一种临床用牙髓干细胞及其制备方法.pdf

本发明涉及一种临床用牙髓干细胞及其制备方法，本发明提供牙髓干细胞符合临床应用要求，其制备方法包括采集健康的牙齿、牙髓分离、牙髓干细胞培养、干细胞传代培养和冷冻、干细胞扩大培养、干细胞临床使用前处理，使用无血清培养基，在相关步骤进行严格的病毒、细菌、真菌检测，活率无明显降低、安全性高。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现牙髓干细胞的临床标准产品。

权利要求书
1.  一种临床用牙髓干细胞，其特征在于，可以直接应用于临床。

2.  如权利要求1所述的临床用牙髓干细胞的制备方法，其特征在于， 包括如下步骤：
步骤(1)、牙齿采集：采集志愿者血样进行病毒学检测，合格后采集 健康志愿者牙齿，常规灭菌处理后，4℃冷藏，并于72小时内进行分离处 理；
步骤(2)、牙髓分离：将牙齿转移至培养皿中用生理盐水清洗；切开 牙齿硬组织，取出牙髓；清洗牙髓，将牙髓组织放于30-50倍体积的含 0.1％-0.3％胶原酶和0.2-0.4％DISPASE II酶溶液中消化1-3h；1500rpm离心 清洗2次，加入适量培养液接种于培养皿中；
步骤(3)、牙髓干细胞P0代细胞培养：将细胞在37℃、5％CO2、饱和 湿度环境中培养；每隔3-5天换培养液一次，换液时1000rpm离心，弃取 上清液，重新加入培养液培养；培养至21-30天，当培养皿中有4个以上 大克隆团，用胰蛋白酶消化传代；
步骤(4)、传代培养及冻存：将P0代细胞接种于2个T75中；3天后， 细胞密度达70％-100％，细胞数约为8×106-10×106，收集细胞并计数和 活率，将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取约2×104个细胞做细胞 表面标志检测；按1×106-2×106/ml/管加入冷冻液进行冷冻保存；
步骤(5)、牙髓干细胞扩大培养：取冷冻细胞，复苏接种培养，为P2代，三天后，细胞密度达70％-100％，胰蛋白酶消化传代，细胞接种密度为 8000-10000个/cm2，三天后收集细胞并计数和活率，将细胞上清进行无菌 检测、支原体检测，取适量细胞进行干细胞分化能力实验检测，按 2×107/ml/管加入冷冻液进行冷冻保存；
步骤(6)、牙髓干细胞临床使用前处理：取冷冻细胞，复苏后用生理 盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，进行内毒素和细菌检测，根据计 数结果按临床需要将细胞和0.9％的氯化钠溶液混匀待用。

3.  根据权利要求2所述的临床用牙髓干细胞的制备方法，其特征在于， 步骤(2)中，所述的病毒学检测项目包括采集牙齿携带的乙肝、丙肝、艾 滋、梅毒病毒和采集者的遗传家族史。

4.  根据权利要求2所述的临床用牙髓干细胞的制备方法，其特征在于， 所述的培养液为DPSC Bulletkit Medium，其组成包括：DPSC Basal Medium、 DPSC SingleQuo Kit。

5.  根据权利要求2所述的临床用牙髓干细胞的制备方法，其特征在于， 所述的胰蛋白酶的浓度为0.05％，由0.25％成品胰酶稀释5倍得到。

6.  根据权利要求2所述的临床用牙髓干细胞的制备方法，其特征在于， 步骤(3)中，所述换液过程中，前两次换液的上清液离心重悬后继续培养 3-5天，离心弃取上清液，培养物和步骤(3)中第三或第四次换液后的细 胞合并培养。

7.  根据权利要求2所述的临床用牙髓干细胞的制备方法，其特征在于， 步骤(4)和(5)中，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测； 所述支原体检测为用PCR法进行支原体检测。

8.  根据权利要求2所述的临床用牙髓干细胞的制备方法，其特征在于， 步骤(4)中，所述的细胞表面标志检测，包括检测阳性指标CD29，CD44， CD73，CD90以及阴性指标CD34，CD45，HLA-DR。

9.  根据权利要求2所述的临床用牙髓干细胞的制备方法，其特征在于， 所述的冷冻液由培养液和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜的浓度为 10％。

10.  根据权利要求2所述的临床用牙髓干细胞的制备方法，其特征在于， 步骤(5)中，所述的干细胞分化能力实验检测，包括干细胞分别向成脂、 成骨、成软骨三个方向分化能力检测，分别进行油红0染色、茜素红染色 和阿尔新蓝染色鉴定。

说明书一种临床用牙髓干细胞及其制备方法
技术领域
本发明属细胞生物学领域，具体涉及一种临床用牙髓干细胞及其制备方法。
背景技术

干细胞(Stem Cells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括骨髓、脐带、脐带血、牙齿与脂肪。
2000年首次发现了牙髓干细胞，Gronthos等发现在离体的乳牙和智齿中都存在牙髓干细胞。这是一类具有高增殖能力、高度自我更新能力、多项分化能力的细胞。已有研究利用该细胞成功地构建牙髓、牙本质以及牙齿组织。牙髓干细胞(dental pulp stem cell，DPSC)与其他组织来源的干细胞在生物学特性上有很多相似之处。Gronthos等对牙髓干细胞的克隆形成率进行了研究，与骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell，BMSC)比较后发现：牙齿来源的DPSC的克隆形成率明显高于骨髓来源的BMSC，这就表明DPSC具有较BMSC更高的增生能力和自我更新能力。Miura等发现：从1颗脱落前牙取材的每12-20个细胞就可以形成黏附克隆集落，这是间质干细胞增殖的典型表现。进一步的实验结果表明：与BMSC和DPSC 相比较，SHED有更高的增殖能力。DPSC在不同诱导剂的作用下，可分化为成牙本质细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经样细胞等多种细胞。研究人员主要集中研究牙髓干细胞的体内外成骨的潜能，如Cordeiro等利用牙髓干细胞与生物可降解支架和人牙齿切片复合移植于免疫缺陷小鼠，14～28d后将移植物进行免疫组织化学的检查，结果发现牙本质涎蛋白表达阳性，推断牙髓干细胞在体内能分化为成牙本质样细胞。在成脂、成软骨和成神经诱导方面均有研究证实牙髓干细胞具有多向分化的潜能，为其在体内植入牙髓干细胞使受损或衰退的组织、器官改善或恢复功能提供了理论依据。
目前公开的各类牙髓干细胞制备方法虽均能获得牙髓干细胞，但都不符合临床应用的标准，本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现牙髓干细胞的临床标准产品。
发明内容
本发明提供一种临床用牙髓干细胞的制备方法，本发明制备方法在牙齿采集前对志愿者进行筛选，以符合条件的健康志愿者作为采集目标，之后进行分离扩增培养直至第一代，进行冷冻保存，对分离过程及冷冻过程的的中间品进行一系列质量检测，确保样品质量，待临床使用时复苏细胞，扩大培养至第三代收获，洗涤待用，活率无明显降低。
本发明提供一种临床用牙髓干细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤(1)、牙齿筛选与保存：采集志愿者血样进行病毒学检测，合格后采集健康志愿者牙齿，常规灭菌处理后，4℃冷藏，并于72小时内进行分离处理；
步骤(2)、牙髓分离：将牙齿转移到培养皿中，生理盐水清洗；切开牙齿硬组织，取出牙髓；清洗牙髓，将牙髓组织放于30-50倍体积的含0.1-0.3％胶原酶，0.2-0.4％DISPASE II酶溶液中消化1-3h；1500rpm离心清洗2次，加入适量培养液接种于培养皿，；
步骤(3)、牙髓干细胞P0代细胞培养：将细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养；每隔3-5天换培养液一次，换液时1000rpm离心，弃取上清液，重新加入培养液培养；培养至21-30天，当培养皿中有4个以上大克隆团，用胰蛋白酶消化传代；
步骤(4)、传代培养及冻存：将P0代细胞接种于2个T75中；3天后，细胞密度达70％-100％，细胞数约为8×106-10×106，收集细胞并计数和活率，将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取约2×104个细胞做细胞表面标志检测，检测阳性指标CD29，CD44，CD73，CD90以及阴性指标CD34，CD45，HLA-DR；按1×106-2×106/ml/管加入冷冻液进行冷冻保存，冷冻液由培养液和二甲基亚砜(DMSO)配制而成，其中二甲基亚砜的浓度为10％；
步骤(5)、牙髓干细胞扩大培养：取冷冻细胞，复苏接种培养，为P2代，三天后，细胞密度达70％-100％，胰蛋白酶消化传代，细胞接种密度为8000-10000个/cm2，三天后收集细胞并计数和活率，将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取适量细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定；按2×107/ml/管加入冷冻液进行冷冻保存；
步骤(6)、牙髓干细胞临床使用前处理：取冷冻细胞，复苏后用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，进行内毒素和细菌检测，根据计 数结果按临床需要将细胞和0.9％的氯化钠溶液混匀待用。
优选地，步骤(1)中，所述的病毒学检测项目包括采集牙齿携带的乙肝、丙肝、艾滋、梅毒病毒和采集者的遗传家族史。
优选地，所述胰蛋白酶的浓度为0.05％，由0.25％成品胰酶稀释5倍；胰蛋白酶用于细胞消化过程，细胞会出现大量的结团现象，不利于细胞计数，而且高浓度的胰蛋白酶对细胞的损伤较大，会降低细胞的活性和干性，试验发现0.05％的胰蛋白酶可以有效的防止细胞结团的发生，且有效的保持细胞活性和干细胞干性。
优选地，所述培养液为DPSC Bulletkit Medium，货号：PT-3005，为LONZA公司生产的商品化培养基，其组成包括：DPSC Basal Medium(货号：PT-3927)、DPSC SingleQuo Kit(货号：PT-4516)；其不含任何动物成分，以无热源水配制，经除菌过滤后分装，无抗生素添加，该试剂使用时不需要添加动物血清和其他任何动物源成分，可以最大限度的减少非人源因素的影响，使生产的牙髓干细胞适用于临床应用。
优选地，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。
优选地，所述冷冻液由培养液和二甲基亚砜(DMSO)配制而成，其中二甲基亚砜(DMSO)的浓度为10％；用于保护冷冻细胞的活性。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、全过程全面质量监控，从牙齿采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控；
2、无血清培养基，避免异源蛋白可能引起的疾病或过敏风险；
3、规模化培养，保证细胞均一性和有效性；
4、低浓度胰酶消化，保持细胞的活性及干细胞的干性；
5、干细胞表面标志检测的阳性指标表达率99％以上，阴性指标2％以下。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本实施例提供一种临床用牙髓干细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤(1)、牙齿筛选与保存：采集健康志愿者牙齿，常规灭菌出来后，4℃冷藏，并于72小时内进行分离处理；采集志愿者血样进行病毒学检测，所述的病毒学检测项目包括采集牙齿携带的乙肝、丙肝、艾滋、梅毒病毒、巨细胞病毒、HTLV和采集者的遗传家族史；
步骤(2)、牙髓分离：将牙齿转移到培养皿中，生理盐水清洗；切开牙齿硬组织，取出牙髓；清洗牙髓，将牙髓组织放于50倍体积的含0.1％胶原酶，0.2％DISPASE II酶溶液中消化1h；1500转/min离心清洗2次，加入适量培养液接种于培养皿，培养液为DPSC Bulletkit Medium，货号：PT-3005，为LONZA公司生产的商品化培养基；
步骤(3)、牙髓干细胞原代培养：将细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养；每隔3天换培养液一次，换液时1000rpm离心，弃取上清液，重新加入培养液培养；培养至30天，培养皿中有6个大克隆团，用0.05％胰蛋白酶消化传代；
步骤(4)、传代培养及冻存：将P0代细胞接种于2个T75中；3天后，细胞密度达80％，细胞数约为9×106，收集细胞并计数和活率，按1.1×106/ml/管，加入由培养液和10％二甲基亚砜(DMSO)配制而成的冷冻液进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取约2×104个细胞做细胞表面标志检测，检测阳性指标CD29，CD44，CD73，CD90以及阴性指标CD34，CD45，HLA-DR；
步骤(5)、牙髓干细胞扩大培养：取冷冻细胞，复苏接种培养，为P2代，三天后，细胞密度达80％，胰酶消化传代，细胞接种密度为约8000个/cm2，三天后收集细胞并计数和活率，按1×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取1×104细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定。

步骤(6)、临床用牙髓干细胞使用：取冷冻细胞，复苏后用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和0.9％的氯化钠溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
检测结果： 
对实施例中制备的间充质干细胞进行临床标准检测，检测结果如下：
检测项目 检测结果 人类免疫缺陷病毒 阴性 HIV-RNA荧光定性 阴性 HTLV-I/II型抗体 阴性 乙肝表面抗原定性 阴性 乙肝表面抗体定性 阴性 乙肝e抗原定性 阴性 乙肝e抗体定性 阴性 乙肝核心抗体定性 阴性 丙肝病毒抗体 阴性 丙肝病毒RNA定性 阴性 CMV-IgM抗体 阴性 梅毒螺旋体特异抗体 阴性 人类嗜T细胞病毒 阴性 细菌、真菌血培养 无菌生长 支原体培养 阴性 内毒素检测 阴性 CD29 99.17％ CD44 99.99％ CD73 99.97％ CD90 99.98％ CD34 1.08％ CD45 0.78％ HLA-DR 1.08％ 细胞数 0.96×107 细胞活率 96％ 细胞成脂分化鉴定 正常 细胞成软骨分化鉴定 正常 细胞成骨分化鉴定 正常
检测结果显示，实施例1制得牙髓干细胞各项标准均符合临床要求。
实施例2：
本实施例提供一种临床用牙髓干细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤(1)、牙齿筛选与保存：采集健康志愿者牙齿，常规灭菌处理后，4℃冷藏，并于72小时内进行分离处理；采集志愿者血样进行病毒学检测，所述的病毒学检测项目包括采集牙齿携带的乙肝、丙肝、艾滋、梅毒病毒、巨细胞病毒、HTLV和采集者的遗传家族史；
步骤(2)、牙髓分离：将牙齿转移到培养皿中，生理盐水清洗；切开牙齿硬组织，取出牙髓；清洗牙髓，将牙髓组织放于50倍体积的含0.1％胶原酶，0.2％DISPASE II酶溶液中消化1h；1500转/min离心清洗2次，加入适量培养液接种于培养皿，培养液为DPSC Bulletkit Medium，货号：PT-3005，为LONZA公司生产的商品化培养基；
步骤(3)、牙髓干细胞原代培养：将细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养；每隔3天换培养液一次，换液时1000rpm离心，弃取上清液，重新加入培养液培养；前两次换液的上清液离心重悬后继续培养3-5天，离心弃取上清液，培养物和第三步以后P0代细胞合并培养至30天，培养皿中有6个大克隆团，用0.05％胰蛋白酶消化传代；
步骤(4)、传代培养及冻存：将P0代细胞接种于2个T75中；3天后，细胞密度达80％，细胞数约为9×106，收集细胞并计数和活率，按1.1×106/ml/管，加入由培养液和10％二甲基亚砜(DMSO)配制而成的冷冻液进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取约2×104个细胞做细胞表面标志检测，检测阳性指标CD29，CD44，CD73，CD90以及阴性指标CD34，CD45，HLA-DR；
步骤(5)、牙髓干细胞扩大培养：取冷冻细胞，复苏接种培养，为P2代，三天后，细胞密度达80％，胰酶消化传代，细胞接种密度为约8000个/cm2，三天后收集细胞并计数和活率，按1×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取1×104细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定。

步骤(6)、临床用牙髓干细胞使用：取冷冻细胞，复苏后用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和0.9％的氯化钠溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
检测结果： 
对实施例中制备的间充质干细胞进行临床标准检测，检测结果如下：
检测项目 检测结果 人类免疫缺陷病毒 阴性 HIV-RNA荧光定性 阴性 HTLV-I/II型抗体 阴性 乙肝表面抗原定性 阴性 乙肝表面抗体定性 阴性 乙肝e抗原定性 阴性 乙肝e抗体定性 阴性 乙肝核心抗体定性 阴性 丙肝病毒抗体 阴性 丙肝病毒RNA定性 阴性 CMV-IgM抗体 阴性 梅毒螺旋体特异抗体 阴性 人类嗜T细胞病毒 阴性 细菌、真菌血培养 无菌生长 支原体培养 阴性 内毒素检测 阴性 CD29 99.17％ CD44 99.99％ CD73 99.97％ CD90 99.98％ CD34 1.08％ CD45 0.78％ HLA-DR 1.08％ 细胞数 0.98×107 细胞活率 98％ 细胞成脂分化鉴定 正常 细胞成软骨分化鉴定 正常 细胞成骨分化鉴定 正常
检测结果显示，实施例2制得的牙髓干细胞的各项标准均符合临床应用要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。