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本发明涉及嗜热链球菌的菌株或其细胞组分，用于治疗或预防幽门螺杆菌感染。

1.  嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株，用于治疗或预防幽门螺杆菌感染。

2.  根据权利要求1所述的嗜热链球菌菌株，其特征在于所述菌株能够降低感染幽门螺杆菌(H.pylori)的受试者胃中幽门螺杆菌菌株的载量。

3.  根据权利要求1或2所述的嗜热链球菌菌株，其特征在于所述菌株为CNCM I-1520菌株。

4.  从权利要求1～3的任一项所述的嗜热链球菌菌株获得的细胞组分，其中，所述细胞组分能够降低感染幽门螺杆菌的患者胃中幽门螺杆菌菌株的载量，所述细胞组分用于治疗或预防幽门螺杆菌感染。

5.  组合物，其包含权利要求1～3的任一项所述的嗜热链球菌菌株或如权利要求4所定义的细胞组分，用于治疗或预防幽门螺杆菌感染。

6.  根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述组合物包含每克干重至少10⁵cfu、优选至少10⁶cfu的权利要求1～3的任一项所述的嗜热链球菌菌株。

7.  根据权利要求5或6所述的组合物，其特征在于所述组合物为营养组合物。

8.  根据权利要求7所述的组合物，其特征在于所述组合物为乳产品。

用于治疗幽门螺杆菌感染的嗜热链球菌菌株
本发明涉及益生菌领域。具体地，本发明涉及嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株用于治疗或预防幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染的用途。
根据美国国家酸奶协会(NYA)或国际生命科学学会(ILSI)最近批准的定义，益生菌是在足量摄入时发挥超出基本营养之外的健康益处的活微生物。在属于乳品工业常用菌属的乳杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、链球菌(Streptococcus)和乳球菌(Lactococcus)的菌种中已描述了益生菌。益生菌被认为通过阻止病原微生物的发展和/或通过更直接地作用于免疫系统而在肠道菌群的水平进行干预。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是革兰氏阴性的螺旋状细菌，寄居在超过世界人口50％的人的胃粘液层中。虽然他们的胃上皮组织出现炎症症状，但是大多数感染幽门螺杆菌的个体无症状，15％至20％的感染幽门螺杆菌的个体发展成疾病。实际上，幽门螺杆菌是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、萎缩、化生、发育异常、胃癌以及胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的主要的致病物质(参见综述Fox and Wang,2007和Polk and Peek,2010)。
在感染期间，幽门螺杆菌通过该细菌产生的多个粘附分子(粘附素)，例如BabA和SabA蛋白，特异地结合到胃上皮组织内衬的胃上皮细胞。粘附到胃上皮细胞使细菌免受液体流动、蠕动和粘液层的脱落。幽门螺杆菌粘附到胃粘膜诱导胃上皮细胞内的信号传导途径，通过氧化应激、细胞凋亡和/或自体吞噬机制造成胃上皮细胞受损以及萎缩。因此，幽门螺杆菌粘附到胃上皮细胞是建立胃粘膜感染的关键步骤。
对幽门螺杆菌感染患者的标准治疗是两种抗生素联合质子泵抑制剂(PPI)，所谓的三联疗法。然而，因为抗生素耐药性或较差的顺应性，三联疗法后幽门螺杆菌的根除率正在下降。此外，尽管有数个临床试验，目前尚无有效的疫苗上市。
由上述内容可见，需要三联疗法的替代疗法或补充疗法来用于治疗或预 防幽门螺杆菌感染。
已经提出使用益生菌作为三联疗法的替代或补充用于治疗或预防幽门螺杆菌感染。例如，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)被认为是用于抑制幽门螺杆菌生长的候选益生菌，原因是它产生有效的抗菌物质罗伊氏素(3-羟基丙醛)(国际申请WO 2004/031368)。Boyanova等(2009)已经发现几种抑制幽门螺杆菌菌株体外生长的德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株。Simova等(2009)发现了产生抑制肽(细菌素)并且强烈抑制幽门螺杆菌的德氏乳杆菌菌株(BB18)。Linsalata等(2004)发现短乳杆菌菌株CD2能够减小胃内的幽门螺杆菌载量，并提出这可能是由于该菌株提高的精氨酸脱氨基酶活性使幽门螺杆菌失去精氨酸并抑制它们的生长和增殖。
本发明人已经发现了菌种嗜热链球菌能够减小幽门螺杆菌菌株的体内载量。
因此，本发明涉及嗜热链球菌菌株，用于治疗或预防幽门螺杆菌感染。
所述嗜热链球菌可用作药物，包括药物组合物以及功能食品。
所述嗜热链球菌菌株能够降低感染幽门螺杆菌的个体的胃中幽门螺杆菌菌株的载量。
在优选的实施方式中，所述嗜热链球菌菌株为菌株CNCM I-1520。该菌株由申请人根据布达佩斯协定于1994年12月30日在CNCM(国家培养物和微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes),25rue du Docteur Roux，巴黎)保藏。该菌株在国际申请WO 96/20607中公开。该菌株还称为DN-001147。
本发明还涵盖了亲本菌株CNCM I-1520衍生的突变菌株或遗传转化的菌株，前体条件是它们能够减小感染幽门螺杆菌的个体的胃中幽门螺杆菌菌株的载量。在下面的实施例中描述了评估嗜热链球菌菌株减小感染幽门螺杆菌的个体胃中幽门螺杆菌菌株的载量的能力的方法。这些突变或遗传转化的菌株可为其中亲本菌株CNCM I-1520的一个或多个内源基因已经被突变的菌株，例如改变了它们的一些代谢性质(例如，它们发酵糖的能力，它们的耐酸性、它们在胃肠道转运中的存活、它们的后酸化性质或它们的代谢产物)。它们还可以为通过一个或多个目标的基因遗传转化由亲本菌株CNCM I-1520产生的菌株，例如为了赋予所述遗传转化的菌株额外的生理特征，或者为了 让它们表达希望通过所述菌株给予的具有治疗或疫苗益处的蛋白。可通过用于链球菌属的随机诱变或定点诱变的常规技术，例如Biswas等在1993年描述的技术和Maguin等在1996年描述的技术，或通过称为“基因组重排”的技术，例如Yu等在2008描述的技术，由亲本菌株CNCM I-1520获得这些突变或遗传转化的菌株。
本发明还涉及细胞组分(cell fraction)，其可以由能够减小感染幽门螺杆菌的受试者胃中的幽门螺杆菌菌株载量的嗜热链球菌菌株获得，优选由菌株CNCM I-1520获得，用于治疗或预防幽门螺杆菌感染，前提是所述细胞组分能够降低感染幽门螺杆菌的受试者胃中的幽门螺杆菌菌株载量。所述细胞组分特别是由所述菌株的培养物获得的DNA制剂制备物或细菌细胞壁制备物。它们还可以是这些菌株的培养物上清或部分。例如，可通过检测它们对感染幽门螺杆菌的患者的胃中幽门螺杆菌菌株的载量的性能，选择适合该用途的所述细胞组分。
本发明还涉及组合物，所述组合物包含本发明的嗜热链球菌菌株，优选菌株CNCM I-1520，或本发明的细胞组分，用于治疗或预防幽门螺杆菌感染。
在本发明的组合物中，所述菌株可以以全菌形式使用，所述全菌可以是活的或死的。可选地，所述菌株可以以细菌裂解物的形式使用。优选细菌细胞以活的、有生命力的细胞存在。
本发明的组合物可以是任何适合施用特别是经口施用的形式。这包括例如固体、半固体、液体和粉末。液体组合物由于更易施用，例如作为饮料，而是通常优选的。
所述组合物可以包含每克如上所述的至少一种细菌菌株干重至少10⁵cfu、优选至少10⁶cfu。
所述组合物还可以包含其它嗜热链球菌菌株和/或除本发明菌株以外的其它细菌菌株，特别是益生菌菌株，如乳杆菌属、双歧杆菌属和乳球菌属菌株。
在优选的实施方式中，所述组合物包含嗜热链球菌菌株CNCM I-1520，嗜热链球菌菌株CNCM I-1521(也称为DN-001339)和保加利亚乳杆菌菌株CNCM I-1519(也称为DN-100182)，以及任选的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌株，优选副干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei)CMCM I-1518(也称为DN-114001)。在国际申请WO 96/20607中描述了全部这些菌株。
当细菌是活细菌形式时，所述组合物通常可包含每克组合物干重10⁵至10¹³个菌落形成单位(cfu)，优选至少10⁶cfu，更优选至少10⁷cfu，更优选至少10⁸cfu，以及最优选至少10⁹cfu。在液体组合物的情况下，这通常对应于10⁴至10¹²个菌落形成单位(cfu)，优选至少10⁵cfu，更优选至少10⁶cfu，更优选至少10⁷cfu，以及最优选至少10⁹cfu/ml。
所述组合物可为药物组合物或营养组合物，包括食品、食品补充剂和功能性食品。更具体地，所述组合物可为药物，包括药物组合物和功能性食品。
“食品补充剂”是指由一般在食品中使用的化合物制成的产品，但其是以片剂、粉剂、胶囊剂、饮剂(potion)的形式或一般与滋养物不相关的任何其它形式，且其对人们的健康是有益处的。“功能性食品”也是对人们的健康也有益处的滋养物(aliment)。具体地说，食品补充剂和功能性食品能够对疾病例如慢性疾病具有保护性或治疗性的生理效应。
本发明的营养组合物也包括婴儿食品、婴儿配方奶或婴儿后续配方(infant follow-on formula)。优选地，本发明组合物是营养品或药物产品、营养补充剂或药用食品(medical food)。
所述组合物可以是乳产品，优选发酵乳产品。发酵产品可以以液体形式存在或者以通过干燥发酵的液体获得的干粉形式存在。乳产品(dairy product)的实例包括凝固、搅拌或可饮用形式的发酵奶(fermented milk)和/或发酵乳清、乳酪和酸乳酪。
所述发酵产品也可以是发酵的植物，如凝固、搅拌或可饮用形式的发酵的大豆、谷物和/或水果。
在优选的实施方案中，发酵的产品是新鲜产品。未经过剧烈的热处理步骤的新鲜产品具有的优点是细菌菌株以活体形式存在。
本发明还涉及以上限定的嗜热链球菌菌株，优选菌株CNCM I-1520，或上面限定的组合物，在制造用于治疗或预防幽门螺杆菌感染的药物中的用途。
本发明还涉及用于治疗或预防有需要的受试者中幽门螺杆菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如上文所定义的嗜热链球菌菌株，优选菌株CNCM I-1520，或如上面所定义的组合物。
治疗有效量的确定对于本领域技术人员是公知的，尤其是考虑到本文所提供的详细公开内容后。
本发明还涉及制造用于治疗或预防幽门螺杆菌感染的药物的方法，所述方法包括将上文所定义的嗜热链球菌菌株，优选菌株CNCM I-1520，或者上文所定义的细胞组分加入到至少一种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂中。
如本文所用，治疗或预防除其他物质外还包括预防感染和/或降低幽门螺杆菌的载量。治疗或预防还涵盖解决下文所述的与幽门螺杆菌相关的至少一种症状。
用于诊断幽门螺杆菌感染的方法是本领域中已知的。举例来说，可以通过血液抗体试验、粪便抗原试验或碳尿素呼气试验的检验来进行幽门螺杆菌感染的诊断。也可以通过内窥镜下活组织检查以及随后的尿素酶试验、组织学检查、微生物培养或定量实时PCR来进行幽门螺杆菌感染的诊断。
与幽门螺杆菌感染相关的症状或疾病是胃痛、腹痛、反胃、呕吐、嗳气、胃气胀、恶心、慢性活动性胃炎、消化性溃疡疾病、萎缩、化生、发育异常、胃癌和胃粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤。
根据下面的进一步描述，即示例嗜热链球菌菌株CNCM I-1520减小幽门螺杆菌菌株体内载量的性能的实施例以及随附的附图，可以更清楚地理解本发明。
图1显示了未感染的小鼠、接受对照产品的被幽门螺杆菌SS1感染的小鼠、或感染幽门螺杆菌SS1并用嗜热链球菌菌株CNCM I-1520治疗的小鼠在治疗前(第一柱)、治疗后3周(第二柱)及处死前(第三柱)测量的体重变化(以克计)，由2个独立的实验获得。
图2显示了在(i)未感染幽门螺杆菌的小鼠、(ii)接受对照产品(未发酵的奶)的被幽门螺杆菌SS1感染的小鼠和(iii)感染幽门螺杆菌SS1并用嗜热链球菌菌株CNCM I-1520治疗的小鼠中，使用抗幽门螺杆菌抗体通过免疫组织化学获得的感染的得分。得分的定义：0：无感染腺；1：极少感染腺，2：25％感染腺，3：25～50％感染腺，4：>50％感染腺。
图3显示了在(i)未感染幽门螺杆菌的小鼠、(ii)接受对照产品(未发酵的奶)的被幽门螺杆菌SS1感染的小鼠和(iii)感染幽门螺杆菌SS1并用 嗜热链球菌菌株CNCM I-1520治疗的小鼠，通过实时PCR获得的幽门螺杆菌SS1DNA的定量。
图4显示了未感染的小鼠、接受对照产品的被幽门螺杆菌SS1感染的小鼠、或感染幽门螺杆菌SS1并用嗜热链球菌菌株CNCM I-1520治疗的小鼠在治疗前(第一柱)、治疗后3周(第二柱)及处死前(第三柱)测量的体重变化(以克计)，由2个独立的实验获得。
图5显示了在(i)未感染幽门螺杆菌的小鼠、(ii)接受对照产品(未发酵的奶)的被幽门螺杆菌SS1感染的小鼠和(iii)感染幽门螺杆菌SS1并用嗜热链球菌菌株CNCM I-1520治疗的小鼠中通过在板上培养细菌获得的幽门螺杆菌SS1的定量(以每克小鼠胃的cfu计)。
实施例1：通过组织学和qRT-PCR方法测定的小鼠模型中嗜热链球菌菌株CNCM I-1520对幽门螺杆菌载量的影响
1.1材料和方法
幽门螺杆菌
使用对小鼠胃粘膜具有非常良好的定殖能力的幽门螺杆菌菌株SS1(Lee et al.,1997)。通过测序基因glm、hspA和vacA而核实了这些菌株(Raymond等，2004；Espinoza等，2011；Zhang等，2007)。
嗜热链球菌
如下制备由嗜热链球菌菌株CNCM I-1520发酵的奶产品：由冷冻的菌株在M17中制备第一培养物，并在37℃孵育17个小时。通过以1％接种第一培养物，并在37℃孵育17个小时，在富含酵母提取物(2g/L)的脱脂奶中制备第二培养物。通过以1％接种第二培养物，并在37℃孵育直到达到pH 4.7，而在富含酵母提取物(2g/L)的奶中制备第三培养物。最后通过以1％第三培养物接种富含酵母提取物(2g/L)的奶直到pH 4.8而制备产品。产品储存在-80℃。在孵育48个小时后于M17中进行细菌计数。细菌计数为1.5×10⁹cfu/mL。
小鼠
将40只5周龄且检测为SPF(《无特定病原体的》)的BALB/cBy/J雌性小鼠(Charles River，法国)分成以下组：使2组15只小鼠被感染，并且1组10只小鼠用作未感染的对照。用缺少维生素的食物饲喂小鼠，以增加幽门 螺杆菌诱导的损害发展。
感染(8周)
6周龄小鼠接受含水饮食(hydric diet)1天，然后在次日早晨强行饲喂250μL幽门螺杆菌SS1菌株的浓缩悬浮液(5只小鼠使用1至2培养皿的幽门螺杆菌)。将小鼠放在提供正常饮食的笼子中。然后，小鼠在晚上再次接受含水饮食。将该方案重复3天。
治疗(6周)
在小鼠感染后8周，将小鼠用含有嗜热链球菌CNCM I-1520的奶产品治疗6周。在饲喂瓶中给予每天每笼120g奶产品，而不是水。每天更换饲喂瓶。为了评估每只动物摄取的产品的量，对饲喂瓶进行称重。此外，在治疗之前、治疗后3周和处死前对小鼠进行称重(结果在图1中显示)。
小鼠对照组接受富含酵母菌提取物(2g/L)的奶(即，不含有任何嗜热链球菌菌株)。
处死
通过颈椎脱臼法处死小鼠。实施剖腹术。分离出胃，并在生理血清中清洗胃粘膜。
在从食道到十二指肠的中间切割胃。对于右半侧胃，清除贲门，然后将该半侧胃放入生理血清中以用于分子研究。将左半侧胃用于组织学。
组织学
将左半侧胃在3.7％福尔马林中固定1夜并用70％乙醇清洗，然后石蜡包埋和切片，厚度为3μm。
采用抗幽门螺杆菌抗原的抗体实施免疫组织化学：一抗：抗幽门螺杆菌抗体(Dako，Ref.B0471)；二抗和DAB：Dako EnVision+System-HRP(DAB)(Dako，Ref.K4011)。
分子研究：(q RT-PCR)
采用Potter-Elvehjem将右侧胃在0.2ml的生理血清中匀浆(分散)(在含胃组织和不含胃组织的情况下对管进行称重以获知组织的重量)。
采用Arrow Stool DNA试剂盒(NorDiag，挪威)按照供应商的推荐从破碎的胃提取总DNA。对于每个破碎的胃，将总DNA重悬浮在180μL的TRIS缓冲液(10mM)中。
通过实时PCR量化在DNA提取物中存在的幽门螺杆菌的DNA。遵循Oleastro等人(2003)描述的方法采用靶向在幽门螺杆菌中以两拷贝存在的23S rRNA基因的引物进行扩增。对于20μl的混合物(MgCl₂25mM，Ménard等人(2002)描述的引物HPY-A和HPY-S 20μM，5’标记有LC-Red 640和3’磷酸化的感应探针和3’标记有荧光素的锚定探针(这两种探针均是由Oleastro等人(2003)描述)，含有酶的缓冲液(10×，FastStart DNA Master杂交探针试剂盒(kit FastStart DNA Master Hybridization Probes)，Roche Diagnostics)，加入5μl的200ng/μl的DNA以在Light CyclerROCHE中使用以下程序进行扩增：
变性：95℃       10分钟
扩增:50个循环           20℃/秒
      95℃       0秒
      60℃       20秒
      72℃       12秒
融合：95℃       0秒
      38℃       50秒   20℃/秒
1.2结果
图2显示了通过免疫组织化学获得的感染的得分。这些结果显示了与用奶对照治疗获得的得分相比，向用幽门螺杆菌感染的小鼠施用用嗜热链球菌菌株CNCM I-1520发酵的奶产品(不显著地)降低了感染的得分。
表3显示了通过实时PCR获得的结果。这些结果显示在小鼠中，与用奶对照的治疗相比，用嗜热链球菌菌株CNCM I-1520发酵的奶产品的治疗显著降低了幽门螺杆菌的载量。
实施例2：通过微生物方法测定的嗜热链球菌菌株CNCM I-1520对小鼠模型中幽门螺杆菌载量的影响
2.1材料&方法
对于幽门螺杆菌菌株、嗜热链球菌菌株CNCM I-1520、小鼠、小鼠的感染、治疗和处死，用于该实施例的材料和方法与上述实施例1中的那些相同，除了下面的例外。
嗜热链球菌菌株CNCM I-1520的细菌计数为1.43x10⁹cfu/mL；
图4中显示了处理的小鼠的重量的变化；
只有小鼠的右半边胃用于微生物学研究。
微生物学研究：幽门螺杆菌的培养
采用Potter在0.2ml的生理血清中处理(brow)半侧胃(对具有含胃和不含胃的液体的试管进行称重以获得组织的精确重量)，在含有富集10％的血液的幽门螺杆菌培养基GSSA(Glaxo Selective Supplement A(20μg/ml的杆菌肽、1.07μg/ml的萘啶酸、0.33μg/ml的多粘菌素B和10μg/ml的万古霉素)的培养皿上涂布100μL的稀释物(10^-1至10^-4)。在37℃、微好氧条件下孵育5～7天后进行细菌计数。通过表型和生化反应(形态、脲酶和氧化酶分析)鉴别幽门螺杆菌。
2.2结果
图5中显示了从嗜热链球菌菌株CNCM I-1520的微生物学获得的结果。这些结果显示，与用奶对照相比，用菌株CNCM I-1520发酵的奶产品治疗小鼠显著降低了幽门螺杆菌的载量。
参考文献
Biswas I.et al.,J.Bacteriol.1993；175:3628-3635.
Boyanova L.et al.,Lett Appl Microbiol.2009；48:579-84.
Espinoza MGC.et al.,J.Clin.Microbiol.2011；49:1650-1652
Lee A.et al.,Gastroenterology.1997；112:1386-97.
Linsalata M.et al.,Helicobacter.2004；9:165-172.
Maguin E.et al.,J.Bacteriol.1996；178:931-935.
Ménard A.et al.,Antimicrob Agents Chemother.2002；46:1156-1157.
Oleastro M.et al.,J Clin Microbiol.2003；41:397-402.
Raymond J.et al.,Emerging Infection Deseases 2004；10:1815-1821.
Simonava et al.,J Appl Microbiol.2009；106:692-701.
Yu L.et al.,J.Biotechnol.2008；134:154-159.
Zhang et al.,World J.Gastroenterol.,2007；13:845-850.