一株高效固氮芽孢杆菌及含其微生物肥料的制备方法.pdf

本发明涉及一种新的固氮芽孢杆菌及含该菌制备微生物肥料的方法。本发明从土壤中分离获得了一株新的高效固氮菌，鉴定为解淀粉芽孢杆菌[J-25(1)]。利用J-25(1)和特定颗粒载体，制成具有高效固氮作用的微生物肥料；为保障植物的氮、磷、钾平衡供应，在J-25(1)发酵中可加入解磷芽孢杆菌和解钾芽孢杆菌，在载体中添加含磷和钾矿土，制成既有高效固氮作用，又能提供磷和钾的有机微生物颗粒肥料，可满足蔬菜、果树和农作物营养需求。因在植物生长过程中不再施用化肥，不仅节约了能源，还避免了化肥生产和使用中对环境和水源的污染。同时，该菌肥还可减少土传病害发生，提高农产品产量和质量。经济、社会和生态效益十分显著。

权利要求书
1.  一种含新的高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]微生物肥料的制备方法，其特征在于该微生物肥料中含有一株新的高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]和特定矿质材料组分制成的颗粒载体。

2.  根据权利要求1所述的一种含新的高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]微生物肥料，其特征在于所含的一株新的高效固氮芽孢杆菌为[解淀粉芽孢杆菌，acillus amyloliquefaciens，J-25(1)]，该菌种的生物学特性为白色，半透明，光滑湿润菌落，稍隆起，圆形齐整菌落；革兰氏染色菌体紫色，为革兰氏阳性菌，杆状；为生芽孢需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。生长温度25-55℃，最佳生长温度37℃，最适PH6.8-7.8。在不良条件下，菌体转化产生芽孢，芽孢对不良环境抗逆性强，可短时间耐受100℃高温。

3.  该菌的培养条件与普通细菌一致，但为防止其功能退化，需在无糖高盐条件下培养。

4.  根据权利要求1所述的一种含新的高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]微生物肥料，其特征在于所述颗粒载体由腐殖酸、木质素、草木灰、骨钙粉、钾长石粉、磷矿粉以及粘土经混合造粒而成。

5.  根据权利要求1所述的一种含新的高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]微生物肥料，其特征在于所述颗粒载体中腐殖酸、木质素、草木灰、骨钙粉、钾长石粉、磷矿粉及粘土在颗粒载体中所占的比例为3.5∶2∶2.5∶1∶0.3∶0.1∶2，将原料混合造粒并烘干备用。

6.  根据权利要求1所述的一种含新的高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]微生物肥料，其特征在于按照100L发酵液生产1000kg菌肥的比例，将确定体积发酵液离心所得菌体溶于适量水中，对载体进行喷雾，低温烘干获得微生物肥料。

7.  根据权利要求1所述的一种含新的高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]微生物肥料，其特征在于为保障植物的氮、磷、钾平衡供应，在高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]发酵中可加入解磷芽孢杆菌和解钾芽孢杆菌，形成混合多功能菌群。

8.  根据权利要求1所述的一种含新的高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]微生物肥料，其特征在于可在颗粒载体加工配方中添加含磷和钾矿土，制成既有高效固氮作用，又能提供磷和钾供应的有机微生物颗粒肥料。

说明书一株高效固氮芽孢杆菌及含其微生物肥料的制备方法
技术领域
本发明涉及一种新的固氮芽孢杆菌[J-25(1)]及含有该菌株生产微生物肥料的制备方法。
背景技术
我国是一个农业大国，肥料在我国粮食生产中占有非常重要的地位。但是由于长期对化肥的过量和不合理施用，也带来一些不容忽视的问题：1、污染水源：大量使用化肥和水土流失，氮磷营养物可随地表径流进入地面水体中或下渗，通过土壤进行横向运动，然后排入下水或地表水体中，使地表水富营养化，或直接污染地下水。2、土壤变板结：由于大量施用化肥，忽视有机肥的施用，土壤肥力出现某些衰退，有机质匮乏。透气性降低，需氧微生物活性下降，土壤熟化慢、造成土壤板结、作物根系生长发育不良，影响作物生长。3、盐渍化加重：过量施用化肥后，土壤中盐离子增多，pH值升高。使土壤盐渍化加重，防碍根系正常吸水，影响植株生长。4、微量元素缺乏：多年连作的蔬菜等，吸收土壤中的锌、硼、钼、铜、锰等微量元素，又没有补充施用微肥，致使土壤中微量元素日渐减少，因此严重缺少微量元素，影响蔬菜等作物的生长发育。5、活土层变浅：大棚和露地蔬菜多实行茬茬交叉间套作，人工耕作，活土层变浅。6、病虫害积累：连作使病菌虫害在土壤中积累增多，危害加重，根系因而受害腐烂，甚至全株枯死。由于病虫害严重、农药使用量增加，造成蔬菜污染。降低花费的用量，是传统农业向生态农业转化重要目标。
微生物肥料是一种环境友好型肥料，也是未来农林业可持续发展的重要方向之一，它可维持和提高土壤肥力，有利于微生物优势种的繁殖，保持生态平衡，节能减排，且使用方便等优点。因此，微生物肥料越来越受人类青睐。近年来我国微生物肥料发展很快，品种不断增加。因菌种、固氮能力、生产技术和配方等原因，目前市场的微生物肥料产品质量参差不齐。微生物肥料中固氮菌种类、固氮能力、有效活菌数和杂菌量都是产品质量的重要指标。其中菌种种类和数量是决定微生物肥料肥效的核心问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型、高效固氮微生物，并将所述固氮微生物吸附于有机载体上，形成有机微生物肥料。固氮微生物在土壤中温度和湿度适宜的条件下，可大量繁殖，自行固定空气中的分子态氮，为植物提供氮源。因在植物生长过程中不再施用化学氮肥，不仅节约了能源，减少了合成氨过程中的三废排放，还避免了过量施肥对环境环境和水源的污染。同时，有机微生物肥料还可促进作物生长，减少土传病害发生，提高农产品品质和质量。
本发明的目的之一，是提供一株新型、高效固氮的芽孢杆菌[J-25(1)]。
本发明的目的之二，是提供一种适合该高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]生长培养基的配方。
本发明的目的之三，是提供一种由该新型、高效固氮的芽孢杆菌[J-25(1)]菌种制备而成的微生物肥料及其制备方法。
本发明的目的之一可以通过采取如下技术方案达到：
一株新的高效固氮芽孢杆菌(acillus amyloliquefaciens)，具体的，该菌种被命名为“J-25(1)”，该菌种从山东省泰安市岱岳区房村镇的蔬菜大棚连续种植番茄10年以上的土壤中分离，并经驯化，长期保存、转接其性状稳定。
该新型、高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]已于2014年7月25日通过上海生工生物工程有限公司通过16S DNA测序，证明该高效固氮芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌，生物学命名Bacillus amyloliquefaciens，所得序列见序列表，测序单位地址：上海市松江区香闽路698号，生工生物工程(上海)股份有限公司。
该新型、高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]的生物学特性为白色，半透明，光滑湿润菌落，稍隆起，圆形齐整菌落；革兰氏染色菌体紫色，为革兰氏阳性菌，杆状；为生芽孢需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。生长温度25-55℃，最佳生长温度37℃，最适PH6.8-7.8。在不良条件下，菌体转化产生芽孢，芽孢对不良环境抗逆性强，可短时间耐受100℃高温。
本发明还要求保护一种适合该解淀粉芽孢杆菌(高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)])生长的培养基及其制备方法。具体如下：
本发明中所使用到的培养基有：
1号固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂18-20g/L，PH调至7.2。
1号液体培养基：该培养基不含琼脂，其他成分和含量与1号培养基相同，PH调至7.2。
2号固体培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖2.5g/L，NaCl5g/L，琼脂18-20g/L，用NaOH调pH至7.2。
2号液体培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖2.5g/L，NaCl5g/L，用NaOH调pH至7.2。
3号固体培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂18-20g/L，用NaOH调pH至7.2。
3号液体培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，用NaOH调pH至7.2。
4号固体培养基：淀粉5g/L，蔗糖1g/L，酵母浸膏0.2g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钠5g/L，琼脂18-20g/L，用NaOH调pH至 7.2。
4号液体培养基：淀粉5g/L，蔗糖1g/L，酵母浸膏0.2g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钠5g/L，用NaOH调pH至7.2。
以上所有培养基均在使用前经高压蒸汽灭菌(121℃，30分钟)，冷却备用。 
本发明还可采用传统的微生物肥料生产中用到的培养基和培养方法制备该微生物肥料。该菌的培养条件与普通细菌一致，但为防止其功能退化，需在无糖高盐条件下培养。
传统的微生物菌种生产中用到的培养基：淀粉100g/L，豆饼粉100g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化0.01g/L，碳酸钙0.1g/L，酵母膏0.1g/L，PH7.2。
高效固氮芽孢杆菌微生物肥料的具体生产方法：
一、高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]菌种保藏及活化培养
菌种以划线培养的方式在1号固体培养基上保藏，短期保藏条件为4℃，每个月活化1次；长期保藏条件为-20℃，每6个月活化1次。
二、高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]的培养
1、采用本发明提供的方法进行高效固氮芽孢杆菌的培养：
1)自保存培养基取菌种后，划线接入1号固体斜面培养基，37℃培养箱静置黑暗条件下培养36小时；
2)用无菌水冲洗斜面，形成菌悬液；
3)将1体积菌悬液接入约20体积的1号液体培养基中，37℃有氧培养至菌体浓度为109个/ml数量级；
4)将步骤3)得到的菌悬液加入到约5-10倍体积的2号液体培养基中，37℃有氧培养至菌体浓度为109个/ml数量级；
5)将步骤4)得到的菌悬液加入到约50-100倍体积的3号液体培养基中，37℃有氧培养至菌体浓度为109个/ml数量级；
6)将步骤5)得到的菌悬液加入到约5-10倍体积的4号培养基中，37℃培养有氧培养至菌体浓度为109个/ml数量级。
2、采用传统微生物发酵生产方法进行高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]的培养
培养基：淀粉100g/L，豆饼粉100g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化0.01g/L，碳酸钙0.1g/L，酵母膏0.1g/L，PH7.2。
将菌种活化后接入1L上述培养基中，三角瓶摇瓶120r/min，37℃培养24小时，然后按1％接种量接种到250L种子发酵罐中，通气，37℃培养24小时，再按10％接种量接到2500L发 酵罐中，37℃培养24小时，待80％菌体产生芽孢后停止发酵。
三、高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]微生物肥料的生产
1)微生物肥料颗粒载体的制备，所述颗粒载体由腐殖酸、木质素、草木灰、骨钙粉、钾长石粉、磷矿粉以及粘土组成，上述原料在颗粒载体中所占的比例为3.5∶2∶2.5∶1∶0.3∶0.1∶2，将原料混合造粒并烘干备用；
2)高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]微生物肥料产品制备，可以通过采取如下技术方案达到：按照100L发酵液生产1000kg菌肥的比例，将确定体积发酵液离心所得浓缩菌体溶于适量水中，将之喷雾吸附于载体上，m菌悬液∶m载体＝1∶10，然后将吸附有菌体的载体颗粒与淀粉混合，m淀粉∶m颗粒＝1∶10。
本发明具有如下实质性特点：
1、本发明从土壤中分离获得了一株新的高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]，并研究了其培养、保种、等条件，鉴定明确该菌为一株新的解淀粉芽孢杆菌(acillus amyloliquefaciens)。
2、本发明由于设置特定的物质配方并在特定工艺条件下进行发酵培养，因此，制备微生物肥料产品质量好、培养成本低和培养效率高。
3、在本菌种[J-25(1)]使用本发明提供的发酵方式进行发酵生产的微生物肥料，入库时经有效菌数检测，有效菌数符合企业和国家标准。所生产的微生物肥料储藏两年，和新生产的产品在应用中对比，固氮效果无明显差异，储藏有效期可达2年以上。
4、申请人采取了新的高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]和特定颗粒载体配方，制成具有高效固氮作用的有机微生物颗粒肥料，于作物种植时施于土壤中，在温湿度适宜条件下，可满足蔬菜、果树和农作物整个生长期的氮源供应，并具有改良土壤、促进生长、提高产量和品质等突出效果。
5、本发明为保障植物的氮、磷、钾平衡供应，在高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]发酵中可加入解磷芽孢杆菌和解钾芽孢杆菌，形成混合多功能菌群，在加工配方中添加含磷和钾矿土，制成既有高效固氮作用，又能提供磷和钾供应的有机微生物颗粒肥料。
具体实施方式
具体实施例1
1、采用本发明提供的方法进行高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]培养：
(1)自保存培养基取种后，划线接入1号固体斜面培养基，37℃培养箱静置黑暗条件下培养36小时；
(2)用无菌水冲洗斜面，形成菌悬液；
(3)将1体积菌悬液接入约20体积的1号液体培养基中，37℃有氧培养至菌体浓度为109 个/ml数量级；
(4)将步骤3)得到的菌悬液加入到约5-10倍体积的2号液体培养基中，37℃有氧培养至菌体浓度为109个/ml数量级；
(5)将步骤4)得到的菌悬液加入到约50-10倍体积的3号液体培养基中，37℃有氧培养至菌体浓度为109个/ml数量级；
(6)将步骤5)得到的菌悬液加入到约5-10倍体积的4号培养基中，37℃培养有氧培养至菌体浓度为109个/ml数量级。
2、采用传统微生物发酵生产方法进行高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]培养
培养基：淀粉100g/L，豆饼粉100g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化0.01g/L，碳酸钙0.1g/L，酵母膏0.1g/L，PH7.2。
将菌种活化后接入1L上述培养基中，三角瓶摇瓶120r/min，37℃培养24小时，然后按1％接种量接种到250L种子发酵罐中，通气，37℃培养24小时，再按10％接种量接到2500L发酵罐中，37℃培养24小时，待80％菌体产生芽孢后停止发酵。
3、高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]微生物肥料的生产
(1)微生物肥料颗粒载体的制备，所述颗粒载体由腐殖酸、木质素、草木灰、骨钙粉、钾长石粉、磷矿粉以及粘土组成，上述原料在颗粒载体中所占的比例为3.5∶2∶2.5∶1∶0.3∶0.1∶2，将原料混合经滚动造粒机造粒、烘干备用；
(2)微生物肥料产品制备，可以通过采取如下技术方案达到：按照100L发酵液生产1000kg菌肥的比例，将确定体积高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]发酵液离心所得的菌体，溶于适量水中，在混合机内对载体进行喷雾，m菌悬液∶m载体＝1∶10，然后将吸附有高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]菌体的载体颗粒与淀粉混合，m淀粉∶m颗粒＝1∶10。
实施例1：对利用本发明提供的方法制备的微生物肥料在未长时间库存的条件下进行菌数检测，按照常规的稀释平板记数法检测微生物菌种剂中的活菌含量。称取微生物菌种剂1克(库存半个月)，用无菌水溶解，在摇床上震荡20分钟，得到菌悬液，取该菌悬液0.5mL，加入4.5mL灭菌水中，混匀得5×10-1的菌悬液，并以此类推，继续获得浓度为5×10-2、5×10-3、5×10-4、5×10-5和5×10-6的菌悬液。将浓度为5×10-5和5×10-6的菌悬液各取30μL于平板上，以涂布器涂抹均匀，每个浓度重复4次。37℃培养24h后进行菌落计数，并根据稀释浓度最终折算为发酵液所含菌量。企业控制标准：≥2.0*108个/克。
实施例2：对利用本发明提供的方法制备的微生物肥料在未长时间库存的条件下进行菌数检测，按照常规的稀释平板记数法检测微生物肥料中的活菌含量。称取微生物肥料1克(库 存1年)，用无菌水溶解，在摇床上震荡20分钟，得到菌悬液，取该菌悬液0.5mL，加入4.5mL灭菌水中，混匀得5×10-1的菌悬液，并以此类推，继续获得浓度为5×10-2、5×10-3、5×10-4、5×10-5和5×10-6的菌悬液。将浓度为5×10-5和5×10-6的菌悬液各取30μL于平板上，以涂布器涂抹均匀，每个浓度重复4次。37℃培养24h后进行菌落计数，并根据稀释浓度最终折算为发酵液所含菌量。企业控制标准：≥2.0*108个/克。
实施例3：该新型微生物肥料的应用效果如下：
将用高效固氮芽孢杆菌[J-25(1)]制成的微生物肥料在番茄、黄瓜和西葫芦上进行试验，试验设3个重复。试验时将微生物肥料产品按600-800公斤/亩穴施。常规蔬菜有机肥1000公斤/亩穴施。番茄专用复合肥每亩施500-600公斤，其中300公斤均作为基肥；果实膨大期和采收初期各追施1次，每次100、150公斤。大棚番茄田间试验结果见表1(表中数据均为各肥料相对于空白对照的增产百分比)。
表1施用不同肥料对番茄产量的影响(山东泰安房村镇西良甫村2013)

表中数据经统计软件SPSS进行数据分析，同一列中的不同字母表示在p＝0.05水平下差异显著，下同。
大棚黄瓜试验时将微生物肥料产品按600-800公斤/亩穴施。常规蔬菜有机肥1000公斤/亩穴施。黄瓜专用复合肥每亩施500-600公斤，其中300公斤均作为基肥；果实膨大期和采收初期各追施1次，每次100、150公斤。大棚黄瓜田间试验结果见表2。
表2施用不同肥料对黄瓜产量的影响(山东泰安房村镇北滕村2013)

大棚西葫芦试验时将微生物肥料产品按400-600公斤/亩穴施。常规蔬菜有机肥800公斤/亩穴施。西葫芦专用复合肥每亩施300-400公斤，其中200公斤均作为基肥；果实膨大期和采收初期各追施1次，每次50、100公斤。大棚西葫芦田间试验结果见表3。
表3施用不同肥料对西葫芦产量的影响(山东泰安房村镇西良甫村2013)

田间试验结果表明，在大棚蔬菜移栽时施用该微生物肥料，每亩600-800公斤/亩穴施，均能保障番茄、黄瓜和西葫芦等蔬菜的氮素供应，较施用常规有机肥和复合肥的处理增产效果显著。