结合态雌性激素的提取方法 本发明涉及一种从孕马尿液(Pregnant Mare’s Urine，PMU)中提取结合态雌性激素(Conjugated Estrogen)的方法。
从孕马尿液中提取的结合态雌性激素主要应用于激素替代疗法(Estrogen Replacement Therapy，ERT)，用于治疗妇女更年期综合症，可以有效预防和治疗的心血管系统疾病及骨质疏松症。
雌激素是动物体中的一类重要性腺激素，属于类固醇的甾体激素。雌性动物的繁殖生理，受到中枢神经与垂体腺部的主宰，也直接接受着主要由卵巢分泌的激素影响。母畜妊娠期和临产前后，内分泌发生显著的变化，雌激素的生理作用受到抑制，但其产生却仍在进行，故妊娠期母畜排泄物中的雌激素含量显著增多，特别是在母马这种现象最为显著。
在20世纪60年代，采用孕马尿雌激素的激素替代疗法开始在美国和加拿大兴起，随之而来的是，激素替代疗法与更年期妇女子宫内膜癌，乳腺癌发生的关系在医学界也存在争议，看法不一。但随着老龄化问题在许多国家日益突出，体内雌激素水平低落引发的心血管系统疾病及骨质疏松症造成的骨折对老年妇女生命造成的威胁又日益严重起来，在20世纪90年代冠心病在发达国家已成为绝经后妇女的第一死因。除激素替代疗法外仍然没有其它治疗，雌激素缺少引发的妇女更年期综合症的有效方法。
在早期的研究中主要采用萃取地方法来分离从孕马尿中提取结合态雌激素，有美国专利2519516，2696265，2834712，英国专利2017906，澳大利亚专利6426999，其提取的方法采用有机的低碳醇、酯、卤代烃等，经过三至八步的萃取纯化除杂的方法进行，主要的问题是萃取乳化问题严重，导致分离效率低以及雌激素回收率低等问题。在后期的研究中采用吸附解析工艺，包括美国专利2551205，5723454，俄罗斯专利2179028，斯洛伐克专利24499，主要采用活性炭，硅胶，离子交换树脂等；以及中国专利1308083，1228027，1234740，分别采用含氰基的极性树脂，硅胶和半极性树脂。早期吸附剂如活性碳，硅胶等存在再生困难，吸附效率低的问题，后期吸附剂包括离子交换树脂，含氰基的极性吸附树脂，再生容易但饱和容量低，吸附选择性差。
本发明主要描述一种利用含亚砜基的极性吸附树脂提取孕马尿雌激素的方法，并开创性的提出一种应用于树脂解析的淋萃流程。
以含有亚砜基的极性吸附树脂作负载的吸附树脂，主要是利用了大孔网状的亚砜基极性吸附树脂对有效成分的选择性吸附作用进行分离的，先将孕马尿与树脂动态或者静态接触，结合态混合雌激素便被吸附在柱上，再用有机溶剂洗脱，之后进行解析，经浓缩、干燥即得结合态孕马雌激素混合物。
在本发明中开创性的提出一种树脂吸附物质的全新洗脱方式，淋萃过程。这是一种物理的物质分离过程，原理在于在淋洗平衡过程中，同时存在萃取过程的二次分配平衡。常规的树脂洗脱液一般应用低碳醇，酮，醚，酯等极性物质进行洗涤。本发明提出的淋洗流程就在于存在两次分配平衡，淋洗液与树脂中雌激素的一次平衡，以及洗涤液中洗脱主剂和萃取剂的二次平衡，这种化工分离过程目前已经成功应用于核工业，取得提高分配系数的显著效果。
在树脂的洗脱有效成份的过程中，有效成份存在结合于树脂上和溶解于洗脱液的分配平衡过程。在静态解析过程中，使用一定量的洗脱液浸泡饱和树脂，搅拌使树脂与洗脱液充分混合，使稳定一段时间后，更换洗脱液。在静态混合洗脱过程中，随着时间的增加，并不会有更多的有效成份被洗脱下来，必须更换新鲜洗脱剂，由此可以证明存在有效成份在树脂上和洗脱液之间的分配平衡。由于存在这个分配平衡，所以洗脱液可以分批将有效成份洗脱下来。我们把这种分配平衡称为淋洗平衡。
淋萃过程就是在洗脱液中增加一种或者几种有机溶剂，使洗脱过程中除存在淋洗平衡外，增加二次分配平衡，即萃取平衡。有机溶剂采用水不溶或微溶的有机溶剂，这种有机溶剂可以是极性溶剂或者非极性溶剂。一般树脂洗脱液为含有水溶性有机溶剂的水溶液，少数会采用纯有机溶剂。这些洗脱液中的有机成份会使为实现淋萃流程添加的萃取剂，溶解在洗脱液中形成稳定的均相；或者部分萃取剂不能完全溶于洗脱剂，适当的添加合适的表面活性剂可以形成稳定的均相。
淋萃过程的关键在用于萃取目的的有机溶剂为水不溶解或微溶的有机溶剂。
淋萃洗脱液的处理方法有两种，一种是按照正常的洗脱液处理，另一种是在洗脱液中增加表面活性剂使洗脱液分层，形成两相系统，将含有高纯有效成份的一相，作进一步的处理。
淋萃过程的主要优点是存在两次或两次以上分配平衡，可以用较少的洗脱液将有效成分从树脂淋洗下来，提高洗脱液中有效成份的浓度，同时提高分离物之间的分离系数，得到纯度更高的有效成份。
在研究淋萃过程中发现含亚砜基的极性树脂，有利于结合态雌激素的吸附和淋萃解析。
本发明描述的从孕马尿液中提取结合态雌性激素的步骤包括以下内容：
1、将孕马尿通过含亚砜基的极性树脂，在线检测。
2、用水洗涤树脂。
3、用配制的洗脱液进行淋萃解析过程。
4、将淋萃的洗脱液进行后处理，浓缩干燥得到结合态雌激素混合物固体。
在步骤1中提到的孕马尿，为不含或者含有少量悬浮物的孕马尿。含悬浮物不利于树脂吸附，应当提前处理以除去大部分悬浮物，方法可以是超滤，离心过滤，压滤等常规过程。
在步骤1中提到的树脂为含亚砜基的极性树脂。
在步骤2中提到的用水洗涤树脂，可以采用中性的水洗涤，或碱性水洗涤，或先用中性水洗涤，再用碱性水洗涤树脂。
在步骤3中的洗脱液成份为：水；一种可与水互溶性的低碳醇，酮，酯等极性有机溶剂，包含但不限于乙醇，甲醇，丙酮；以及一种或者几种水不溶或微溶的低碳醇，酮，卤代烷等有机溶剂，包含但不限于乙酸乙酯，正己醇，环己醇，正丁醇，氯仿。
在步骤3中的洗脱液可以为PH值中性。
在步骤3中的洗脱液可以调节PH为碱性，增加洗脱效果，PH范围为8～13，同时要求在步骤5中的后处理过程中需要先调节PH值为中性；
在步骤3中，淋萃温度为常温洗脱或者加热洗脱，加热对解析有利。温度范围为65℃以下。
在步骤4中的后处理过程，可以为直接浓缩、干燥；也可以添加表面活性剂使水不溶的有机溶剂与水相分离。再浓缩干燥。如果步骤3中洗脱液为碱性，需要先调节PH值为中性。
吸附树脂的再生方法，可采用常规的吸附树脂处理方法，用75％左右乙醇洗脱再生，必要时可采用1NHCL和1NNaOH处理。
在下述实施例中，合并第二、三柱体积洗脱液，喷雾干燥，得到含有结合态混合雌激素的浅黄色固体粉末，其中结合态雌激素含量可达到15％以上。优于采用普通树脂洗脱的效果，并且雌激素洗脱比较集中，不会形成拖尾。
在本发明以下实例中提到的雌激素均指结合态雌激素，结合态雌激素的分析方法为HPLC检测，以下实例中柱体积指相当于树脂柱体积。
实施例一：
将2.5升含40mg/l雌激素的马尿通过，30毫升含亚砜基的极性吸附树脂(市售，南开大学化工厂)，动态吸附。用水洗涤树脂至无色，共用水90ml。然后用PH值为10的水洗涤树脂，至无色，共用水90ml。洗脱剂为水∶乙醇∶乙酸乙酯比例为45∶35∶20。常温洗脱，洗脱液收集四个柱体积。
实施例二：
将3升含35mg/l雌激素的马尿通过，30毫升含亚砜基的极性吸附树脂，动态吸附。用水洗涤树脂至无色，然后用PH值为11的水洗涤树脂，至无色。洗脱剂为水∶乙醇∶环己醇比例为50∶30∶20，PH值11。55℃洗脱，收集四个柱体积。 实施例号 马尿起始浓度 40mg/l 35mg/l 35mg/l 洗脱液 水/乙醇/乙酸乙酯 45∶35∶20 水/乙醇/环己醇 50∶30∶20 PH11 水/乙醇/正丁醇 50∶25∶25 PH10 洗脱温度 常温 55℃ 常温 第一柱体积浓度 0 0 0 第二柱体积浓度 1246mg/l 1356mg/l 954mg/l 第三柱体积浓度 939mg/l 856mg/l 1183mg/l 第四柱体积浓度 32mg/l 29mg/l 83mg/l
实施例三：
将3升含35mg/l雌激素的马尿通过，30毫升含亚砜基的极性吸附树脂，动态吸附。用水洗涤树脂至无色，然后用PH值为10的水洗涤树脂，至无色。洗脱剂为水∶乙醇∶正丁醇比例为50∶25∶25，洗脱液调PH值10。常温洗脱，收集四个柱体积。