抗病毒和抗肿瘤的含CpG单链脱氧寡核苷酸 【发明领域】
本发明涉及数种含CpG单链脱氧寡核苷酸，特别是涉及对肿瘤性疾病和病毒感染性病疾具有治疗作用的含CpG单链脱氧寡核苷酸，以及这些含CpG单链脱氧寡核苷酸用于制备治疗肿瘤性疾病和病毒感染性疾病的药物的用途。
【发明背景】
100多年前，Coley在世界上第一个开展了应用细菌提取物治疗细菌感染性疾病的实验，他得出结论：细菌的提取物是一种可以用于治疗传染性疾病的制剂。
1984年，Tokunaga T等发现从卡介苗(BCG)提取的DNA能抑制多种动物肿瘤的生长，具有激活人外周血单个核细胞和小鼠脾脏天然杀伤(NK)细胞的活性，诱导干扰素(IFN)的产生。非脊椎动物的DNA有上述功能，脊椎动物和植物的DNA则不然，这些功能依赖于DNA分子中CpG结构(Tokunaga T，Antitumor activity of deoxyribonucleic acidfraction from Mycobacterium bovis BCG.I.Isolation，physicochemicalcharacterization，and antitumor activity，JNCI，72：955.1984)。
CpG是由胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接成的二核苷酸。C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，p代表磷酸，胞嘧啶位于5’端。多种具有CpG结构的细菌和病毒DNA对脊椎动物的免疫系统均为危险的信号，可激活多种免疫细胞启动对细菌和病毒的抵抗机制。近年来的研究表明，人工合成的含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA(CpG ODN)也可表现强效的免疫增强和免疫调节作用。CpG ODN可强力增强B细胞、T细胞、NK细胞、抗原提呈细胞(单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)和中性粒细胞的功能，表现出明显地临床应用前景(Weiner GJ，Theimmunobiology and clinical potential of immunostimulatory CpGoligodeoxynucleotides.J Leukoc Biol 2000 Oct；68(4)：455-63)。
由于序列，尤其是CpG两侧的序列的不同，CpG ODN可有多种多样的形式，表现不同性质、不同强度的免疫增强和免疫调节作用。有些CpG ODN可表现出种属依赖性，即对一种动物表现免疫增强功能的CpGODN，在另一种动物或人则未必表现出同样的或等效的免疫增强功能(Kamstrup S，et al.Response of porcine peripheral blood mononuclear cellsto CpG-containing oligodeoxynucleotides，Vet Microbiol 2001 Feb 26；78(4)352-62；Gunther Hartmann，et al.Delineation of a CpG PhosphorothioateOligodeoxynucleotide for Activating Primate Immune Responses In Vitro and InVivol The Journal of Immunology，2000，164：1617-1624)。
CpG-DNA具有广泛的免疫调节作用。CpG-DNA作用于TLR-9，对巨噬细胞、树突状细胞和B细胞有很强的刺激作用。CpG是细菌感染引起炎症的重要因子。原发小胶质细胞表达TLR-9 mRNA.在体外CpG-DNA激活小胶质细胞产生TNF-α，IL-12p40，IL-12p70和NO.此外，还可上调MHC II类分子，使B7-1，B7-2和CD40分子上调，吞噬活性增强。脑室内注射CpG-DNA，刺激小胶质细胞表达TNF-α和IL-12p40 tmRNA(Alexander H.Dalpke et al.Immunostimulatory CpG-DNA Activates MurineMicroglia1 The Journal of Immunology，2002，168：4854-4863)。
PDC和B细胞(而非单核细胞(monocytes))，NK细胞或T细胞是外周血CpG ODN的靶细胞。TLR9是PDC和B细胞识别CpG ODN的受体(Veit Hornung，et al.Quantitative Expression of Toll-Like Receptor 1-10 mRNA in Cellular Subsets of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells andSensitivity to CpG Oligodeoxynucleotides1 The Journal of Immunology，2002，168：4531-4537)。
在人的外周血单个核细胞中有天然杀伤细胞(NK)。NK是一类无吞噬作用的非粘附性细胞，胞质内有许多嗜苯胺颗粒，是一种起源于骨髓的大颗粒淋巴细胞。具有广谱的抗肿瘤作用，能杀伤同系、同种及异种的肿瘤细胞，尤其对淋巴瘤和白血病最为有效。
干扰素(interferon，IFN)是最先发现的细胞因子。I型干扰素是一种重要的抗病毒细胞因子。受到病毒感染的细胞可合成和分泌IFN，这些IFN可刺激邻近的细胞合成抑制RNA及DNA病毒复制的酶类使其进入抗病毒状态，从而使这些细胞受到保护。
【发明内容】
发明概述
本发明的目的之一是提供系列含CpG单链脱氧核苷酸，特别是刺激人天然杀伤细胞活性和诱生α干扰素的含CpG单链脱氧核苷酸。它们由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成，其磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
优选地，本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有SEQ ID NO：1-95所示的序列。
本发明的目的之二是提供本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸用于制备治疗肿瘤性疾病和病毒感染性疾病的药物的用途。
另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是可以直接推知的。
【具体实施方式】
在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义：
优选地，本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有如下所示的序列：
101 5’-TcgTCgAgggCgCCggTgAC-3’
102 5’-TCgTCgCCggTgggggTgTg-3’
103 5’-TCgTCgTACgCAATTgTCTT-3’
104 5’-TCgCCTCgTCgCCTTCgAgC-3’
201 5’-TCgCCCACCggTgggggggg-3’
202 5’-TCgTCgCAgACCggTCTgggg-3’
203 5’-gggggACgTCgCCggggggg-3’
204 5’-ggATCCgTACgCATgggggg-3’
205 5’-TCgTCgCggCCggCgCCCCC-3’
206 5’-TCgTCgCggCCgCgAggggg-3’
301 5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’
302 5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’
303 5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’
304 5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’
305 5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’
306 5’-ACCggTATCgATgCCggTgggggg-3’
307 5’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’
308 5’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’
309 5’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’
310 5’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’
311 5’-TATCgATgTTTTCgTCgTCgTTgggggg-3’
312 5’-TTCgTTgCATCgATgCATCgTTgggggg-3’
313 5’-TTCgCTTCgCTTTTCgCTTCgCTT-3’
601 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’
602 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’
603 5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’
604 5’-ACCgCCAAggAgAAgCCgCAggAggg-3’
605 5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’
606 5’-TACAACggCgAggAATACC-3 ’
607 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’
608 5’-gTACAACggCgAggAATACCT-3’
609 5’-ACCgTCgTTgCCgTCggCCC-3’
610 5’-TgCTggCCgTCgTT-3’
611 5’-gTCggCACgCgACg-3’
612 5’-gTCggCACgCgACgggggg-3’
613 5’-gTCggCACgCgACgCCCCCC-3’
614 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’
615 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’
616 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’
617 5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’
618 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’
619 5’-TCgTTgCCgTCgg-3’
620 5’-TCgTTgCCgTCggg-3’
621 5’-TCgTTgCCgTCgggg-3’
622 5’-TCgTTgCCgTCggggg-3’
623 5’-TCgTTgCCgTCgggggg-3’
624 5’-TCgTTgCCgTCggggggg-3’
625 5’-TCgTTgCCgTCgggggggg-3’
626 5’-TCgTTgCCgTCggggggggg-3’
627 5’-TCgAggACAAgATTCTCgT-3’
628 5’-TCCCgCTggACgTT-3’
629 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTT-3’
631 5’-TCgTCgCgCCgTCACgggggg-3’
632 5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’
633 5’-TCgTCgCCgTTgggCggg-3’
634 5’-TCgTCgACgTCgTTgggCggg-3’
635 5’-TCgCAgTTgTCgTAACgTTgggCggg-3’
636 5’-TTACCggTTAACgTTggCCggCC-3’
637 5’-ACCggTTAACgTTgTCCCCgggg-3’
638 5’-TCgTCgTTggTATgTT-3’
639 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’
640 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3’
641 5’-TCgTTCggggTgCCg-3’
642 5’-TCgTTCggggTAACgATT-3’
643 5’-TCgTTCggggTAACgTT-3’
644 5’-TCgTTCggggTACCgAT-3’
645 5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’
646 5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’
647 5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’
648 5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’
649 5’-CgTTgACgATCgTCCCATggCggg-3’
650 5’-TCTgCggCCTTCgTCg-3’
651 5’-TAgTAACCggTCCggCgCCCCC-3’
652 5’-TTgCAgCgCTgCCggTggg-3’
653 5’-TCgTACggCCgCCgTACggCggg-3’
654 5’-CggCCCATCgAgggCgACggC-3’
655 5’-TCgCgTCgACTCCCCTCgAgggg-3’
656 5’-TCgTCgTCgACTCgTggTCggggg-3’
657 5’-TCgggCgCCCgATCgggggg-3’
658 5’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’
659 5’-TCgTgACgTCCTCgAgTT-3’
660 5’-ggACgATCgATCgTgggggg-3’
661 5’-gggATgCATCgATgCATCgggggg-3’
662 5’-gggggAATCgATTCgggggg-3’
663 5’-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3’
664 5’-TCgTCgggTgCATCgATgCAgggggg-3’
665 5’-ggTgCATCgTACgATgCAgggggg-3’
666 5’-gggACgTACgTCgggggg-3’
667 5’-TCggggACgATCgTCgggggg-3’
668 5’-gggggATCgATATCgATCgggggg-3’
669 5’-gggggATCgACgTCgATCgggggg-3’
670 5’-ggTgCATCgATCgATgCAgggggg-3’
671 5’-ggATCgATCgATCgATgggggg-3’
672 5’-ggCgATCgATCgATCggggggg-3’
673 5’-ggggTCgATCgATCgAgggggg-3’
674 5’-ggTgCgATCgATCgCAgggggg-3’
675 5’-ggTCgCgATCgCgAgggggg-3’
676 5’-TCgTCTTTCgACTCgTTCTC-3’
677 5’-TCgTCgTTTTgCgTTCTC-3’
678 5’-TCATCgACTCTCgAgCgTTC-3’
679 5’-ATCgTCgACTCTCgTgTTCTC-3’
680 5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’
681 5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’
682 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’
683 5’-TCgTTCTCgACTCgTTCTC-3’
684 5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’
685 5’-TCgTCgACgTCgTTCgTTCTC-3’
其中的磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
本发明的CpG单链脱氧核苷酸可通过已知的方法生产，例如采用固相亚磷酰胺三酯法进行生产。以下的实施例详细地例举了一种生产本发明的CpG单链脱氧核苷酸的方法。
在这些含CpG单链脱氧寡核苷酸用于制备用于制备治疗肿瘤性疾病和病毒感染性疾病的药物的用途中，与治疗肿瘤性疾病和病毒感染性疾病的药物的使用量的比例为1∶1-100∶1(摩尔比)。
本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸的使用方式包括单独应用、两种或两种以上的CpG单链脱氧寡核苷酸联合应用、与治疗肿瘤性疾病和病毒感染性疾病的药物混合使用，与治疗肿瘤性疾病和病毒感染性疾病的药物通过交联剂共价偶联使用；
应用方式包括皮下应用、鼻腔粘膜应用、肌肉应用、胃肠应用、腹腔应用、静脉注射等常用的方式。
CpG单链脱氧寡核苷酸使用时间可在使用治疗肿瘤性疾病和病毒感染性疾病的药物之前应用、与治疗肿瘤性疾病和病毒感染性疾病的药物同时应用、在治疗肿瘤性疾病和病毒感染性疾病的药物后应用。
在小鼠试验中CpG单链脱氧寡核苷酸的使用量为0-500微克/小鼠，如进行人体试验则按标准的换算方法进行换算。
下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例
在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如合成采用固相亚磷酰胺三酯法。
在如下实施例中，所用试剂的来源、商品名和/或有必要列出其组成成分者，均只标明一次。在其后所用相同试剂如无特殊说明，不在赘述上述内容。
实施例1CpG单链脱氧核苷酸的制备(上海生工合成)
合成采用固相亚磷酰胺三酯法，合成方法(上海生工提供)如下：
材料和方法：
三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)、可控多孔玻璃(ControlledPore Glass)、DMT(二甲氧基三苯甲基)、四氮唑活化剂、乙酸酐、N-甲基咪唑、ABI DNA合成仪、高效液相色谱层析仪等。
A、T、C、G四种核苷酸单体：合成所用单体为核苷亚磷酰胺，是经过化学修饰的核苷酸，含下面几个功能基团：
1.3’位P上二异丙胺基，缩合所用的功能基
2.3’位P上晴乙基，保护基，合成完毕后脱去。
3.5’-Dmt，保护基，缩合前脱去。
4.A和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去。
5.G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基，合成完毕后脱去。
具体的反应步骤如下：
一、脱保护基
用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团二甲氧基三苯甲基(DMT)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应。
二、活化
将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与可控多孔玻璃上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
三、连接
亚磷酰胺四唑活性中间体遇到可控多孔玻璃上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
四、封闭
缩合反应后为了防止连在可控多孔玻璃上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化
缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在可控多孔玻璃上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到可控多孔玻璃的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
未硫化的CpG单链脱氧寡核苷酸在ABI 3900 DNA合成仪上合成(上海生工生物技术服务有限公司)，全硫化及部分硫化CpG单链脱氧寡核苷酸的合成采用置换法，在ABI 394 DNA合成仪上合成(上海生工生物技术服务有限公司)。
实施例2人外周血单个核细胞杀伤人白血病细胞(K562细胞)
一、K562细胞的培养
试剂和材料：
K562细胞：为人的白血病细胞株(美国ATCC CCL-243)。细胞培养常用的仪器设备：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管等。
RPMI1640培养液：
含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克
碳酸氢钠 2.0克
庆大霉素 10万单位
加三蒸水至体积1000毫升
0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活：小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640：
灭活的小牛血清 10毫升
RPMT 1640培养液 90毫升
冻存液的配制：200微升小牛血清，100微升二甲基亚砜(DMSO)，700微升无血清RPMI1640培养基。
方法：
1.K562细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存的K562细胞，37℃水浴迅速融化，加5毫升RPMI1640培养液稀释，水平离心机以1,000Xg离心3min，弃上清，加入10％小牛血清的RPMI1640 2毫升，滴管吹打均匀，转移至50毫升培养瓶中，补加RPMI1640培养液至终体积5毫升。
2.K562细胞的培养：带10％小牛血清的RPMI1640作为培养基，50毫升细胞培养瓶，37℃ 5％二氧化碳孵箱培养。
3.K562细胞的传代：生长至一定密度的K562细胞，滴管轻轻吹打均匀，转移至10毫升离心管中，水平离心机以1,000Xg离心力离心3min，弃上清，加入10％小牛血清的RPMI1640 2毫升，滴管吹打均匀，分别转移到两个50毫升培养瓶中，分别补加培养液至终体积5毫升，37℃5％二氧化碳孵箱培养。
4.K562细胞的冻存：生长良好的细胞，滴管轻轻吹打均匀，转移至10毫升离心管中，水平离心机以1,000Xg离心力离心3min，弃上清，冻存液1毫升，滴管轻轻吹打均匀，转移至冻存管中，梯度降温(降温1℃/1-2h)，降至-70℃左右，然后，转移到液氮罐中。
二、人外周血单个核细胞的分离
1、试剂和材料：
肝素抗凝的人全血：长春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺：比重1.077±0.001，北京鼎国生物技术有限公司。
细胞培养常用的仪器设备：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。
RPMI1640培养液：
含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克
碳酸氢钠 2.0克
庆大霉素 10万单位
加三蒸水至体积1000毫升
0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活：小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640：
灭活的小牛血清 10毫升
RPMI 1640培养液 90毫升
Hank’s液(无钙离子、镁离子)的配制：
氯化钠 8.0克
氯化钾 0.4克
磷酸氢二钠(带一个结晶水) 0.06克
磷酸二氢钾 0.06克
碳酸氢钠 0.35克
葡萄糖 1.0克
酚红 0.02克
加入双蒸水至1000毫升。
将上列成分混合后溶化，8磅15min灭菌，4℃冰箱保存。临用时用7.4％NaHCO3调pH至7.3～7.6。
2％台酚兰染色液：
台酚兰 2克
生理盐水 100毫升
2、方法：
肝素抗凝的人外周血缓慢沿管壁缓慢加于比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液面上，分离液与外周血的比例约为2∶1。
水平离心机离心1,000xg 15-20min，离心后管内分为3层，用吸管吸取白色云雾层狭窄带，置入另一管中。
加入等倍或以上体积的Hank’s液(无血清)，800-1,000xg 10-15min，弃上清，加入Hank’s液，洗涤细胞两次。
末次离心后，弃上清，加入培养基2ml，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板计数四个大方格内的细胞总数，单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。
三、K562细胞的标记
试剂和材料：
细胞培养常用的仪器设备：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管等。
放射性同位素：镉51(51Cr)(美国PerkinElmer公司)
γ射线计数器(美国Beckman公司)、同位素标记管
RPMI1640培养液：
含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克
碳酸氢钠 2.0克
庆大霉素 10万单位
加三蒸水至体积1000毫升
0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活：小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640：
灭活的小牛血清 10毫升
RPMI 1640培养液 90毫升
方法：
1.取生长良好的K562细胞，吸管吹打均匀后吸到10毫升离心管中，水平离心机以800Xg离心力离心5min，弃上清，加入1毫升培养基，吸管吹打均匀，取少量计数，调节细胞浓度为1×107个/毫升。
2.吸取100微升(1×106个细胞)放入塑料管中，加入100微升放射性同位素镉51。
3.放入37℃ 5％二氧化碳孵箱中培养1h，每隔5-8min混匀一次。
4.用10％小牛血清的RPMI1640洗涤三次，然后10％小牛血清的RPMI1640重悬细胞。
四、杀伤K562细胞的实验
试剂和材料：
细胞培养常用的仪器设备：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管等。
RPMI1640培养液：
含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克
碳酸氢钠 2.0克
庆大霉素 10万单位
加三蒸水至体积1000毫升
0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活：小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640：
灭活的小牛血清 10毫升
RPMI 1640培养液 90毫升
TE缓冲液：10毫摩尔Tris，1毫摩尔EDTA，盐酸调节pH值7.0。1摩尔/升的盐酸：盐酸10毫升，加三蒸水至终体积100毫升
方法：
1.用10％小牛血清的RPMI1640培养基调节人外周血单个核细胞至终浓度为2×106个/毫升，96孔板每孔加入100微升，即每孔细胞数为2×105个。
2.加入用TE缓冲液稀释的CpG单链脱氧核苷酸至每孔终浓度120微克/毫升，每种CpG单链脱氧核苷酸三个复孔，设一不加CpG单链脱氧核苷酸的对照孔。
3.设最大释放孔6复孔，最大释放组每孔加100微升1摩尔/升的盐酸，自发释放孔6复孔，每孔加100微升10％小牛血清的RPMI1640培养基，混匀。
4.37℃ 5％二氧化碳孵箱中培养至18h。取标记好的K562细胞，用10％小牛血清的RPMI1640培养基调节细胞浓度至1×105个/毫升。
5.在96孔板中每孔加100微升，设最大释放组和自发释放组，37℃5％二氧化碳孵箱中培养4h。
6.水平离心机1,000Xg离心5min每孔取上清150微升，加入塑闪瓶中，再加3-5毫升液闪液，测量CPM值。
7.计算杀伤率：杀伤率＝(实验组CPM值-自发释放组CPM值)/(最大释放组CPM值-自发释放组CPM值)×100％
实验结果(见下表)表明，CpG ODN对人外周血单个核细胞杀伤K562细胞用明显的刺激作用。
第一组实验的结果：
序列号 CpG单链脱氧核苷酸结构 杀伤率(％)
对照孔 无 17.5
301 5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’ 42.1
302 5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’ 41.2
303 5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’ 46.8
304 5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’ 35.7
305 5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’ 43.1
306 5’-ACCggTATCgATgCCggTgggggg-3’ 55.6
307 5’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’ 27.8
308 5’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’ 35.8
309 5’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’ 33.4
310 5’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’ 48.1
311 5’-TATCgATgTTTTCgTCgTCgTTgggggg-3’ 46.0
312 5’-TTCgTTgCATCgATgCATCgTTgggggg-3’ 28.2
313 5’-TTCgCTTCgCTTTTCgCTTCgCTT-3’ 27.8
序列号 CpG单链脱氧核苷酸结构 杀伤率(％)
601 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’ 60.1
602 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’ 21.7
603 5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’ 77
604 5’-ACCgCCAAggAgAAgCCgCAggAggg-3’ 81
605 5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’ 103
606 5’-TACAACggCgAggAATACC-3’ 78
607 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’ 91
608 5’-gTACAACggCgAggAATACCT-3’ 99
609 5’-ACCgTCgTTgCCgTCggCCC-3’ 88
610 5’-TgCTggCCgTCgTT-3’ 73
611 5’-gTCggCACgCgACg-3’ 76
612 5’-gTCggCACgCgACgggggg-3’ 61
613 5’-gTCggCACgCgACgCCCCCC-3’ 51
614 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’ 45
615 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’ 68
616 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’ 110
617 5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’ 94.5
618 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’ 65.5
619 5’-TCgTTgCCgTCgg-3’ 65.8
620 5’-TCgTTgCCgTCggg-3’ 90.8
621 5’-TCgTTgCCgTCgggg-3’ 72.3
622 5’-TCgTTgCCgTCggggg-3’ 36.1
623 5’-TCgTTgCCgTCgggggg-3’ 68.1
624 5’-TCgTTgCCgTCggggggg-3’ 77.3
625 5’-TCgTTgCCgTCgggggggg-3’ 79.3
626 5’-TCgTTgCCgTCggggggggg-3’ 46.7
627 5’-TCgAggACAAgATTCTCgT-3’ 38.3
628 5’-TCCCgCTggACgTT-3’ 62.3
629 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTT-3’ 67.5
序列号 CpG单链脱氧核苷酸结构 杀伤率(％)
631 5’-TCgTCgCgCCgTCACgggggg-3’ 53.2
632 5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’ 67.2
633 5’-TCgTCgCCgTTgggCggg-3’ 86.6
634 5’-TCgTCgACgTCgTTgggCggg-3’ 67.4
635 5’-TCgCAgTTgTCgTAACgTTgggCggg-3’ 62.4
636 5’-TTACCggTTAACgTTggCCggCC-3’ 61.9
637 5’-ACCggTTAACgTTgTCCCCgggg-3’ 64.2
638 5’-TCgTCgTTggTATgTT-3’ 65.2
639 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT -3’ 66.7
640 5 ’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3 ’ 71.1
641 5’-TCgTTCggggTgCCg-3’ 63.4
642 5 ’-TCgTTCggggTAACgATT-3 ’ 66.3
643 5’-TCgTTCggggTAACgTT-3’ 57.9
644 5’-TCgTTCggggTACCgAT -3’ 61.3
645 5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’ 72.5
646 5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’ 74.5
647 5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’ 70.2
648 5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’ 65.8
649 5’-CgTTgACgATCgTCCCATggCggg-3’ 57.9
650 5’-TCTgCggCCTTCgTCg-3’ 72.4
651 5’-TAgTAACCggTCCggCgCCCCC-3’ 66.3
652 5 ’-TTgCAgCgCTgCCggTggg-3 ’ 78.6
653 5’-TCgTACggCCgCCgTACggCggg-3’ 88.1
654 5’-CggCCCATCgAgggCgACggC-3’ 81.8
655 5’-TCgCgTCgACTCCCCTCgAgggg-3’ 65.8
656 5’-TCgTCgTCgACTCgTggTCggggg-3’ 77
657 5’-TCgggCgCCCgATCgggggg-3 ’ 63.3
658 5’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’ 76.6
659 5 ’-TCgTgACgTCCTCgAgTT-3 ’ 80.9
第二组实验的结果：编号序列杀伤率(％) TE对照组56.834 660 5’-ggACgATCgATCgTgggggg-3’68.792 661 5’-gggATgCATCgATgCATCgggggg-3’74.831 662 5’-gggggAATCgATTCgggggg-3’66.534
663 5’-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3’64.597 664 5’-TCgTCgggTgCATCgATgCAgggggg-3’73.803 665 5’-ggTgCATCgTACgATgCAgggggg-3’69.429 666 5’-gggACgTACgTCgggggg-3’71.594 667 5’-TCggggACgATCgTCgggggg-3’67.024 668 5’-gggggATCgATATCgATCgggggg-3’75.312 669 5’-gggggATCgACgTCgATCgggggg-3’70.107 670 5’-ggTgCATCgATCgATgCAgggggg-3’72.119 671 5’-ggATCgATCgATCgATgggggg-3’70.107 672 5’-ggCgATCgATCgATCggggggg-3’65.745 673 5’-ggggTCgATCgATCgAgggggg-3’76.536 674 5’-ggTgCgATCgATCgCAgggggg-3’70.741 675 5’-ggTCgCgATCgCgAgggggg-3’77.805
实施例3CpG ODN刺激产生人干扰素(HIFNα)
本实验采用PBL Biomedical Laboratories检测人IFNα试剂盒(批号：1755)进行。
一.人外周血单个核细胞的分离
1、试剂和材料：
肝素抗凝的人全血：长春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺：比重1.077±0.001，北京鼎国生物技术有限公司。
细胞培养常用的仪器设备：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。
RPMI1640培养液：
含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克
碳酸氢钠 2.0克
庆大霉素 10万单位
加三蒸水至体积1000毫升
0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活：小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640：
灭活的小牛血清 10毫升
RPMI 1640培养液 90毫升
Hank’s液(无钙离子、镁离子)的配制：
氯化钠 8.0克
氯化钾 0.4克
磷酸氢二钠(带一个结晶水) 0.06克
磷酸二氢钾 0.06克
碳酸氢钠 0.35克
葡萄糖 1.0克
酚红 0.02克
加入双蒸水至1000毫升。
将上列成分混合后溶化，8磅15min灭菌，4℃冰箱保存。临用时用7.4％NaHCO3调pH至7.3～7.6。
2％台酚兰染色液：
台酚兰 2克
生理盐水 100毫升
2、方法：
肝素抗凝的人外周血缓慢沿管壁缓慢加于比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液面上，分离液与外周血的比例约为2∶1。
水平离心机离心1,000xg 15-20min，离心后管内分为3层，用吸管吸取白色云雾层狭窄带，置入另一管中。
加入等倍或以上体积的Hank’s液(无血清)，800-1,000xg 10-15min，弃上清，加入Hank’s液，洗涤细胞两次。
末次离心后，弃上清，加入培养基2ml，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板计数四个大方格内的细胞总数，单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。人外周血单个核细胞的分离
二.人干扰素(HIFNα)的检测
试剂和材料：
细胞培养常用的仪器设备：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管等。
RPMI1640培养液：
含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克
碳酸氢钠 2.0克
庆大霉素 10万单位
加三蒸水至体积1000毫升
0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活：小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640：
灭活的小牛血清 10毫升
RPMI 1640培养液 90毫升
24孔板(平底)(Costar)。
方法：
1.用10％小牛血清的RPMI1640培养基调节人外周血单个核细胞至终浓度为2×106个/毫升。
2.24孔板每孔加入1000微升，即每孔细胞数为2×106个。加入用TE缓冲液稀释的CpG单链脱氧核苷酸至每孔终浓度6微克/毫升。
3.37℃ 5％二氧化碳孵箱中培养至24小时，收上清200微升。
4.继续培养24小时，收上清200微升。
5.采用PBL Biomedical Laboratories检测人IFNα试剂盒(批号：1755)进行IFNα的检测。
HIFNα的检测
试剂准备：A瓶：浓缩洗液(50ml)
B(小)瓶：HIFNα标准品(1.5ml)
C瓶：稀释缓冲液(50ml)
D(小)瓶：抗体浓缩液(0.25ml)
E(小)瓶：辣根过氧化物酶试剂(HRP)浓缩液(20μl)
F瓶：辣根过氧化物酶试剂(HRP)稀释液(25ml)
G瓶：辣根过氧化物酶底物反应液(TMB)(25ml)
H瓶：终止液(25ml)
步骤：
(1)配制稀释洗液(工作液)
A(瓶)液 50ml
双蒸水加到 1000ml 即成工作洗液
此工作洗液配制后应存放与4℃冰箱中，用前须充分混匀。冲洗步骤均应在室温(24℃)下用冷洗液(2-6℃)进行冲洗。
(2)绘制标准曲线
系列稀释HIFNα标准品：HIFNα标准品(小瓶B，1.5ml)加稀释缓冲液(C瓶)，使之配成0-500pg/ml(高敏度)或0-5000pg/ml(广范围)系列稀释液。所提供的样品曲线谨供参考。
方法：标记7个聚丙烯小管(分别为S6-S1以及BK)，所有稀释步骤均在其中进行，枪头须每次更换。干扰素浓度待测的样品亦须用同样方法稀释。
(3)设计并确定96孔微量板上测试样品所需孔数：建议选16个孔用于HIFNα标准品。其中空白对照(BK，只加缓冲液BK)4个孔，HIFNα标准品(S6-S1)12个孔(各二复孔)。另选16个孔用于干扰素浓度待测的样品。去掉多余的微量板条块，封于锡箔袋内置冰箱(2-6℃)待用。
(4)精确汲取100μl步骤(2)中配制的HIFNα标准品稀释液及待测的样品稀释液，加入到选定的微量板各复孔中(包括标准品和待测的样品)。
(5)加盖，室温(24℃)下孵育1h.避免干燥及其他温度的影响。
(6)此间，可配制抗体溶液，以便在步骤(8)中使用。为了避免丢失，可先将抗体浓缩液(小瓶D)离心几秒钟，使液体集中于瓶底。
方法：
(高敏感度)抗体浓缩液(小瓶D) 6.7μl
或(广范围)抗体浓缩液(小瓶D) 2.2μl
加稀释缓冲液(C瓶) 1ml
此量为单排孔用量。复排用量倍增。
(7)孵育后，去掉孔内液体，用步骤(1)中配制的工作洗液冲洗每个孔一次。冲洗时每孔应充满。最好使用自动冲洗器(如NuncImmunowasher)，尽量不用手工操纵的移液器冲洗。冲洗后将微量板翻转，置于脱纤维吸水纸上，轻轻叩打，令其干燥。样品中如含有害物质，须采取防护措施。
(8)冲洗后，每孔加100μl步骤(6)中所配制的抗体溶液，加盖，室温下孵育1h.。
(9)在此孵育期间，配制浓缩的HRP溶液，以便下一步步骤(10)使用。为了避免丢失，可先将小瓶E离心几秒钟，使液体集中于瓶底。具体配制方法如下：
HRP原液(小瓶E) 20μl
加入HRP稀释液(F瓶) 140μl
轻轻混匀，必要时可再次离心。此即浓缩的HRP溶液。
(10)配制HRP稀释液：
取步骤(9)中所配制的浓缩的HRP溶液1μl
(如为高敏)加入(F瓶)HRP稀释液1ml即成(高敏)稀释液
(如为广范围)则需将HRP浓缩液进一步稀释。
将经步骤(9)稀释的HRP溶液存放于-70℃待用，未经稀释的HRP浓缩液则放在4℃冰箱中。
(11)孵育后，去掉微量板孔内液体，用步骤(1)中配制的工作洗液冲洗，每个孔洗3次，同步骤(7)。洗后，将微量板翻转，置于脱纤维吸水纸上，轻轻叩打，令其干燥。样品中如含有害物质，须采取防护措施。
(12)每孔加入稀释的HRP溶液100μl，封盖，室温孵育1h。
(13)室温下(24℃)预温TMB底物溶液(G瓶)。
(14)孵育后去掉微量板孔内液体，用步骤(1)中配制的工作洗液冲洗，每个孔洗4次，同步骤(7)，去掉微量板孔内液体，用步骤(1)中配制的工作洗液冲洗每个孔三次，同步骤(7)。洗后，将微量板翻转，置于脱纤维吸水纸上，轻轻叩打，令其干燥。样品中如含有害物质，须采取防护措施。
(15)每孔加TMB底物溶液(G瓶)100μl，封盖，室温暗处孵育15min.。
(16)孵育后，每孔加终止液(H瓶)100μl，涡旋或叩打轻轻，令其混匀。
(17)酶标仪于450nm处5min内测出吸收值。
(18)绘出标准曲线。待测样品中HIFNα的滴度可从标准曲线上求出。所提供的标准曲线可供参考。
由于样品中干扰素的滴度是根据标准测得的，因此其单位可以是units/ml或pg/ml，转换系数为3-5pg/unit。这个转换系数只是一个近似值。
三、结果见下表：
CpG 24h 48h
OD450 α干扰素(pg) OD450 α干扰素(pg)
660 0.419 214.82 0.4335 223.3
661 0.207 90.795 0.195 83.775
662 0.212 93.72 0.276 131.16
663 0.159 62.715 0.117 38.145
664 0.883 486.26 0.899 495.62
665 0.2465 113.9 0.1675 67.688
666 0.0705 10.943 0.176 72.66
667 0.831 455.84 0.7505 408.74
668 0.4375 225.64 0.3865 195.8
669 0.19 80.85 0.18 75
670 0.227 102.5 0.2155 95.768
671 0.802 438.87 0.789 431.27
672 0.5065 266 0.475 247.58
673 0.3655 183.52 0.3595 180.01
674 0.233 106.01 0.23 104.25
675 0.471 245.24 0.5335 281.8
302 1.3785 776.12 1.227 687.5
647 0.074 12.99 0.08 16.5
TE 0.072 11.82 0.078 15.33
注：
CpG纵列：CpG ODN的编号，其序列如前文表所示。
24h OD450纵列：代表用CpG纵列所示的CpG ODN刺激人外周血单个核细胞24h收获上清中α干扰素测定实验中测得的光密度值(波长为450nm)。
24hα干扰素(pg)纵列：代表用CpG纵列所示的CpG ODN刺激人外周血单个核细胞24h收获上清中α干扰素的含量。
48h OD450纵列：代表用CpG纵列所示的CpG ODN刺激人外周血单个核细胞48h收获上清中α干扰素测定实验中测得的光密度值(波长为450nm)。
48hα干扰素(pg)纵列：代表用CpG纵列所示的CpG ODN刺激人外周血单个核细胞48h小时收获上清中α干扰素的含量。
SEQUENCE LISTING
<110>长春华普生物技术有限公司
<120>抗病毒和抗肿瘤的含CpG单链脱氧寡核苷酸
<130>I030021
<160>107
<170>PatentIn version 3.1
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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tcgtcgacgt cgttcgttct c 21