特异性识别Β葡萄糖醛酸苷酶的核酸适配体序列及其应用.pdf

本发明提供了一组β-葡萄糖醛酸苷酶核酸适配体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明采用SELEX技术结合Ni2+修饰的磁珠的筛选方法，以β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E为筛选靶标，筛选获得能够特异性结合PGUS-E的核酸适配体SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。在核酸适配体与β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E特异性结合的基础上，可用于检测、分离、纯化及固定化β-葡萄糖醛酸苷酶。

权利要求书
1.  一种能够结合β-葡萄糖醛酸苷酶核酸适配体，所述适配体选自下述序列之一：
5’-TGTGCTTCTCGGTGCCATCGTGGCTTTGACCAGTTTTATC-3’(SEQ ID NO:1)(Ap5) 
5’-TTACCACCTTAGGCTATACATCGAGGTGTCTGAACCCTTG-3’(SEQ ID NO:2)(Ap9) 。

2.  根据权利要求1的核酸适配体，其中所述核酸适配体在β-葡萄糖醛酸苷酶的纯化和固定化的用途。

说明书特异性识别β-葡萄糖醛酸苷酶的核酸适配体序列及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，针对β-葡萄糖醛酸苷酶的核酸适配体。公开的核酸适配体有希望能够实现β-葡萄糖醛酸苷酶的纯化和固定化的应用。
背景技术
β-葡萄糖醛酸苷酶是一种糖苷类水解酶，能催化各种类型的β-葡萄糖醛酸苷水解，在动物体内参与广泛的代谢过程从而维持机体正常的生理活动，临床上可作为肿瘤治疗中靶向前药的水解酶，另外还被广泛用于水质检测、体内代谢药物分析、天然产物的生物催化转化等领域。特别是作为催化剂应用于生物转化甘草酸生产甘草次酸和单葡萄糖醛酸基甘草次酸过程中，克服了传统化学法的反应条件苛刻，选择性差，产物收益率低，污染环境等缺陷。β-葡萄糖醛酸苷酶作为生物催化转化甘草酸的关键酶，已受到越来越多的关注，具有广阔的应用和开发前景。固定化β-葡萄糖醛酸苷酶使工业用β-葡萄糖醛酸苷酶的稳定性提高并延长了β-葡萄糖醛酸苷酶的使用寿命。因此β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化受到了较为广泛的关注。
酶的固定化方法主要有吸附法，共价偶联法，交叉法和包埋法等。但是，大量研究表明这些固定化方法会一定程度上降低固定化酶的活性，主要原因为固定化酶的空间位阻的存在阻碍底物与β-葡萄糖醛酸苷酶的活性位点的结合。另外，酶通过多位点与载体的无序结合改变其活性构象，从而造成酶活的损失。基于以上考虑，利用酶的特定位点和特定的材料及工艺将酶定向固定化到载体上，维持了酶的活性位点的稳定的构象，利于和底物结合与反应，能显著提高固定化酶的活性和使用效率。同时，生物相容性差也是引起β-葡萄糖醛酸苷酶的变性和活力的下降的原因，具有良好的生物相容性的载体能够为β-葡萄糖醛酸苷酶创造适宜的微环境。
核酸适配体是一种经体外筛选技术得到的寡核苷酸序列(DNA/RNA)，与相应的靶分子具有严格的识别能力和高度的亲和力。目前，核酸适配体的主要通过SELEX技术体外筛选获得，其核心是模拟自然进化过程，通过寡核苷酸间的碱基相互作用形成稳定的二级结构(凸环、发卡、假节、G-四联体等)与靶分子的特异性结合，利用寡核苷酸文库与靶分子亲和力的不同，进行多轮的筛选，最终获得与靶分子高亲和力和高特异性结合的寡核苷酸序列。目前已被成功的应用于氨基酸、多肽、蛋白质、有机化合物、金属离子、细胞等快速检测。与抗体等多肽类的适配体相比，核酸适配体的优势相当明显，如：制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、靶分子范围广、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰，同时具有良好的生物相容性特点等优点。
目前，针对β-葡萄糖醛酸苷酶，尚无关于与其具有高特异性和高亲和力的核酸适配体及其制备方法和和应用的研究报道。因此本发明通过筛选获得对β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性核酸适配体，实现β-葡萄糖醛酸苷酶的定向纯化和固定化，提高β-葡萄糖醛酸苷酶的使用效率，降低使用成本，具有重要的社会价值。
发明内容
本发明的目的是提供一组β-葡萄糖醛酸苷酶核酸适配体序列，具体涉及一种β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E的核酸适配体中具有高亲和力和高特异性结合PGUS-E。
本发明中，所述的β-葡萄糖醛酸苷酶为β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E。
本发明采用核酸适配体序列的体外筛选(SELEX)技术，以β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E为筛选靶标，筛选与PGUS-E特异结合的核酸适配体，获得具有特异结合PGUS-E的核酸适配体Apt5和Apt9。
本发明通过下述技术方案实现：
采用改进的核酸适配体的体外筛选技术即SELEX技术，以β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E为筛选靶标，从体外合成的随机寡核苷酸文库5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTATGCGTGCT ACC GTGAA-3’)中筛选出与PGUS-E特异性结合的核酸适配体；将筛选出的核酸适配体序列用引物Apt-F(5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’)和Apt-R(5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’)进行PCR扩增并进行TA克隆与pMD19-T载体(大连宝生物公司)，转化Top10细菌(北京博迈德生物公司)；通过pMD19-T载体通用引物M13F(-47)：(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和M13R(-48)：(5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆，将阳性克隆菌落培养后送北京金维智生物公司测序。
通过测序获得的核酸适配体对PGUS-E进行纯化固定化测定，将生物素修饰的核苷酸适配体与链霉素修饰的磁珠共价连接，进行核苷酸适配体与PGUS-E的特异性捕捉和固定化测定。
附图说明
图1为本发明所涉及的基于SELEX技术的核酸适配体的筛选流程图。
图2为本发明核酸适配体固定化PGUS-E的稳定性对比图。图中(◆)表示Apt5固定化PGUS-E，(■)表示Apt9固定化PGUS-E。
具体实施方式
实施例1：β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E的制备
将含有质粒pET-28a-GUS/BL21(DE3)菌株接种于30ml的LB(卡那霉素Kanamycin 50μg/ml)，37℃过夜制备种子液，以1/100的接种量转接于500ml的新鲜的LB(卡那霉素Kanamycin 50μg/ml)培养基中，在37℃条件下培养直至OD600＝～0.6时，加入异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(0.5mM)，16℃条件诱导5小时。诱导后的菌体4℃，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清收集菌体，菌体重悬于蛋白破碎缓冲液洗涤，4℃，12000转/分钟，离心10分钟。最后将菌体重悬于20ml蛋白缓冲液中，冰浴中超声破碎。超声破碎后的菌液4℃，12000转/分钟，离心20分钟，收集上清，获得粗酶液。
β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E的纯化。粗酶液利用AKTApurifaction系统进行平衡、装载，再平衡，然后用蛋白洗脱液洗脱蛋白并收集洗脱液，洗脱蛋白的缓冲液各组分如下：50mM Tris-HCl，300mmol/LNaCl，pH 8.0其中咪唑浓度为25mM。将镍柱洗脱收集的目标蛋白稀释，盐离子浓度控制在50mM以下装载到强阴离子柱SoucerQ 200，控制盐离子浓度洗脱目标蛋白，洗脱蛋白的缓冲液各组分如下：50mmol/LTris-HCl，pH 7.3，盐离子浓度控制在250-300mM之间。将经由强阴离子交换柱纯化获得的目标蛋白样品装载到SuperdexTM 20010/300进行分子筛纯化，分子筛缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 7.3，目的蛋白经过凝胶排阻层析纯化，收集分离的蛋白，短期贮存于4℃或长期贮存在-80℃冷冻。
实施例2：β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E的核酸适配体的制备和鉴定
使用固定在Ni-NTA-磁珠上的β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E通过磁性分离选择PGUS-E的核酸适配体。选择的初级核苷酸随机文库ssDNA(Apt-selection)由北京金维智生物公司化学合成且通过HPLC纯化。(Apt-selection：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’)。
核酸适配体富集所以引物：
Apt-F：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，化学合成(HPLC纯化)。
Apt-R：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’，分别以磷酸化和未磷酸化的形式化学合成(HPLC纯化)
将10μM的核苷酸随机文库DNA与固定在Ni-NTA-磁珠上的PGUS-E在常温条件下孵育30分钟。将结合与未结合PGUS-E的核酸适配体通过磁性分离，并用洗涤缓冲液PBS-T进行多次洗涤。将结合的序列用250mM咪唑溶液洗脱，且使用Apt-F和磷酸化的Apt-R引物PCR扩增并回收。通过核酸外切酶LambdaExonuclease酶切并回收获得单链ssDNA次级文库，可进行下一轮筛选。
通过12轮的筛选，每隔三轮正筛选添加一步反筛选去除Ni-NTA-磁珠本身对核酸适配体的非特异性吸附作用，去除与磁珠表面的功能基团具有亲和力的ssDNA。在最后一轮SELEX筛选过程中，使用Apt-F和未磷酸化的Apt-R引物PCR并回收dsDNA片段，并克隆到pMD19-T载体(大连宝生物公司)中，利用通过pMD19-T载体通用引物(M13F(-47)：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和(M13R(-48)：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)进行菌落PCR验证阳性克隆，挑选阳性克隆送北京金维智生物公司测序。
对于核酸适配体特异性结合PGUS-E的酶联测定，将生物素化的核苷酸适配体分别加热至95℃，5分钟，并快速置于冰上冷却。将50nM的不同的核酸适配体，与PGUS-E蛋白和链霉素修饰的磁珠共同混合孵育15分钟。通过磁性分离磁珠，将分离的磁珠用洗涤缓冲液PBS-T进行3次洗涤，每次5分钟。收集磁珠，去除洗涤液，在各核酸适配体修饰的磁珠中加入100μl的含有1.25mM对硝基苯β-D-葡萄糖醛酸(pNPG)的醋酸/醋醋酸钠缓冲溶液(pH4.2)中，40℃条件下反应10分钟后，加入200μL 0.4M的碳酸钠溶液终止反应，终止反应后的样品用酶标仪于405nm下检测对硝基苯酚(pNP)的含量，定量检测不同核酸适配体结合PGUS-E的蛋白复合物。
两个不同的核酸适配体序列鉴定为能够与β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E结合：
5’-TGTGCTTCTCGGTGCCATCGTGGCTTTGACCAGTTTTATC-3’(SEQ ID NO:1)(Ap5)
5’-TTACCACCTTAGGCTATACATCGAGGTGTCTGAACCCTTG-3’(SEQ ID NO:2)(Ap9)
实施例3：PGUS-E核酸适配体对PGUS-E的纯化固定化应用
对于PGUS-E核酸适配体对PGUS-E的纯化测定，将生物素化的核苷酸适配体与链霉素修饰的磁珠进行常温孵育10分钟，加热至95℃，5分钟，并快速置于冰上冷却3分钟。将固定有核酸适配体的磁珠与PGUS-E粗酶液在摇床上常温孵育30min，磁力架分离磁珠弃液体，磁珠用洗涤缓冲液洗涤3次。分别用SDS-PAGE电泳和BCA法检测纯化得到的β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E的纯化纯度与纯化量。经检测得到的核酸适配体Apt5和Apt9分离纯化PGUS-E蛋白的分离效率分别为31.75μg/mg和32.95μg/mg。同时，考察了利用核酸适配体纯化得到的β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E的固定化效率，在固定有核酸适配体结合得PGUS-E的磁珠中加入100μl的含有1g/L甘草酸的醋酸/醋醋酸钠缓冲溶液(pH4.2)中，40℃条件下反应10分钟后，利用磁性分离磁珠，加入10μL1M的NaOH溶液终止反应，利用高效液相检测甘草酸的转化量检测PGUS-E的酶活。实验结果如图2，经过7个批次的重复使用，Apt5核酸适配体固定化PGUS-E仍然保持72％的初始活力，Apt9核酸适配体固定化PGUS-E仍然保持56％的初始活力。
序列表