利用RUNX2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法.pdf

本发明涉及一种利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法，特别是一种利用Runx2基因表达及小分子化合物CHIR99021和/或小分子化合物forskolin，在地塞米松存在的条件下诱导人成纤维细胞转分化为成骨细胞的方法，属细胞生物学与组织工程领域。它包括：构建携带Runx2-GFP的慢病毒浸染人皮肤成纤维细胞，之后利用小分子化合物5～10μMCHIR99021和10μMforskolin在地塞米松的存在的条件下，进行人成纤维细胞的转分化，7～１５天以后，更换成骨细胞诱导液进行诱导，5～20天后可将其诱导为成骨细胞的方法。本发明可以简单快速地获得成骨细胞，用于骨代谢性疾病，骨折等的细胞治疗。本发明的药物组合也可用于组织工程骨的研发和生产。为基础研究带来便捷，为临床应用带来前景。

1.  一种利用Runx 2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法，其特征是利用Runx2基因的表达及小分子化合物CHIR99021和forskolin，诱导人成纤维细胞转分化为成骨细胞。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征是先构建携带 Runx2-GFP的慢病毒浸染人皮肤成纤维细胞，使正常人皮肤成纤维细胞表达 Runx2，放置普通培养液培养3～7天后，在该普通培养液再加入小分子化合物6μM～12μM的forskolin + 5～15nM的地塞米松两种物质，组成激素信号分子诱导液，在该激素信号分子诱导液中再进行7～15天的细胞培养，随后利用成骨细胞分化液进行诱导（37°C， 5%CO₂），5～7天后可诱导为成骨细胞；
所述普通培养液是指：10％胎牛血清 + 100U/ml青霉素 + 100μg/ml链霉素 + 高糖DMDM培养基，在37°C，5%CO₂环境下培养细胞；
所述成骨细胞分化液配方为：10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) + 高糖DMDM培养基(Gibco)+ 10mMβ-甘油磷酸 + 100nM地塞米松 + 0.2mM ascorbate-2-phosphate ；在37°C，5%CO₂ 环境下培养细胞。

3.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述激素信号分子诱导液还可以是在普通培养液再加入5～10μM的小分子化合物CHIR99021物质，则在普通培养液添加由CHIR99021（5～10μM）+ forskolin（6μM～12μM）+ 地塞米松（5～15nM）三者混合液组成的混合液，即是激素信号分子诱导液。

4.  根据权利要求1或2所述的利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法，其特征在于：组成激素信号分子诱导液中最佳量为：9uM小分子化合物CHIR99021+10uM小分子化合物forskolin+10nM地塞米松。

5.  根据权利要求1或2所述的利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法，其特征在于：
   a.所采集的成骨细胞是由普通人皮肤细胞通过转录因子Runx2的表达直接转分化而得，该皮肤细胞不需要传统的诱导性多能干细胞（iPS）四因子（c-Myc, Klf4, Oct4,Sox2）,因而不经过干细胞阶段，避免移植时成瘤风险；
b. 所利用激素信号分子诱导液中的地塞米松与小分子化合物CHIR99021和/或小分子化合物forskolin在一定浓度下的组合，搭配上述Runx2表达的人皮肤成纤维细胞，且维持Runx2一定的表达时间窗口11天～15天，以及早期使得（转分化启动后6～11天后）碱性磷酸酶（ALP）在细胞中的表达，可以得到该成骨种子细胞；
     所述碱性磷酸酶（ALP）是指：成骨细胞的表型标志物之一，成骨分化的过程中早期表达的蛋白。

6.  根据权利要求1或2所述的利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法，其特征和具体步骤是
（一）、质粒构建和细胞培养

1.  1细胞培养
先采集普通人皮肤成纤维细胞，将人皮肤成纤维细胞培养于含有10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml 青霉素(Sigma) + 100μg/ml 链霉素(Sigma) + 高糖DMDM组成的普通培养液(Gibco)中并贴壁于包被有明胶的6 孔板中；接种细胞密度5～6x10³/cm²培养于37℃，5％ CO2 的培养箱中；

1.  2质粒构建
将全长Runx2(来源于人类) 的cDNA插入到含GFP的pVSVG载体中，另外还有仅含有GFP的pVSVG的空载；
（二）、病毒侵染细胞
       慢病毒包装与感染：目的基因（Runx2）质粒与病毒包装质粒通过Lipofectamine 2000共转染HEK293T细胞，获得了高滴度的病毒，分别对此细胞感染Runx2-GFP-PVSVG慢病毒和GFP-PVSVG空载的慢病毒，感染效率分别可达到61%和93.4%；
   （三）、小分子诱导
    将病毒感染后的皮肤成纤维细胞培养3～７天，使用普通培养液培养，配方是：10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma)+ 高糖DMDM培养基(Gibco)；
  之后更换为在普通培养液添加有小分子化合物后组成的激素信号分子诱导剂再培养７～１５天，激素信号分子诱导剂包括10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) + 高糖DMDM培养基(Gibco) + 9μM的CHIR99021（浓度范围：5～10μM） + 10μMForskolin （浓度范围：6μM～12μM ）+ 10nM地塞米松；
 （四）、成骨分化培养液
  随后再更换为成骨细胞分化培养液进行培养，成骨细胞分化液包括10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) + 高糖DMDM培养基(Gibco)+ 10mMβ甘油磷酸 + 100nM地塞米松+ 0.2mM ascorbate-2-phosphate，此后，每隔2～3天更换一次成骨细胞分化液，持续诱导5天以上;其后的细胞培养，一直使用成骨细胞分化液维持；
五、茜素红染色鉴定
① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS 清洗细胞3 次；
② 取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min ；
③ 去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④ 弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3 次以上，以避免出现假阳性
⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。

利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法，特别是一种利用Runx2基因表达及小分子化合物CHIR99021和/或小分子化合物forskolin，在地塞米松存在的条件下诱导人成纤维细胞转分化为成骨细胞的方法，属细胞生物学与组织工程领域。
背景技术
骨组织工程技术通过把成骨细胞和/或能引导骨组织再生的生物活性因子整合植入特殊的支架结构中以作为组织工程复合骨，希望替代传统的移植材料和技术。因此，骨组织工程需要大量种子细胞和专门的支架材料以支持细胞黏附和分化。传统应用的种子细胞包括分化晚期的成骨细胞、成骨细胞株、骨髓混合细胞或纯化的间充质干细胞。但此类细胞的来源有限、获取过程复杂并伴随供体较重的伤害，因而广泛应用受到限制。
与骨髓来源细胞相比，非成骨细胞如皮肤成纤维细胞来源丰富、很容易从患者获取并进行体外长期大量扩增培养。现在利用细胞转分化技术已经可以使皮肤成纤维细胞直接转变成成肌细胞、神经元、肝细胞、成骨细胞等多种不同类型的功能细胞，或先转变成多能干细胞再进一步定向分化成神经细胞或各种不同类型的功能性体细胞。引人注目的是，这些从皮肤细胞直接或间接转分化而得到的功能性神经细胞或体细胞已经不再保持原来母细胞的基因表达谱等分子与细胞特性，却获得了各种目的细胞的典型特征与功能。另外这些诱导性功能细胞不仅可以用来模拟相关的疾病，有的还成功地通过移植到疾病动物模型达到治疗目的。
为了实现高效、快速、特异性的细胞转分化，一般需要经过系统、广泛的筛选确定特异的转录因子等基因组合，在特定情况下人细胞可能比动物细胞转分化所需要的基因组合会复杂一些，有的转录因子还需要相应的信号分子协同作用才能实现转分化作用，比如我们发现了NGN2介导的人皮肤细胞转分化到神经细胞就必须有两种小分子化合物的协同作用。目前已有报道的成骨细胞转分化因子如BMP-2, BMP-7，LMP3单独或协同作用可以使皮肤成纤维细胞转分化为在体外、体内都具有骨形成作用的成骨细胞。这几种基因表达产物为分泌性的蛋白质，其表达分泌调控复杂。由于它们能通过旁分泌作用于周围的非骨质组织引起异位骨形成，在转分化细胞中长期持续高表达可能导致对移植部位周围健康组织的副作用。
2006年，ANDRE′ S J. GARCI′A报道，通过使用对成骨细胞起决定性作用的关键转录因子，如在骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2，在单独用于转分化时没有效果，在有激素信号分子地塞米松的协同作用使大鼠的皮肤成纤维细胞转分化为成骨细胞。2013年邓宏魁报道，通过筛选了10000种小分子化合物后，找到4种小分子，可以实现皮肤成纤维细胞的重编程，其中CHIR99021和Forskolin在重编程过程中发挥了重要的作用。
此外，化学小分子诱导细胞重新编程转变特定类型的细胞有其独特优势：①诱导过程短，药物可高效到达靶细胞；②可控性，可以准确控制药物达到需要的浓度；③成本低，化学小分子一旦确定可以大规模生产。
发明内容
本发明目的在于克服上述现有技术存在的不足，提出一种利用必需的基因/小分子组合（Runx2/CHIR99021和Forskolin），在细胞表达Runx2 的基础上，用一定比例的小分子CHIR99021和Forskolin组合，诱导人皮肤成纤维细胞向成骨细胞分化。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗与成骨细胞分化相关的疾病的药物组合物，前期在高浓度9μm的CHIR99021和10μmForskolin的组合，保持外源导入的Runx2持续一定时间的表达，在地塞米松的协同作用下，向成骨细胞方向诱导。
本发明采用以下技术方案完成本发明目的：一种利用Runx 2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法，其特征是利用Runx2基因的表达及小分子化合物CHIR99021和forskolin，诱导人成纤维细胞转分化为成骨细胞。
先构建携带 Runx2-GFP的慢病毒浸染人皮肤成纤维细胞，使正常人皮肤成纤维细胞表达 Runx2，放置普通培养液培养3～7天后，在该普通培养液再加入小分子化合物6μM～12μM的forskolin + 5～15nM的地塞米松两种物质，组成激素信号分子诱导液，在该激素信号分子诱导液中再进行7～15天的细胞培养，随后利用成骨细胞分化液进行诱导（37°C， 5%CO₂），5～7天后可诱导为成骨细胞；
所述普通培养液是指：10％胎牛血清 + 100U/ml青霉素 + 100μg/ml链霉素 + 高糖DMDM培养基，在37°C，5%CO₂环境下培养细胞；
所述成骨细胞分化液配方为：10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) + 高糖DMDM培养基(Gibco)+ 10mMβ-甘油磷酸 + 100nM地塞米松 + 0.2mM ascorbate-2-phosphate ；在37°C，5%CO₂ 环境下培养细胞。
所述激素信号分子诱导液还可以是在普通培养液再加入5～10μM的小分子化合物CHIR99021物质，则在普通培养液添加由CHIR99021（5～10μM）+ forskolin（6μM～12μM）+ 地塞米松（5～15nM）三者混合液组成的混合液，即是激素信号分子诱导液。
组成激素信号分子诱导液中最佳量为：9uM小分子化合物CHIR99021+10uM小分子化合物forskolin+10nM地塞米松。
所述的利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法，步骤是
   a.所采集的成骨细胞是由普通人皮肤细胞通过转录因子Runx2的表达直接转分化而得，该皮肤细胞不需要传统的诱导性多能干细胞（iPS）四因子（c-Myc, Klf4, Oct4,Sox2）,因而不经过干细胞阶段，避免移植时成瘤风险；
b. 所利用激素信号分子诱导液中的地塞米松与小分子化合物CHIR99021和/或小分子化合物forskolin在一定浓度下的组合，搭配上述Runx2表达的人皮肤成纤维细胞，且维持Runx2一定的表达时间窗口11天～15天，以及早期使得（转分化启动后6～11天后）碱性磷酸酶（ALP）在细胞中的表达，可以得到该成骨种子细胞；
     所述碱性磷酸酶（ALP）是指：成骨细胞的表型标志物之一，成骨分化的过程中早期表达的蛋白。
具体步骤是：
一、质粒构建和细胞培养
1.1细胞培养
先采集普通人皮肤成纤维细胞，将人皮肤成纤维细胞培养于含有10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml 青霉素(Sigma) + 100μg/ml 链霉素(Sigma) + 高糖DMDM组成的普通培养液(Gibco)中并贴壁于包被有明胶的6 孔板中；接种细胞密度5～6x10³/cm²培养于37℃，5％ CO2 的培养箱中；
1.2质粒构建
将全长Runx2(来源于人类) 的cDNA插入到含GFP的pVSVG载体中，另外还有仅含有GFP的pVSVG的空载；
二、病毒侵染细胞
       慢病毒包装与感染：目的基因（Runx2）质粒与病毒包装质粒通过Lipofectamine 2000共转染HEK293T细胞，获得了高滴度的病毒，分别对此细胞感染Runx2-GFP-PVSVG慢病毒和GFP-PVSVG空载的慢病毒，感染效率分别可达到61%和93.4%；
   三、小分子诱导
    将病毒感染后的皮肤成纤维细胞培养3～７天，使用普通培养液培养，配方是：10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma)+ 高糖DMDM培养基(Gibco)；
  之后更换为在普通培养液添加有小分子化合物后组成的激素信号分子诱导剂再培养７～１５天，激素信号分子诱导剂包括10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) + 高糖DMDM培养基(Gibco) + 9μM的CHIR99021（浓度范围：5～10μM） + 10μMForskolin （浓度范围：6μM～12μM ）+ 10nM地塞米松；
 四、成骨分化培养液
  随后再更换为成骨细胞分化培养液进行培养，成骨细胞分化液包括10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) + 高糖DMDM培养基(Gibco)+ 10mMβ甘油磷酸 + 100nM地塞米松+ 0.2mM ascorbate-2-phosphate，此后，每隔2～3天更换一次成骨细胞分化液，持续诱导5天以上;其后的细胞培养，一直使用成骨细胞分化液维持；
五、茜素红染色鉴定
① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS 清洗细胞3 次；
② 取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min ；
③ 去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④ 弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3 次以上，以避免出现假阳性
⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
本发明所采集的成骨细胞是由普通人皮肤细胞通过转录因子Runx2的表达直接转分化而得，该皮肤细胞不需要传统的诱导性多能干细胞（iPS）四因子（c-Myc, Klf4, Oct4,Sox2）,因而不经过干细胞阶段，避免移植时成瘤风险。
本发明方法能简单、快速可以将人皮肤成纤维细胞转分分化为成骨细胞，则获得特异性地获取诱导性成骨细胞，它可以促进骨形成并有助于治疗多种骨病，例如骨质疏松，骨折等骨代谢疾病。
附图说明
图1本发明人皮肤成纤维细胞转分化为成骨细胞的方法示意图。
图２为本发明Runx2感染人皮肤成纤维细胞效率。
    图３为本发明人皮肤成纤维细胞转分化为成骨细胞的鉴定。在图３中：a, 正常人皮肤成纤维细胞的培养形态；b, 转分化为成骨细胞的细胞形态( 绿色荧光表示)； c, 转分化过程中，细胞碱性磷酸酶染色； d, 转分化为成骨细胞后形成的矿化结节（团块红色）；e, ALP（碱性磷酸酶）和Runx2基因的表达鉴定。
图４为转分化的细胞进行小鼠的皮下移植，形成新生骨。在图４中a, 细胞小鼠皮下移植后，形成的新生骨（圈内）；b, 白光下看的a图移植物的切片鉴定；c, 紫外光看的a图移植物的切片鉴定。
具体实施方式
本发明利用Runx2基因的表达及小分子化合物CHIR99021和forskolin，诱导人成纤维细胞转分化为成骨细胞的过程是：
 (1) 采集普通人皮肤成纤维细胞，培养人皮肤成纤维细胞；
(2) 构建Runx2 慢病毒载体；
（3） 慢病毒感染人皮肤成纤维细胞，确定成纤维细胞开始表达Runx2；
（4） 感染3-7天后,细胞密度2～3x10⁴/cm2的情况下，用9μm的CHIR99021+10μmForskolin以及加10nM地塞米松激素信号分子液处理细胞7～15天 ；
    (5)之后加入成骨细胞诱导液进行诱导，持续10～20天可以得到成骨细胞；可以用该诱导液维持细胞培养；
     （6）获得成骨细胞，并进行鉴定。
本方法使用小分子（forskolin 6μm～12μm + 地塞米松5～15nM）也可以使得表达Runx2的人皮肤成纤维细胞转分化为成骨细胞，尽管转化效率（形成成骨标志物：矿化结节的比例不高）不如三者（forskolin + CHIR99021 + 地塞米松）化合物存在的高，但是首先引入了小分子forskolin的使用，利于人皮肤成纤维细胞向成骨细胞方向分化。
实施例1
一、质粒构建和细胞培养
1.1 人皮肤成纤维细胞培养：先采集普通人皮肤成纤维细胞，将人皮肤成纤维细胞培养于含有10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml 青霉素(Sigma) + 100μg/ml 链霉素(Sigma) + 高糖DMDM组成的普通培养液(Gibco)中并贴壁于包被有明胶的6 孔板中；接种细胞密度5～6x10³/cm²培养于37℃，5％ CO2 的培养箱中。
1.2 构建Runx2慢病毒载体：将全长Runx2 (来源于人类) 的cDNA插入到含GFP的pVSVG载体中，另外还构建仅含有GFP的pVSVG的空载。
二、病毒侵染细胞
      慢病毒包装与感染：目的基因Runx2质粒与病毒包装质粒通过Lipofectamine 2000共转染HEK293T细胞，获得了高滴度的病毒，对普通的人皮肤成纤维细胞分别感染Runx2-GFP-PVSVG慢病毒和GFP-PVSVG空载慢病毒,效率分别可达到61%和93.4%。
     三、小分子诱导
    将病毒感染后的人皮肤成纤维细胞（此时细胞分别表达Runx2或者GFP）,培养3～７天，使用普通培养液，该培养液包含10％胎牛血清(Hyclone)， 100U/ml 青霉素(Sigma)，100μg/ml 链霉素(Sigma)， 高糖DMDM (Gibco)。
  之后更换为激素信号分子诱导液再培养７～１５天，激素信号分子诱导液包括10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) + 高糖DMDM培养基(Gibco) + 10μMForskolin μμ+ 10nM地塞米松；
   四、成骨分化培养液
    7～15天后，再更换为成骨细胞分化液进行培养，此成骨细胞分化培养液包括10％胎牛血清(Hyclone) + 100U/ml青霉素(Sigma) + 100μg/ml链霉素(Sigma) + 高糖DMDM培养基(Gibco)+ 10mMβ-甘油磷酸 + 100nM地塞米松+0.2mM ascorbate-2-phosphate，此后，每隔2～3天更换一次成骨细胞分化培养液，持续诱导5天以上;其后的细胞培养，一直使用成骨分化液维持。
五、茜素红染色鉴定
① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS 清洗细胞3次；
② 取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min ；
③ 去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④ 弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
实施例2 ～实施例8 ：实施例2至实施例8中对培养和转分化方法与实施例1相同，不再重点述，但其配方和操作时间不同，具体如下表所示。