljanz)被美国食品药品管理局批准上市，该药用于对氨甲喋呤治疗应答不充分或不耐受的中至重度活动性类风湿关节炎的成人患者，是一种新型口服JAK抑制剂。
目前，大部分“托法替布”的合成方法中，托法替布由N-甲基-N-((3R,4R)-4-甲基哌啶-3-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-胺为起始物料与氰基乙酸反应而得。例如中国专利CN1195755、CN101233138A和CN1729192A中所提出的合成方法均采用这种合成路线。因此N-甲基-N-((3R,4R)-4-甲基哌啶-3-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-胺化合物的纯度直接影响托法替布的纯度。
“N-甲基-N-((3R,4R)-4-甲基哌啶-3-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-胺(化合物A)”一般是通过氢化反应合成。例如中国专利CN1729192A、CN1195755C和CN101233138A中均公开了氢化脱苄基的方法。又例如在中国专利CN101233138A中公开了在氢化脱苄基同时脱去嘧啶环上的氯原子。“N-甲基-N-((3R,4R)-4-甲基哌啶-3-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-胺(化合物A)”的几种合成路线如下：
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在上述氢化合成“N-甲基-N-((3R,4R)-4-甲基哌啶-3-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-胺(化合物A，以下简称托法替布)”的四种路线中，相对于化合物B和化合物D来说，含氯化合物C的制备简便，收率较高(可达95％-100％)，一般会是申报厂家的首选路线。
如何更好地监控含氯化合物C的质量，以及进一步监控优化所制备的托法替布的质量已经成为研究人员的一个新的研发课题。
发明内容
本发明的目的是为了监控优化N-甲基-N-((3R,4R)-4-甲基哌啶-3-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-胺(托法替布)的质量，提供了一种托法替布中间体杂质、托法替布杂质及其合成方法以及托法替布的质量监控方法。
为了优化N-甲基-N-((3R,4R)-4-甲基哌啶-3-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-胺(托法替布)的质量，本申请发明人对托法替布的合成过程进行了大量的研究，特别是对背景技术部分所提出的以含氯化合物C为原料氢化合成“N-甲基-N-((3R,4R)-4-甲基哌啶-3-基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-胺(化合物A)”的合成路线进行了大量的研究，一次偶然的机会，本申请发明人发现在以含氯化合物C(下称托法替布中间体)为原料合成托法替布的过程中，嘧啶环上的氯原子不易氢化脱去，容易形成杂质。而含有这种杂质的含氯化合物C与氰基乙酸衍生物反应得到托法替布的同时，也会生成相应的杂质。如果能够对这些中间杂质进行研究，作为托法替布产物的对照品将有利于监控并提高托法替布的质量。
为此，在本发明的一个方面，提供了一种托法替布中间体杂质(N-((3R,4R)4-甲基哌啶-3-基)-N-甲基-(2-氯-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶)-4-胺)，该托法替布中间体杂质具有式(Ⅰ)中化学式。
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在本发明的第二个方面,提供了一种上述托法替布中间体杂质的合成方法，该合成方法包括以下步骤：在氢化反应条件下，在第一有机溶剂和第一催化剂存在下，将所述托法替布中间体与第一酸溶液接触，氢化反应形成所述中间体杂质，其中，所述托法替布中间体的化学结构式如下：
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优选地，上述氢化反应条件包括：在氢气气氛下，压力为0.1-0.5MPa；温度为60-90℃条件下，反应5-10h，优选70-75℃条件下，反应6-8h。
优选地，上述第一酸溶液与所述托法替布中间体的摩尔比为1:1-2:1，优选为1.3-1.4:1；所述第一酸溶液为无机酸和/或有机酸，优选所述有机酸为冰醋酸、甲酸和三氟乙酸中的一种或多种，优选所述无机酸为盐酸和/或硫酸。
优选地，以每克托法替布中间体为准，所述第一有机溶剂的用量为5-10ml，优选所述第一有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、乙二醇、丙酮、丙醇和异丙醇中的一种或多种。
优选地，上述第一催化剂与所述托法替布中间体的摩尔比为1-8:100，优选为3-5:100，优选所述第一催化剂为氢氧化钯碳，钯碳，铂碳中的一种或多种。
在本发明的第三个方面还提供了一种托法替布杂质(3-(3R,4R)-4-甲基-3-(甲基(2-氯-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-基)-3-氧代丙腈)，该托法替布杂质具有式(Ⅱ)中化学结构。
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在本发明的第四个方面还提供了一种上述托法替布杂质的合成方法，该合成方法包括以下步骤：在第二有机溶剂和第二催化剂的存在下，将本发明上述托法替布中间体杂质式(I)与含氰基有机化合物发生亲核取代反应得到混合体系；在所述混合体系中加酸萃取，再加碱调节pH、室温搅拌，过滤得到托法替布杂质式(II)化合物。
优选地，上述合成方法中亲核取代反应的条件为：反应温度为25-40℃，反应时间为8-12h；优选地在亲核取代反应后，降温至室温，加入酸萃取，再加弱碱盐调pH值至中性，室温下搅拌6-20h，过滤得所述托法替布杂质。优选地，加酸萃取的步骤中加入1mol/L的盐酸萃取1-5次，加弱碱盐调pH值至中性的步骤中所述弱碱盐为碱式碳酸盐，优选为NaHCO3和/或KHCO3。
优选地，上述含氰基有机化合物与所述托法替布中间体杂质的摩尔比为2:1-6:1，优选为4:1。，更优选所述含氰基有机化合物为氰基乙酸乙酯、氰基乙酸和氰基乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯中的一种或多种
优选地，上述第二催化剂与所述托法替布中间体杂质式(I)的摩尔比为0.2:1-1.5:1，优选为0.8:1；优选所述第二催化剂为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、三乙胺、吡啶、草酰氯和三甲基乙酰氯中的一种或多种。
优选地，以每克托法替布中间体杂质式(I)为准，所述第二有机溶剂的用量5-10ml；
优选所述第二有机溶剂为正丁醇、甲醇、丙二醇、2-甲基四氢呋喃和N-甲基吡咯烷酮中的一种或多种；
在本发明的第五个部分还提供了一种托法替布的质量监控方法，该方法包括：以上述托法替布杂质的合成方法制备的杂质作为标准品，对所制备的托法替布的质量进行监控；优选还包括以上述托法替布中间体杂质的合成方法制备的杂质作为标准品，对所制备的托法替布中间体的质量进行监控。
根据本发明所提供的方法所制备的托法替布中间体杂质和托法替布杂质的纯度较高，可用以作为对照品对托法替布中间体和托法替布进行对照，对托法替布中间体和托法替布进行定性和定量分析。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明托法替布中间体杂质的质谱图；
图2示出了根据本发明托法替布中间体杂质的核磁共振氢谱图；
图3示出了根据本发明托法替布中间体杂质的核磁共振碳谱图；
图4示出了根据本发明托法替布中间体杂质的液相色谱图；
图5示出了根据本发明托法替布中间体杂质和托法替布中间体的液相色谱图；
图6示出了根据本发明托法替布杂质的质谱图；
图7示出了根据本发明托法替布杂质的核磁共振碳谱图；
图8示出了根据本发明托法替布杂质的核磁共振碳谱图；
图9示出了根据本发明托法替布杂质的液相色谱图；
图10示出了根据本发明托法替布杂质和枸橼酸托法替布的液相色谱图。
具体实施方式：
以下结合具体实施例1-7对本发明进行详细说明，本发明所提供的实施例仅是用以帮助理解本发明所提供的技术方案，而不能限定本发明的保护范围；本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
一、托法替布中间体杂质的合成
(1)实施例1至4
实施例1：
N-((3R,4R)4-甲基哌啶-3-基)-N-甲基-(2-氯-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶)-4-胺的合成方法如下：
在干燥的500ml的氢化反应釜中，依次加入含有21.7g(59mmol)托法替布中间体(前述化合物C)的110ml乙醇，1mol/L的盐酸83ml，4.2g(3mmol)氢氧化钯碳(20％)，先通过氮气置换掉反应釜中的空气(至少三次)，再用氢气置换掉反应釜中的氮气(至少三次)，在常压下，70-75℃反应，TLC监测反应，6h反应结束。热过滤除去催化剂，静置，有固体析出，过滤，所得固体进行柱层析(SiO2，CH2Cl2：CH3OH＝1:5)纯化，旋转蒸干溶剂得固体，置于真空干燥4h得目标产物。
实施例2：
N-((3R,4R)4-甲基哌啶-3-基)-N-甲基-(2-氯-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶)-4-胺的合成方法如下：
在干燥的500ml的氢化反应釜中，依次加入含有21.7g(59mmol)托法替布中间体(前 述化合物C)的130ml乙醇，1mol/L的盐酸78ml，2.5g(1.8mmol)氢氧化钯碳(20％)，先通过氮气置换掉反应釜中的空气(至少三次)，再用氢气置换掉反应釜中的氮气(至少三次)，在0.3MPa下，70-75℃反应，TLC监测反应，8h反应结束。热过滤除去催化剂，静置，有固体析出，过滤，所得固体进行柱层析(SiO2，CH2Cl2：CH3OH＝1:5)纯化，旋转蒸干溶剂得固体，置于真空干燥4h得目标产物。
实施例3：
N-((3R,4R)4-甲基哌啶-3-基)-N-甲基-(2-氯-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶)-4-胺的合成方法如下：
在干燥的500ml的氢化反应釜中，依次加入含有21.7g(59mmol)托法替布中间体(前述化合物C)的175ml乙醇，1mol/L的三氟乙酸60ml，1.27g(0.6mmol)钯碳(10％)，先通过氮气置换掉反应釜中的空气(至少三次)，再用氢气置换掉反应釜中的氮气(至少三次)，在0.5MPa下，60-65℃反应，TLC监测反应，10h反应结束。热过滤除去催化剂，静置，有固体析出，过滤，所得固体进行柱层析(SiO2，CH2Cl2：CH3OH＝1:5)纯化，旋转蒸干溶剂得固体，置于真空干燥4h得目标产物。
实施例4：N-((3R,4R)4-甲基哌啶-3-基)-N-甲基-(2-氯-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶)-4-胺的合成方法：
在干燥的500ml的氢化反应釜中，依次加入含有21.7g(59mmol)托法替布中间体(前述化合物C)的220ml乙醇，1mol/L的硫酸118ml，10.2g(4.8mmol)钯碳(10％)，先通过氮气置换掉反应釜中的空气(至少三次)，再用氢气置换掉反应釜中的氮气(至少三次)，在常压下，85-90℃反应，TLC监测反应，5h反应结束。热过滤除去催化剂，静置，有固体析出，过滤，所得固体进行柱层析(SiO2，CH2Cl2：CH3OH＝1:5)纯化，旋转蒸干溶剂得固体，置于真空干燥4h得目标产物。
(2)实施例1中所合成托法替布中间体杂质的检测
1)质谱检测：
如图1所示，实施例1所合成的托法替布中间体杂质的ESI-MS：m/z 280.3。
2)氢谱检测：
如图2所示，实施例1所合成的托法替布中间体杂质的HNMR(400HMZ，DMSO)δ(ppm)：11.95(s，1H，NH)，9.64,9.62(s，1H，NH)，7.20-7.22(d，1H，CH)，6.63(d， 1H，CH)，5.03(d，1H，CH)，3.59,3.57(m，1H，CH2)，3.31,3.29(m，1H，CH2)，3.21(s,3H,CH3),3.11-3.17(m,1H,CH2)，2.98(m,1H,CH2)，2.51(m,1H,CH2)，2.43(m,1H,CH2)，1.68,1.65(d,1H,CH2)，1.07(s,3H,CH3)
如图3所示，实施例1所合成的托法替布中间体杂质的CNMR(400HMZ，DMSO)δ(ppm)：157.09,152.34,151.69,121.72,102.04,100.84,52.41,40.32,38.27,33.72,29.29,27.89, 12.06。
由上述检查结果可知，由实施例1所制备的产物为N-((3R,4R)4-甲基哌啶-3-基)-N-甲基-(2-氯-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶)-4-胺，即本发明所欲获得的托法替布中间体杂质。实施例2-4的相应数据与实施例1相仿，在此不再重复提供，由此可见实施例1-4均为本发明所欲获得的托法替布中间体杂质。
(3)纯度测定
测量方法：将由实施例1-4制得的固体样品进行HPLC分析，通过找出托法替布中间体杂质所对应的峰，并根据峰面积计算其纯度。
测量结果：如表1所示。
表1
实施例编号 托法替布中间体杂质纯度(重量％)
实施例1 99.7
实施例2 99.8
实施例3 99.3
实施例4 99.2
从表1可以看出，采用本发明的方法合成的托法替布中间体杂质具有99.2％以上的纯度，完全符合标准品的纯度要求，而可以作为标准品使用。
(4)实施例1至4作为标准品的应用
液相色谱检测
检测方法：采用反相液相色谱柱(C18、C8、苯基等键合硅胶为填料的分析柱)，检测器为紫外检测器，以乙腈和三氟乙酸缓冲溶液为流动相，按照等度和梯度洗脱程序进行检测。
测试条件：使用色谱柱：Luna5u C18，粒径为5um；柱温：30℃，流速：1.0ml/min，流动相：A 0.01％三氟乙酸水，B 0.01％三氟乙酸乙腈溶液
流动相按下表梯度洗脱程序：
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测试结果：如图4和图5所示。图4示出了根据本发明托法替布中间体杂质的液相色谱图；图5示出了根据本发明托法替布中间体杂质和托法替布中间体的液相色谱图。
由图5可以看出，通过液相色谱检测法可以同时检测出托法替布中间体杂质和托法替布中间体，且两者具有很好的分离度。通过液相色谱检测法可以检测在托法替布中间体制备过程中托法替布中间体杂质的含量，以及其他杂质的含量，进而有利于对托法替布中间体和托法替布进行定性和定量分析，以更好地提高对托法替布中间体的质量。
二、托法替布杂质的合成
(1)实施例5-7
实施例5：(3-(3R,4R)-4-甲基-3-(甲基(2-氯-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-基)-3-氧代丙腈)(托法替布杂质)的合成步骤如下：
向100ml圆底烧瓶中加入30ml正丁醇，打开搅拌，依次加入10g(40.8mmol)实施例1所制备的托法替布中间体杂质，18.4g(163.2mmol)氰基乙酸乙酯和5.1g(32.6mmol)DBU，加热至40℃反应8h。将反应液冷却至室温，加入1mol/L的盐酸水溶液萃取两次，合并水层，再加入NaHCO3调pH值为中性，室温下搅拌过夜，过滤，水洗涤滤饼，将固体用乙腈：水＝3:1溶液在室温下浆洗2h，过滤，所得固体置于50℃真空干燥箱中干燥约7-8h，得到约9g托法替布杂质。
实施例6：
(3-(3R,4R)-4-甲基-3-(甲基(2-氯-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-基)-3-氧代丙腈)(托法替布杂质)的合成步骤如下：
向100ml圆底烧瓶中加入30ml正丁醇，打开搅拌，依次加入10g(40.8mmol)实施例1所制备的托法替布中间体杂质，9.2g(81.6mmol)氰基乙酸乙酯和3.2g(20.4mmol)DBU，室温下反应12h。将反应液冷却至室温，加入1mol/L的盐酸水溶液萃取两次，合并水层，再加入NaHCO3调pH值为中性，室温下搅拌过夜，过滤，水洗涤滤饼，将固体用乙腈：水＝3:1溶液在室温下浆洗2h，过滤，所得固体置于50℃真空干燥箱中干燥约7-8h，得到约9g托法替布杂质。
实施例7：
(3-(3R,4R)-4-甲基-3-(甲基(2-氯-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-基)-3-氧代丙腈)(托法替布杂质)的合成步骤如下：
向100ml圆底烧瓶中加入30ml正丁醇，打开搅拌，依次加入10g(40.8mmol)实施例所制备的托法替布中间体杂质，27.6g(244.8mmol)氰基乙酸乙酯和9.6g(61.2mmol)DBU，加热至30℃反应10h。将反应液冷却至室温，加入1mol/L的盐酸水溶液萃取两次，合并水层，再加入NaHCO3调pH值为中性，室温下搅拌过夜，过滤，水洗涤滤饼，将固体用乙腈：水＝3:1溶液在室温下浆洗2h，过滤，所得固体置于50℃真空干燥箱中干燥约7-8h，得到约9g托法替布杂质。
(2)托法替布体杂质的检测
1)质谱检测：
如图6所示，实施例5中所合成的托法替布的ESI-MS：m/z 345。
2)氢谱检测：
如图7所示，实施例5中所合成的托法替布杂质的HNMR(400HMZ，DMSO)δ(ppm)：11.86,11.84(s，1H，NH)，7.17(s，1H，CH)，6.59(s，1H，CH)，4.71(s，1H，CH)，4.0-4.17(m，2H，CH2)，3.66-3.90(m，3H，CH2，CH2)，3.34-3.43(m，3H，CH3)，2.73,2.89(d， 1H，CH2)，2.37(m,3H,CH),1.58-1.82(t,1H,CH2)，0.99(d,3H,CH3)。
如图8所示，实施例5中所合成的托法替布CNMR(400HMZ，DMSO)δ(ppm)：161.65,157.63,152.38，151.73,121.37,116.18,102.25,100.82,53.23,41.64,34.08,31.03,29.87,24.94,13.76。
由上述检查结果可知，由实施例5所合成产物为本发明所欲保护的托法替布杂质。实施例6-7的相应数据与实施例5相符，在此不再重复提供，实施例6-7所合成产物为本发明所欲保护的托法替布杂质。
(3)纯度测定
测量方法：将由实施例5-7制得的固体样品进行HPLC分析，通过找出托法替布杂质所对应的峰，并根据峰面积计算其纯度。
测量结果：如表2所示。
表2
实施例编号 托法替布杂质纯度(重量％)
实施例5 96.7
实施例6 96.8
实施例7 96.7
从表2可以看出，采用本发明的方法合成的托法替布杂质具有96.7％以上的纯度，完全符合标准品的纯度要求，而可以作为标准品使用。
(4)实施例5-7所合成的托法替布杂质的应用(以实施例5合成的托法替布杂质为例说明)
液相色谱检测
检测方法：采用反相液相色谱柱(C18、C8、苯基等键合硅胶为填料的分析柱)，检测器为紫外检测器，以乙腈和三氟乙酸缓冲溶液为流动相，按照等度和梯度洗脱程序进行检测。
测试条件：使用色谱柱：Luna5u C18，粒径为5um；柱温：30℃，流速：1.0ml/min，流动相：A 0.01％三氟乙酸水，B 0.01％三氟乙酸乙腈溶液流动相按下表梯度洗脱程序：
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测试结果：如图9和图10所示。
测试结果：如图9和图10所示。图9示出了根据本发明托法替布杂质的液相色谱图；图10示出了根据本发明托法替布杂质和托法替布液相色谱图。
由图10可以看出，通过液相色谱检测法可以同时检测出托法替布杂质和托法替布，且两者具有很好的分离度。可以将本发明所制备的托法替布杂质做为标准品，通过液相色谱检测法可以检测在托法替布制备过程中托法替布杂质的含量，以及其他杂质的含量，进而有利于对托法替布中间体和托法替布进行定性和定量分析，以更好地提高对托法替布的质量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。