阿尔茨海默病动物模型的制备方法 【技术领域】
本发明涉及医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种用于筛选治疗阿尔茨海默病药物，评价治疗阿尔茨海默病方法的动物模型的制备方法。
背景技术
制备阿尔茨海默病(Alzheimer简称AD，也称老年性痴呆症，下同)动物模型，可以通过对动物模型进行各种试验后，对其病理形态学进行对比分析，其计数资料和计量资料还可进行统计学处理、分析，从而便于进行该病发病机制及治疗方法(包括治疗药物)的研究。
现有的老年性痴呆症疾病动物模型的制备方法包括：1、非转基因AD模型，包括有物理(手术、电、热等)和化学针对胆碱能神经损伤假说的(神经毒剂如鹅膏蕈氨酸、使君子氨酸、河豚毒素、中药樟柳碱、AF64A等)损毁胆碱能神经元、针对AD发病的铝元素中毒学说的氯化铝诱导、自然衰老、SAM系老化鼠、神经纤维缠结模型、针对AD发病的β淀粉样蛋白假说的β-淀粉样蛋白脑内注射等。这些非转基因模型虽表现有学习记忆功能的衰退，但大多针对AD病理的某一方面，相比AD错综复杂的病理过程来说有一定的差距。更重要的是缺乏AD脑内特征性变化，即AD三大病理改变中最具有特征的老年斑。2、转基因小鼠模型的研究是近年AD模型研究中的一个热点，主要集中在淀粉样蛋白前体转基因动物模型上。其方法是将选定的人类的待转录APPcDNA的基因片段注射到受精卵雄原核内，再将受精卵移植到假孕地母鼠宫腔内。形态学的研究表明出生的小鼠内出现了许多AD的病理学特征的改变—包括细胞外β淀粉样蛋白的沉积、老年斑、突触的丢失和小胶质细胞增生等。虽然转基因动物模型脑内出现了AD特有的病理改变老年斑，但是大多数AD患者是散发性的，并没有出现这些基因突变，只有不到10％的AD患者有家族性，而其中的多数也未能发现基因突变，因此转基因动物模型不能完全代表人类AD，此外，建立转基因动物模型需要复杂的技术和高昂的费用，推广应用尚有很大的局限性。
这两种模型存在如下缺陷：1.在现有的非转基因AD模型中，只出现过其中的Aβ样免疫阳性神经元(APLI)增多特征的报道，还未有老年斑特征的产生。还不能具备AD的所有主要特征。2.转基因动物模型虽有老年斑的病理特征，但符合遗传特征的AD患者只占所有AD病人的1％，并且成功率低，造价昂贵。
【发明内容】
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种阿尔茨海默病动物模型的制备方法，制备具有AD的老年斑、神经原纤维缠结、胆碱能神经元丢失三个主要特征的动物模型，该方法简便、易行、易控、机理明确、性质稳定且重现性好，成本低，指标既可定性也可定量，可以做病理形态学对比分析，计数资料和计量资料，还可进行统计学处理、分析；可用于该病发病机制及治疗方法(包括治疗药物)的研究。
本发明的阿尔茨海默病动物模型的制备方法包括：用D-半乳糖对小白鼠、或大白鼠、或其他哺乳动物的腹腔注射给药60-150天，用量为60～180mg·kg-1·d-1；同时灌胃给予三氯化铝，用量为5～50mg·kg-1·d-1。
得到的动物模型学习记忆功能减退，脑内形成所述疾病特征性病理改变，所述疾病特征性病理改变是指老年斑、神经原纤维缠结和胆碱能神经元及其他神经元不同程度的丢失。
效果较好的条件是：用D-半乳糖对小白鼠、或大白鼠、或其他哺乳动物的腹腔注射给药100-120天，用量为80～100mg·kg-1·d-1；同时灌胃给予三氯化铝，用量为5-15mg·kg-1·d-1。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1、本发明制备的动物模型具备AD的重要特征老年斑；
2、具备神经原纤维缠结及胆碱能神经元丢失特征；
3、简便、易行、易控、机理明确、性质稳定且重现性好；
4、可以做病理形态学对比分析，计数资料和计量资料，还可进行统计学处理、分析；
5、成功率高，造价低廉。
【附图说明】
图1为空白对照组大脑皮层Aβ1-40免疫组化染色反应(阴性)；
图2为空白对照组海马Aβ1-40免疫组化染色反应(阴性)；
图3为模型组大脑皮层Aβ1-40免疫组化染色反应(阳性)；
图4为模型组海马Aβ1-40免疫组化染色反应(阳性)。
【具体实施方式】
实施例1
昆明种小鼠，适应性饲养一周，将动物随机分为2组，空白对照组、AD模型组每组20只。模型组和给药组腹腔注射D-半乳糖60mg·kg-1·d-1(生理盐水配制)和灌胃三氯化铝5mg·kg-1·d-1(双蒸水配置)，连续150天，空白对照组腹腔注射等量的生理盐水和灌胃等量的双蒸水。
模型测试结果：
一、学习记忆能力下降表现
造模结束后，通过Norris水迷宫来检测AD模型小鼠学习记忆能力。
1.各组小鼠逃避潜伏期
表1 Morris水迷宫各组小鼠逃避潜伏期( x±s，n＝20)单位：s)
组别 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天
空白对照组 31.3±10.3 22.0±9.1 19.7±8.9 10.4±4.7** 9.0±3.4**
AD模型组 37.9±12.1 28.7±13.0 26.4±12.2 21.4±12.2 20.6±9.6
**与AD模型组比：P＜0.01
由表1可以看出，AD模型组小鼠在第四天和第五天逃避潜伏期明显比空白对照组长，经统计学处理有显著性差异(P＜0.01)。
2.各组小鼠平台所在象限停留时间及占总时间百分比
表2平台所在象限停留时间及占总时间百分比( x±s，n＝20)
撤除平台后在平台所在象 占总时间百分比
组别
限停留时间(S) (以总时间60S记，％)
空白对照组 29.7±4.3** 49.5±7.1**
AD模型组 17.9±5.3 29.8±8.8
与AD模型组比：**P＜0.01
由表2可以看出，当第五天下午撤除平台后，AD模型组平台所以象限停留时间平台所在象限停留时间及占总时间百分比明显比空白对照组短(P＜0.01)。
二、脑组织中出现老年斑病理改变
常规HE染色显示，各实验组没有明显病理改变和差异。Aβ1-40免疫组化染色显示，空白对照组反应阴性(图1、图2)，说明Aβ1-40蛋白在正常状态下几乎不表达或表达量极微。而模型组阳性(图3、图4)，模型组结果显示在海马及皮质均可见较多可见到Aβ的沉积形成的老年斑(senile plaque，SP)，在其周围可看到一肿胀变形的神经元。另见到少量Aβ样免疫反应阳性(APLI)神经元，阳性产物主要位于神经元核周及突起。
三、脑组织中出现神经原纤维病理改变
造模小鼠约60天时，已有部分小鼠有弓背、毛发稀疏、行动迟缓等衰老特征。造模结束后病理切片用Bielschowsky改良法染色。5μm厚石蜡切片脱蜡至水洗；入20％硝酸银水溶液内，置37℃温箱内避光浸染25～35分钟；水洗2～3分钟；10％甲醛液还原数秒钟至切片呈黄色为止；蒸馏水洗3～5分钟：氨银液(配置：20％硝酸银水溶液30ml与无水酒精20ml混合后再滴加入浓氨水，直至形成的棕色沉淀刚刚溶解后再滴入5滴浓氨水：过滤备用)滴染20～40秒；10％甲醛再次还原1～2分钟；蒸馏水洗5分钟；5％硫代硫酸钠水溶液固定3～5分钟；酒精系列脱水；二甲苯透明，中性树胶封固。结果显示，空白对照组反应阴性，无神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)形成，而模型组为阳性，在海马及皮质神经元内均可见较多的呈黑色的神经原纤维缠结。
表3 AD模型脑组织中神经元纤维缠结的分布(个/mm2)
组织学变化 例数 海马 皮层
AD模型组 10 8.3±1.3 4.4±1.7
四、脑组织中出现胆碱能神经元丢失改变
1.胆碱能神经元及其突起的计数分析。
40μm厚的冰冻切片用双蒸水快速洗1次，3分钟；入反应液，室温下1～1.5小时，振摇；醋酸缓冲液洗5次，每次1分钟；0.05％硝酸银处理1分钟；0.1M硝酸钠洗5分钟，每次1分钟；裱片，晾干，上行酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在AO显微镜下用目镜测试网格(20×物镜，0.25mm2)计数内侧隔核和斜角带核的阳性神经元数；在40×物镜(2500μm2)计数海马CA1区及其对应齿状回分子层，CA3及门区的阳性纤维数。结果表明，与对照组比较，模型组内侧隔核核斜角带核胆碱能神经元减少不明显。但模型组CA1、CA3区和齿状回胆碱能神经原纤维密度均低于对照组(P＝0.021)。
表4 AD模型鼠海马胆碱能神经原纤维密度的变化( x±s，n＝10)
组别 CA1 CA3 齿状回 门区
空白对照组 43.50±5.65* 39.50±4.66* 45.17±4.29* 46.67±5.77
AD模型组 28.00±6.12 24.10±4.71 30.98±1.87 38.50±3.78
与对照组比较：*P＝0.021
2.小鼠脑内胆碱能递质系统生化指标测定结果
表5 AD模型中Ach、AchE活性的变化( x±s，n＝10)
Ach 蛋白含量 AchE
组别
(μg·mg-1) (mg·ml-1) (μmol·mg-1)
空白对照组 383.8±26.7** 2.99±0.30 1.17±0.25**
AD模型组 140.2±31.5 2.81±0.25 3.15±0.34
与AD模型组比：**P＜0.01
由表5可以看出，各组间的蛋白质含有量没有显著性差别。AD模型组Ach含量明显下降，AD模型组AchE活性明显升高，说明AD模型组胆碱能递质系统受损。
实施例2
昆明种小鼠，适应性饲养一周，将动物随机分为2组，空白对照组、AD模型组每组20只。模型组和给药组腹腔注射D-半乳糖180mg·kg-1·d-1(生理盐水配制)和灌胃三氯化铝50mg·kg-1·d-1(双蒸水配置)，连续90天，空白对照组腹腔注射等量的生理盐水和灌胃等量的双蒸水。
模型测试结果：
一、学习记忆能力下降表现
造模结束后，通过Morris水迷宫来检测AD模型小鼠学习记忆能力。
1.各组小鼠逃避潜伏期
表6 Morris水迷宫各组小鼠逃避潜伏期( x±s，n＝20)单位：s)
组别 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天
空白对照组 30.3±10.8 21.0±9.6 19.6±9.9 9.4±4.8** 8.9±3.7**
AD模型组 38.9±12.4 29.7±12.9 27.4±12.9 23.4±12.5 21.6±9.8
**与AD模型组比：P＜0.01
由表1可以看出，两AD模型组小鼠在第四天和第五天逃避潜伏期明显比空白对照组长，经统计学处理有显著性差异(P＜0.01)。
2.各组小鼠平台所在象限停留时间及占总时间百分比
表7平台所在象限停留时间及占总时间百分比( x±s，n＝20)
撤除平台后在平台所在象 占总时间百分比
组别
限停留时间(S) (以总时间60S记，％)
空白对照组 33.7±5.1** 52.5±8.1**
AD模型组 18.9±4.8 26.8±7.8
与AD模型组比：**P＜0.01
由表2可以看出，当第五天下午撤除平台后，AD模型组平台所以象限停留时间平台所在象限停留时间及占总时间百分比明显比空白对照组短(P＜0.01)。
二、脑组织中出现老年斑病理改变
造模小鼠约60天时，已有部分小鼠有弓背、毛发稀疏、行动迟缓等衰老特征。Aβ1-40免疫组化染色显示，空白对照组反应阴性(图1、图2)，说明Aβ1-40蛋白在正常状态下几乎不表达或表达量极微。而模型组阳性(图3、图4)，模型组结果显示在海马及皮质均可见较多可见到Aβ的沉积形成的老年斑(senile plaque，SP)，在其周围可看到一肿胀变形的神经元。另见到少量Aβ样免疫反应阳性(APLI)神经元，阳性产物主要位于神经元核周及突起。
三、脑组织中出现神经原纤维病理改变
造模结束后病理切片用Bielschowsky改良法染色。5μm厚石蜡切片脱蜡至水洗；入20％硝酸银水溶液内，置37℃温箱内避光浸染25～35分钟；水洗2～3分钟；10％甲醛液还原数秒钟至切片呈黄色为止；蒸馏水洗3～5分钟：氨银液(配置：20％硝酸银水溶液30ml与无水酒精20ml混合后再滴加入浓氨水，直至形成的棕色沉淀刚刚溶解后再滴入5滴浓氨水：过滤备用)滴染20～40秒；10％甲醛再次还原1～2分钟；蒸馏水洗5分钟；5％硫代硫酸钠水溶液固定3～5分钟；酒精系列脱水；二甲苯透明，中性树胶封固。结果显示，空白对照组反应阴性，无神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)形成，而模型组为阳性，在海马及皮质神经元内均可见较多的呈黑色的神经原纤维缠结。
表8 AD模型脑组织中神经元纤维缠结的分布(个/mm2)
组织学变化 例数 海马 皮层
AD模型组 10 9.3±2.3 3.4±1.5
四、脑组织中出现胆碱能神经元丢失改变
1.胆碱能神经元及其突起的计数分析。
40μm厚的冰冻切片用双蒸水快速洗1次，3分钟；入反应液，室温下1～1.5小时，振摇；醋酸缓冲液洗5次，每次1分钟；0.05％硝酸银处理1分钟；0.1M硝酸钠洗5分钟，每次1分钟；裱片，晾干，上行酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在AO显微镜下用目镜测试网格(20×物镜，0.25mm2)计数内侧隔核和斜角带核的阳性神经元数；在40×物镜(2500μm2)计数海马CA1区及其对应齿状回分子层，CA3及门区的阳性纤维数。结果表明，与对照组比较，模型组内侧隔核核斜角带核胆碱能神经元减少不明显。但模型组CA1、CA3区和齿状回胆碱能神经原纤维密度均低于对照组(P＝0.021)。
表9 AD模型鼠海马胆碱能神经原纤维密度的变化( x±s，n＝10)
组别 CA1 CA3 齿状回 门区
空白对照组 44.50±4.65* 38.50±4.69* 47.18±4.34* 49.97±5.97
AD模型组 26.00±6.9 24.10±4.8 30.98±2.87 38.50±3.60
与对照组比较：*P＝0.021
2.小鼠脑内胆碱能递质系统生化指标测定结果
表10 AD模型中Ach、AchE活性的变化( x±s，n＝10)
Ach 蛋白含量 AchE
组别
(μg·mg-1) (mg·ml-1) (μmol·mg-1)
空白对照组 390.8±28.9** 3.89±0.32 1.21±0.23**
AD模型组 151.2±33.7 3.71±0.21 4.10±0.39
与AD模型组比：**P＜0.01
由表10可以看出，各组间的蛋白质含有量没有显著性差别。AD模型组Ach含量明显下降，AD模型组AchE活性明显升高，说明AD模型组胆碱能递质系统受损。