牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针.pdf

本发明公开了一种牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针。用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR引物，是根据牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域设计的。本发明可方便高效地检出牛棒状杆菌，具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的优点。

权利要求书
1.  用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR引物，是根据牛棒状杆菌16SrRNA  V3区基因的保守区域设计的，所述的牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因具有SEQ ID NO. 1所示的寡核苷酸序列。

2.  根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述引物中的上游引物具有SEQ ID  NO.2所示序列的寡核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO.3所示序列的寡核苷酸序 列。

3.  用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR TaqMan MGB探针，是根据牛棒状 杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域设计的，所述的牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因 具有SEQ ID NO.1所示的寡核苷酸序列。

4.  根据权利要求3所述的探针，其特征在于：所述探针具有SEQ ID NO.4所示 序列的寡核苷酸序列，且其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。

5.  根据权利要求4所述的探针，其特征在于：所述的报告荧光基团为FAM，所 述的淬灭荧光基团为NFQ。

6.  一种用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括权利要求1 或2的引物，以及权利要求3、4或5的TaqMan MGB探针。

7.  根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下用于20μL 反应体系的试剂：TaqMan Mix 10μl，上游引物5pmol，下游引物5pmol，TaqMan  MGB探针2.5pmol。

8.  根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照 和阴性对照，所述阳性对照为含有牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域的质粒， 所述阴性对照为不含牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域的扩增体系，所述的 牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因具有SEQ ID NO.1所示的寡核苷酸序列。

9.  权利要求1或2所述的引物或权利要求3或4或5所述的探针或权利要求6 或7或8的试剂盒在牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测中的应用。

10.  根据权利要求9所述的应用，包括以下步骤：
(1)标准曲线的绘制：以含有牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域的质 粒为标准品，将其进行系列稀释，将所述质粒作为模板，进行实时荧光定量PCR检 测，得到用于牛棒状杆菌检测的标准曲线；
(2)待测样品的检测：以待测样品基因组DNA作为模版，采用和标准品相同的 反应体系和反应条件，进行实时荧光定量PCR检测；
(3)反应结束后，根据所得待测样品反应的Ct值(Y)，带入标准曲线公式 Y＝-3.494X+40.686，可计算得到待测样品中牛棒状杆菌的原始拷贝数的对数(X)， 即得到待测样品中牛棒状杆菌的拷贝数。

说明书牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针
技术领域
本发明涉及生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法和试剂盒，特别是涉及牛棒状杆 菌的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。
背景技术
牛棒状杆菌(Corynebacterium bovis,Cb)属于棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)，棒状杆 菌属(Corynebacterium)，是一种革兰氏阳性棒状杆菌。主要引起奶牛的乳房炎和肾盂肾 炎，在实验动物中，能够感染小鼠和大鼠，特别是裸鼠等免疫缺陷动物。
免疫缺陷动物是重要的动物模型，是研究免疫学、肿瘤学的重要工具。随着免疫缺 陷动物在临床研究中的广泛应用，牛棒状杆菌感染的情况屡见不鲜。感染后会使动物 皮肤出现鳞屑，精神萎靡，严重影响研究的进行。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积 累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技 术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件，构成 PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。实时PCR的设想是由Higuchi于1992年最早 提出[1]。
荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy  transfer，FRET)原理而实现的。当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光 谱重叠，且2个基团距离足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波 长(低能量)的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为 FRET。
实时荧光定量PCR技术的常见机制包括荧光染料检测和水解探针检测。TaqMan 探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为 一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报 告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将 探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧 光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。与普通TaqMan探针法相区别，TaqMan MGB(Minor Groove Binder) 探针法同时将小沟结合物(MGB)连接到探针上，可以将探针的温度提高10℃左右，为了 获得同样的退火温度(Tm值)，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计的更短。不仅降低 了合成的成本，也提高了探针的设计成功率。
目前对牛棒状杆菌仍然缺乏全面系统的研究，当务之急是首先建立该病原菌的快速 检测方法，及时发现，及时采取措施，避免或减少其对科学研究的影响，对保障免疫 学、肿瘤学等动物实验数据的准确、可靠具有极其重要的意义。
发明内容
本发明了用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR引物，以实现牛棒状杆菌的批量检 测，提高检测的灵敏度、特异性和稳定性。
本发明所提供的用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR引物，是根据牛棒状杆菌 16SrRNA V3区基因的保守区域设计的，用以定量检测牛棒状杆菌、动物及相关生物制品中 的牛棒状杆菌核酸拷贝数，所述的牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因具有SEQ ID NO.1所示的 寡核苷酸序列。
具体而言，所述引物中的上游引物优选具有SEQ ID NO.2所示序列的寡核苷酸序列， 下游引物优选具有SEQ ID NO.3所示序列的寡核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR TaqMan MGB 探针，该探针是根据牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域设计的，所述的牛棒状杆菌 16SrRNA V3区基因具有SEQ ID NO.1所示的寡核苷酸序列。
具体而言，本发明所述的TaqMan MGB探针优选具有SEQ ID NO.4所示序列的寡核苷 酸序列，且其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
所述报告荧光基团优选为羧基荧光素(FAM)，所述的荧光淬灭基团优选为NFQ(无荧 光猝灭基团)。
本发明也提供了一种用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括上述 用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR引物和TaqMan MGB探针。
所述试剂盒包括以下用于20μL反应体系的试剂：TaqMan Mix 10μl,上游引物5pmol， 下游引物5pmol，TaqMan MGB探针2.5pmol。
为了方便检测，所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有牛棒状 杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域的质粒，所述阴性对照为不含牛棒状杆菌16SrRNA V3 区基因的保守区域的扩增体系，所述的牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因具有SEQ ID NO.1 所示的寡核苷酸序列。
本发明还提供了上述引物、探针或试剂盒在牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测中的应 用。
具体而言，所述的应用，包括如下步骤：
(1)标准曲线的绘制：以含有牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域的质粒为标 准品，将其进行系列稀释，将所述质粒作为模板，进行实时荧光定量PCR检测，得到用于牛 棒状杆菌检测的标准曲线；
(2)待测样品的检测：以待测样品基因组DNA作为模版，采用和标准品相同的反应体 系和反应条件，进行实时荧光定量PCR检测；
(3)反应结束后，根据标准曲线计算出待测样品中牛棒状杆菌的拷贝数。根据所得待 测样品反应的Ct值(Y)，带入标准曲线公式Y＝-3.494X+40.686，可计算得到待测样品中牛 棒状杆菌的原始拷贝数的对数(X)，即得到待测样品中牛棒状杆菌的拷贝数。
本发明具有以下优点：
1、建立了牛棒状杆菌探针法荧光定量PCR检测方法，利用此检测方法可以对病原微生 物、动物的组织样品及相关生物制品进行牛棒状杆菌核酸的定量检测。
2、本检测方法与牛棒状杆菌的其它常规检测方法如细菌的分离培养及生化鉴定和普通 PCR相比，灵敏度较高，比普通PCR高100倍，特异性更强，与其它常见病原菌DNA病毒 没有交叉反应，检测准确性得到了很大的提高，其操作程序化，并可进一步制成检测试剂盒。
3、本检测方法不仅能够评价动物群体中牛棒状杆菌的感染状况，同时也为牛棒状杆菌 的流行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。
综上所述，本发明能准确的检测出动物群体中牛棒状杆菌的感染情况及相关生物制品中 牛棒状杆菌的存在，对控制牛棒状杆菌的感染，保证动物质量具有重要意义。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为10倍系列稀释质粒标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线
图2为牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR检测的标准曲线
图3为牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测的特异性试验及检测应用结果
图4为牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测的敏感性试验结果
具体实施方式
下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中末注明具体条 件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条 件，或按照制造厂商建议的条件。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体 积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开 的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛 的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。 所用引物及TaqMan MGB探针由美国ABI公司合成，所有序列测定工作均由宝生物工程(大 连)有限公司完成。
实施例1：用于对牛棒状杆菌进行实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan MGB探针的 设计
参照GenBank收录的牛棒状杆菌ATCC 7715的16SrRNA序列(GenBank号:D38575.1)， 借助生物信息软件Vector NTI Advance11对参考菌株进行序列比对，分析并获得牛棒状杆菌 16SrRNA V3区基因的保守区域，即SEQ ID NO.1所示的寡核苷酸序列。采用ABI  PrimerExpress 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成TaqMan MGB探针及引物。 设计出5组供筛选引物对及探针，探针的荧光标记选择FAM(5’端)作为报告发光基团， NFQ(3’端)为淬灭基团。引物和探针由英潍捷基公司提供合成。经过实验对比，确定可用 于牛棒状杆菌Taqman MGB探针法实时荧光定量PCR的引物及探针序列如下：
表1牛棒状杆菌Taqman MGB探针法实时荧光定量PCR的引物及探针

实施例2：牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR检测
一、标准曲线的绘制
1、构建牛棒状杆菌pCR2.1-Cb-V3重组质粒
1.1目的基因－牛棒状杆菌16SrRNA V3区的克隆
1.1.1牛棒状杆菌基因组DNA的提取
以下操作必须严格按照要求在P2实验室负压生物安全柜内进行。
(1)无菌条件下取牛棒状杆菌48h血琼脂培养物悬浮于1.5mL装有200uL无菌PBS 中，浓度调至1个麦氏浊度。
(2)按照基因组DNA提取试剂盒使用说明，提取DNA。基因组DNA提取试剂盒采 用滤膜法的Qiagen试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kit,Cat.No.69504)。粪便DNA提取采用 Qiagen粪便专用试剂盒(QIAamp DNA stool Mini Kit,Cat.No.51504)。
(3)用紫外分光光度仪测定所得牛棒状杆菌基因组DNA浓度(浓度约为20ng/uL)， 立即进行逆转录或置于-20℃保存。
1.1.2牛棒状杆菌16SrRNA-V3区的PCR扩增
PCR的反应体系为50μL，依次加入下列成分：5μL 10×EX Buffer(含Mg2+，TaKaRa HS  Taq，购自宝生物工程(大连)有限公司)、4μL dNTP Mixture(10mM)、1μL正向引物： 5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’(50pmol)、1μL反向引物：5’-CCAGCAGCCGCGGTAAT-3’ (50pmol)、0.25μL HSTaq(5U/μL，购自宝生物工程(大连)有限公司)、1μL DNA、 37.75μL水。
PCR反应条件为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共30个循环。
1.1.3琼脂糖凝胶电泳检测
配制1％琼脂糖凝胶(含5％ExGreen染料)。取PCR扩增产物5μL，与1μL的6× 载样缓冲液混匀，加到凝胶孔格中。电泳缓冲液为1×TAE缓冲液，电泳条件为110V恒压 /30min，凝胶成像系统下拍摄记录电泳结果。结果得到了174bp的目的条带，用Agarose Gel  DNA Purification Kit(琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司)回收并 纯化。
1.2牛棒状杆菌pCR2.1-Cb-V3重组质粒的构建
将牛棒状杆菌16SrRNA-V3基因片段与pCR2.1载体(购自Invitrogen公司)进行连接， 连接反应体系：2×Rapid Ligation Buffer 5μL(宝生物工程(大连)有限公司试剂盒)，pCR2.1 载体0.5μL(浓度50ng/μL)，目的基因4μL(45μg/mL)，T4DNA Ligase 0.5μL(5U/μL)。 然后将连接产物热转化至E.coli Competent Cell JM109中，涂布LB平板，37℃过夜培养。将 选定的含有阳性克隆的单菌落进行培养，提取质粒DNA，用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切 酶进行酶切鉴定并测序。酶切结果获得了174bp的目的条带及3.9kb质粒条带，与预期结果 相符。测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的含目的基因的重组质粒，命名为 pCR2.1-Cb-V3。紫外分光光度法测定OD260nm值用以测定质粒DNA浓度，计算拷贝数， 结果拷贝数为1×1010拷贝/μL，-20℃保存。
2、标准品检测
将pCR2.1-Cb-V3质粒DNA作为模板进行牛棒状杆菌探针法实时荧光定量PCR检测， 建立标准曲线。具体操作如下：将质粒DNA进行10倍系列稀释成1×109拷贝/μL、1×108拷 贝/μL、1×107拷贝/μL、1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL共5个稀释度。每个稀释度重复 平行试验3次。
标准品检测反应体系为20μl，依次加入下列成分：上游引物0.5uL(10μM)，下游引物 0.5uL(10μM)，TaqManb MGB探针0.25μL(10μM)，质粒DNA 1μL，无DNA、RNA 酶水7.75μL，TaqMan Mix(TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016)10μL。
标准品检测反应条件为：先50℃2min；然后95℃10min；最后95℃15s，60℃1min， 共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
10倍系列稀释质粒标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图1所示(A-E分别为质粒标准 品不同拷贝数的荧光曲线，A-E质粒标准品的拷贝数依次分别为1×109拷贝/mL、1×108拷贝 /mL、1×107拷贝/mL、1×106拷贝/mL和1×105拷贝/mL；F为阴性对照)横坐标代表PCR反应循 环数，纵坐标代表荧光信号值。
3、标准曲线的绘制
根据所得CT值(循环阈值)作为纵坐标与其对应的标准品的对数值作为横坐标，绘制 的牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR检测的标准曲线见图2。标准曲线方程为 Y＝-3.494X+40.686标准曲线的可信度R2＝1，实时荧光定量PCR反应的扩增效率为93.306％。 标准曲线显示：本发明建立的牛棒状杆菌探针法实时荧光定量PCR检测方法有9个数量级的 线性检测范围，进一步说明该检测方法具有非常高的灵敏度。
二、牛棒状杆菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR检测动物样品
将284份小鼠、64份大鼠、106份豚鼠、20份沙鼠、20份灰仓鼠、61份树鼩等实验动 物的气管或粪便DNA作为检测对象，进行牛棒状杆菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量 PCR检测。每份样本重复平行试验3次。
临床样本检测体系为20μL，依次加入下列成分：上游引物0.5μL(10μM)，下游引物 0.5μL(10μM)，TaqMan MGB探针0.25μL(10μM)，样品DNA 1μL，无DNA、RNA酶 水7.75μL，TaqMan Mix 10μL。
检测反应条件为：50℃2min，95℃10min各1个循环；然后95℃15s，60℃1min， 共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测的特异性试验及检测应用结果如图3所示：(A-E分 别为质粒标准品不同拷贝数的荧光曲线，A-E质粒标准品的拷贝数依次分别为1×108拷贝/ mL、1×107拷贝/mL、1×106拷贝/mL、1×105拷贝/mL和1×104拷贝/mL；F为牛棒状 杆菌阳性对照扩增荧光曲线；G、H为小鼠阳性扩增荧光曲线；I为阴性对照及47株参考菌 株的扩增荧光曲线)横坐标代表PCR反应循环数，纵坐标代表荧光信号值。结果显示：两只 小鼠的粪便DNA为模板出现了目的荧光扩增曲线，而以水空白为模板没有出现目的荧光扩 增曲线。用普通PCR方法没有检出。普通PCR具体方法为20uL反应体系：2uL10×Buffer， 1.6uL各2.5mM dNTP，10μM上游引物5’-ATGCCGTCGTCCTTGTTGAT-3’0.5μL，10μM下 游引物5’-CCATGTACCAGGCGATCCTC-3’0.5μL，TaqDNA聚合酶1U，样品DNA 1μL， 补水至20uL。PCR扩增条件为：95℃预变性1min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72 ℃延伸30sec，共35个循环；最后延伸7min。结果表明：实时荧光定量PCR的敏感性要高 于普通PCR。证明了在实验小鼠中确实存在牛棒状杆菌的感染，但感染比例极少，细菌含量 很低。
试验一、牛棒状杆菌Taqman MGB探针法实时荧光定量PCR检测方法的特异性
设定水空白对照，以鼠棒状杆菌菌(ATCC65013)、沙门氏菌(ATCC47001、50041、 50047、50071、50093、50094、50115、CVCC533)、宋内氏志贺菌(CMCC51082)、痢疾 志贺氏菌(CMCC51252)、假结核耶尔森氏菌(CMCC53501)、小肠结肠炎耶尔森氏菌 (CMCC52301)、大肠杆菌(CMCC44711、CMCC44110)、枸橼酸杆菌(ATCC BAA352)、 肺炎克雷伯杆菌(CMCC46108)、绿脓杆菌(ATCC27853，ATCC47085)、粪链球菌 (CMCC32218)、变形杆菌(CMCC49101)、粪产碱杆菌(ATCC8750)、金黄色葡萄球 菌(CMCC26001)、多杀巴斯德杆菌(ATCC43137)、嗜肺巴斯德杆菌(ATCC 12555、 ATCC35149)、流感嗜血杆菌(ATCC33391)、小鼠放线杆菌(ATCC49577)、支气管鲍 特杆菌(CMCC58401、ATCC19395)、念珠状链杆菌(ATCC14647)、空肠弯曲菌(ATCC33560)、 幽门螺旋杆菌(NCTC11637)、肺炎链球菌(CMCC36001)、乙型溶血性链球菌(CMCC31210、 CMCC32210)、单核增生性李斯特杆菌(CMCC54004)、白色念珠菌(ATCC10231)、枯 草芽孢杆菌(ATCC9372)、蜡样芽胞杆菌(CMCC63301)、泰泽病原体(RJ株)、支原体 (ATCC15531、ATCC23714)、石膏样小孢子菌(ATCC13994)、石膏样毛癣菌(ATCC20010)、 犬小孢子菌(ATCC201851)、猴类毛癣菌(ATCC16447)等47株参考菌株的DNA作为模 板进行实时荧光定量PCR检测，评价反应系统的特异性。反应体系及反应条件与实施例2 相同。每份样本重复平行试验3次。
结果如图3所示。结果显示：用牛棒状杆菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR检 测水及47株参考菌株DNA，均无荧光信号产生，结果为阴性。结果说明：本发明用于对牛 棒状杆菌进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan MGB探针的特异性良好，定量反应 体系特异性良好。
试验二、牛棒状杆菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR检测方法的敏感性
将牛棒状杆菌质粒标准品10倍系列稀释成1×109拷贝/mL、1×108拷贝/mL、1×107拷贝 /mL、1×106拷贝/mL、1×105拷贝/mL、1×104拷贝/mL、1×103拷贝/mL、1×102拷贝/mL、10 拷贝/mL和1拷贝/mL共10个稀释度，以无菌水为阴性对照，将质粒作为模板进行探针法实 时荧光定量PCR检测，评价本发明反应系统的敏感性。
探针法实时荧光定量PCR检测敏感性扩增曲线如图4所示：A-H分别为质粒标准品 1×109～1稀释度的荧光扩增曲线，I为阴性对照。横坐标代表PCR反应循环数，纵坐标代表 荧光信号值，结果显示：10拷贝/mL浓度的标准品仍能扩增，产生荧光信号。结果说明：本 发明用于对牛棒状杆菌进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan MGB探针的敏感性良 好，定量反应体系敏感性良好。
试验三、牛棒状杆菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR检测方法的稳定性
对标准品1x107拷贝，1x106拷贝，1x105拷贝，1x104拷贝，1x103拷贝，1x102拷贝和10 拷贝等7个稀释度同时重复3次荧光定量PCR，所得Ct值计算变异系数(CV％)，具体分 析结果见表2。组内变异系数CV％为0.08～1.72，组间为1.08～5.06，稳定性良好。
表2牛棒状杆菌RTFQ-PCR检测方法的稳定性

实施例3、牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的制备
将用于对牛棒状杆菌进行实时荧光定量PCR检测的引物Cb-F(10μM)55μL、Cb-R (10μM)55μL和TaqMan MGB探针(10μM)30μL以及TaqMan@Gene Expression Master  Mix 510μL、牛棒状杆菌pCR2.1-Cb-V3重组质粒(1ng/μL)5μL、灭菌双蒸水0.8mL共同包 装，得到牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR100检测试剂盒(100次，每次20μL反应体系)。