红栌高频率试管植株再生与工厂化育苗方法 【技术领域】
本发明涉及利用生物技术实现红栌高频率试管植株再生、快速繁殖和工厂化苗木生产的技术及其所用的培养基。
背景技术
红栌(Cotinus coggygria var. cinerea Engl.et Wils)为漆树科(Anacardiaceae)黄栌属(Cotinus Mill.)黄栌(Cotinus coggygriaScop.)的一个变种，也有人认为是黄栌的一个红叶变型(Van der Zwaan AG，Publicatie，-Landbouw-Economisch-Instituut，-Netherlands.1989，4(122)：30)，又名″红叶″、″烟树″，英文名为“Ash-coloured Smoketree″或“Purpureus”，为大型落叶灌木或小乔木。由于红栌最早在美国发现，故又统称为“美国红栌″。也有人根据红栌的发现地来命名，如“欧洲红栌″、″中国红栌″或″北京红栌″等。
红栌，包括美国红栌在北京春、夏、秋三季呈红叶，而著名的“香山红叶”是普通黄栌经过秋霜之后才逐渐变红，观赏红叶的时间只有一个月或半个月。红栌不仅使游人“一年三季看红叶”，而且将由“香山看红叶”变成“山山看红叶”，“处处看红叶”。对于主要景观树种为绿色的北京和黄河以北广大地区，红栌的红色美化，能发挥“万绿丛中一点红”的特殊作用。红栌，包括美国红栌的叶片比普通黄栌大，初春时全部叶片为鲜嫩的红色或紫红色，娇嫩欲滴；夏季树冠上部新叶始终为红色或紫红色，叶色红艳美丽，而树冠下部叶片开始渐渐转为绿色；入秋整株叶色又逐渐转变为深红色，秋霜过后叶色则更加红艳。美国红栌有时夏季两次开花，于枝条顶端的花序如絮状鲜红，观之如烟似雾，美不胜收，故有″烟树″之称。美国红栌对干旱低温的适应性强，冬天能耐-20C的低温，在年降水量500mm左右就足以满足其生长发育的需要。美国红栌对土壤的要求不高，在pH6.0-8.5的范围内，在不同类型的土壤中都能正常生长发育。正是由于这些特征和特性，红栌被誉为“彩叶树新贵”，在城镇绿化美化中具有特殊的意义。
红栌在经典地园艺学上用嫁接、扦插和分株繁殖，还可用埋干出苗法繁殖。这些繁殖方法不仅需要大量的“母本”树，而且繁殖效率也很低。此外，由于美国红栌在我国引入和驯化刚刚成功，在我国发现的红栌(“中国红栌”或“北京红栌”)还处于单株观察阶段，没有大量的母本可用，而市场需求又大，致使一些人用种子实生播种的方法繁殖。种子实生苗的遗传变异很大，良莠不齐，难以保持其故有的优良园艺性状。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一套利用生物技术工厂化生产红栌苗木的技术，克服上述现有繁殖技术或方法存在的缺陷，以便快速、高效、大规模地生产种性纯正、健康、整齐一致的高质量红栌苗木。
为了达到上述目的，本发明提供了一套红栌高频率试管植株再生育苗方法，包括下列步骤：(a).选择红栌器官和组织作为外植体；(b).外植体的表面消毒；(c).培养基的配制；(d).外植体的愈伤组织诱导；(e).外植体的芽直接诱导；(f).愈伤组织的芽分化与植株再生；(g).再生植株的伸长培养；(h).再生植株的试管快速繁殖；(i).再生苗的试管生根；(j).生根苗的移苗入土与驯化。
在上述方法中，所述的红栌为黄栌(Cotinus coggygria Scop.)的红叶变种或变型，包括美国红栌，中国红栌或北京红栌，欧洲红栌和其它国家和地区起源的红栌及其原种黄栌；所述的器官和组织是红栌的茎尖、幼叶、嫩芽、嫩梢、一年生半木质化梢和成熟芽；所述的外植体是利用上述的器官和组织作为人工培养的起始材料；所述的外植体表面消毒是利用乙醇、次氯酸钠和砷汞及类似杀菌剂杀死外植体表面所带的真菌和细菌；所述的愈伤组织的诱导是在人工条件由外植体诱导所产生的愈伤组织；所述的芽分化与植株再生是在人工条件下从愈伤组织上分化所产生的芽苗；所述的外植体的芽直接诱导是在人工条件下由外植体上直接获得的芽或芽苗；所述的再生植株的伸长培养是在人工条件下使再生植株伸长的培养方法；所述的试管快速繁殖是在人工条件下，将所获得再生植株切成单芽再进行试管扦插繁殖的方法；所述的再生苗生根是在人工条件下，使没有根的再生植株在试管内产生根从而形成完整植株的方法；所述的移苗入土与驯化是所得到的完整植株从试管移栽到土壤并逐步适应自然外界环境的方法；所述人工条件是人工培养基和培养的温度、光照条件；所述的培养基是基本培养基及其附加植物生长调节剂；所述的温度条件是人工培养的培养室或育苗工厂的温度与温度周期；所述的光照条件是培养室或育苗工厂的人工光照强度及光周期；所述的基本培养基是MS(Murashige and Skoog，1962)、B5(Gomborg et al.，1968)、WPM(Woody Plant medium；Lloyd and McCrown，1980)、Lescure(Lescure，1966)、MS5(MS无机盐加B5有机物)、WPM5(WPM无机盐加B5有机物)和L5(Lescure无机盐加B5有机物)；所述的植物生长调节剂是细胞分裂素类的N6-(2-异戊烯)腺嘌呤(N6-[2-Isopentenyl]adenine，简称2iP)、6-苯甲氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，简称6-BAP)或6-苄基腺嘌呤(N6-benzyladenine，简称6-BA或BA)、激动素(Kinetin，简称KT)和玉米素(Zeatin，简称ZT)，生长素类的2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid)、奈乙酸(a-Naphthaleneacetic acid，简称NAA)、吲哆乙酸(Indole-3-acetic acid，简称IAA)和吲哆丁酸(Indole-3-butyric acid，简称IBA)以及赤霉素(Gibberellin 3，简称GA3)；所述外植体表面消毒是外植体经自来水冲洗30min后用70-75％乙醇(或称酒精)浸泡10-15s，再用3-5％次氯酸钠浸泡5-10min，然后用1-2％砷汞浸泡10-15min，最后用无菌水冲洗5次，每次5min；所述的愈伤组织诱导的人工条件是基本培养基(MS、MS5、B5、WPM、WPM5、Lescure或L5)附加植物生长调节剂(单位：mg/L，以下同)2ip，BA或ZT 3-5mg/L和2，4-D，NAA，IAA或IBA 2-5mg/L，其中最佳人工条件是WPM5+ZT 5.0+IAA 3.0，WPM5+ZT 5.0+NAA或IBA 2.0，暗培养2-3周后转到光下，每天照光16h，光照强度为1000-1500Lx，培养温度为25±2C；所述的芽分化与再生的人工条件是B5、WPM或WPM5+2ip，BA或ZT 3-5mg/L+NAA、IBA或IAA 2-3mg/L，其中最佳条件是WPM5+PVP 1-2％+ZT 5.0+IAA 2.0，其次是WPM5+PVP 1-2％+ZT 5.0+IAA 2.0，WPM5+PVP 1-2％+ZT 5.0+NAA或IBA 2.0，WPM5+PVP 1-2％+2ip或BA 5.0+IAA 2-3或NAA或IBA 2.0，每天照光16h，光照强度为2500-3000Lx，培养温度为25±2C；所述的再生植株伸长培养的人工条件是WPM5+ZT或2ip2.0mg/L+IAA 1-2.0mg/L+ GA3 1-3.0mg/L，其中最佳人工条件是WPM5+ZT 2.0+IAA 1.0+ GA3 3mg/L，每天照光16h，光照强度为1500-2000Lx，培养温度为25±2C；所述的试管快速繁殖的人工条件是WPM5+ZT 2.0+IAA 1.0+ GA3 3mg/L，每天照光16h，光照强度为1500-2000Lx，培养温度为25±2C；所述的再生苗生根的人工条件是1/2MS或1/2WPM5+BA或KT 0.5-1.0mg/L+NAA或IAA或IBA 1.0-3.0mg/L，其中最佳条件是1/2WPM5+KT 1.0+IAA 3.0，其次是1/2WPM5+BA 1.0+IAA 3.0，1/2WPM5+KT 1.0+IBA或NAA 2.0；每天照光16h，光照强度为3500-4000Lx，培养温度为25±2C；所述的移苗入土与驯化方法是将按照权利要求20方法所得的生根苗开瓶炼苗3-4d后从试管或培养瓶中取出，在清水中洗净苗根部的琼脂，移栽到含有菜园土或1∶3自然熟土∶蛭石或泥炭土的苗盘、苗盆或苗床，保持土壤湿度为持水量的70-85％，空气相对湿度为85-95％，培养温度为白昼20-32C，夜晚16-20C；所述的工厂化生产是在培养室或生产车间进行年产50万苗及其以上的规模化生产。当芽苗伸长到5-6个芽节时，在无菌条件下将其切成单芽段，进行试管扦插，当试管扦插苗长到5-6个芽节时，再将其切成单芽段，进行试管扦插，形成循环。
在上述技术或方法中，从外植体的消毒到再生苗生根全过程在40天左右完成，并且达到外植体无污染成活率93.3％，愈伤组织诱导率95％以上，植株再生率93％以上，再生苗生根率97％以上，移苗入土成活率94％以上；15天左右再生苗单芽长成5-6个芽节的苗，繁殖系数为5n(n 13)；由一个单芽一年能繁殖苗木100万株以上；繁殖的苗木属无性系，种性纯正，整齐一致。
本发明的有益效果在于：1、苗木繁殖效率很高，由一个单芽一年能繁殖苗木100万株以上。2、繁殖的苗木属于无性系，种性纯正，能保持母株的优良园艺特征和特性，苗木整齐一致，因此质量高，商品性强。3、彻底改变苗木的生产方式，由传统的田间生产变成现代化的大规模工厂生产。4、苗木的繁殖和生产不受自然生长季节的限制，可周年生产。5、苗木的繁殖只需要一株的母本树或仅仅一个具有生活力的芽或枝梢段。6、繁殖的苗木不带病菌和虫卵，没有传播病虫害，特别是检验性病虫害的危险。
【附图说明】
图1是本发明方法中由嫩梢片段获得的美国红栌再生植株，其中：A.嫩梢片段愈伤组织分化出芽苗；B.再生芽苗的生长；C.再生苗的伸长；D.再生苗生根；E.完整再生苗入土驯化；
图2是本发明方法中由嫩梢快速高频率地获得美国红栌再生植株，其中：A.接种培养1周后的嫩梢外植体；B.梢外植体再生芽苗(3周左右)；C，再生苗伸长；D，4-5个芽的再生苗接种到生根培养基；E，芽苗生根状态(10天左右)；F，生根苗移栽到苗盘(2周后)。
实施例1：外植体的表面消毒
以种性纯正的红栌为取外植体的母本树。采集嫩芽、新梢和半木质化1年生枝梢作为外植体，嫩芽取下后，用自来水冲洗30min，新梢和半木质化1年生枝梢用自来水冲洗30-60min，切成3-5cm茎段。冲洗后的芽和茎段用70-75％的酒精浸泡10-15s，然后转到3-5％的次氯酸钠溶液中浸泡5、10、15或30min，或转到1-2％的砷汞溶液中处理5、10、15或20min，或经次氯酸钠消毒后再转到砷汞溶液进一步消毒。表面消毒处理后立即用无菌水冲洗5次，每次至少5min。将表面消毒好的嫩梢和1年生半木质化梢外植体在无菌条件下切成1cm左右的片段，垂直或水平接种到MS(Murachige and Skoog，1962)固体培养基(含0.7％琼脂，3％蔗糖，pH5.8)中，放置在暗处于25±2℃培养。
培养1周后观察，红栌对砷汞的敏感度比较低，在2％的溶液浸泡15min仍然有83％以上的外植体保持活力。嫩梢和半木质化梢表面消毒效果最好的是用次氯酸钠处理5min后再用1-2％的砷汞浸泡10-15min，有90％以上的外植体完全消毒而且保持生活力。嫩芽表面消毒效果最好的是用次氯酸钠处理5min后再用1-2％的砷汞浸泡10min，大约90％的外植体完全消毒而且保持生活力(表1)。
表1.次氯酸钠和砷汞对美国红栌茎段外植体表面消毒的效果*
处理 时间 污 染 杀 死 成活无污染 接种外
(min) 数 ％ 数 ％ 数 ％ 植体数
次氯酸钠 5 30 100 0 0 0 0 30
10 21 70 16 53.3 1 3.3 30
15 19 63.3 28 93.3 2 6.6 30
30 2 6.6 30 100 0 0 30
砷汞 5 30 100 0 0 0 0 30
10 6 20 1 3.3 24 76.6 30
15 2 6.7 3 10 25 83.3 30
30 0 0 26 86.7 4 13.3 30
次氯酸钠+砷汞 5+10 0 0 2 6.6 2893.3 30
5+15 0 0 3 10 27 90 30
*嫩梢和半木质化梢的平均值，每个处理平均接种30个外植体计算；表中％表示占接种外植体数的％。
因此，红栌外植体的表面消毒先用清水冲洗，用70-75％的酒精浸泡10-15s，再用次氯酸钠处理5min，然后用1-2％的砷汞浸泡10min，最后用无菌水冲洗3-5次。
实施例2：外植体和基本培养基的选择
所试验的基本培养基有7种：MS(Murachige and Skoog，1962)，B5(Gomborg et al.，1968)、WPM(Woody Plant Medium，Lloyd and McCrown，1980)、Lescure(Lescure，1966)、MS-B5(MS无机盐和B5有机物)、WPM5(WPM无机盐和B5有机物)和L5(Lescure 5无机盐和B5有机物)。作愈伤组织诱导和芽分化时，上述基本培养基中的蔗糖浓度都为3％，琼脂0.7％(或7g/L)。基本培养基配好后，加入BA 5.0mg/L和2，4-D 2.0mg/L，调整pH5.6-5.8，分瓶或高压灭菌后再分到培养皿中，每瓶约60ml，每培养皿25-30ml。培养基在125℃高压灭菌20-25min。
3种表面消毒好的外植体(嫩芽、嫩梢和半木质化梢段)接种到上述培养基中，放置在暗处于25±2℃培养，通过观察愈伤组织形成频率及其状态，以选择适合的外植体和基本培养基。愈伤组织的状态依据其大小、颜色和疏密度分成优、良、中、差4级。优：愈伤组织体积大(直径0.7-1cm)，绿色，质地密而不紧；良：愈伤组织体积较大(直径0.4-0.6cm)，绿色或绿红色，较密或致密；中：愈伤组织体积小(直径0.4cm以下)，绿白色，较密；差：愈伤组织体积或大或小，白色，疏松，呈水渍状。
培养2周左右，在7种基本培养基上，嫩梢和半木质化梢段在切口处都有愈伤组织的形成，但芽外植体没有可见的愈伤组织。再经过2周左右的培养后，嫩梢和半木质化梢段在切口处的愈伤组织有的转化为绿色，有的仍然为白色，有的呈水渍状，很软，而有的变得致密，根据培养基的不同而异。同时，部分芽外植体也形成愈伤组织。3种外植体在7种供试基本培养基中形成愈伤组织的频率及其质量见表2。
表2.基本培养基对美国红栌不同外植体愈伤组织形成的影响*
基本培养基 嫩 芽 嫩 梢 半木质化梢
愈伤级别 ％ 愈伤级别 ％ 愈伤级别％
B5 良 70.0 优 86.7 良 83.3
Lescure 中 60.0 中差 73.3 中差 66.7
Lescure5 良 63.3 中 83.3 中差 80.0
MS 良 66.7 差 96.7 良差 86.7
MS5 良 70.0 良 100 良 93.3
WPM 良 53.3 优 83.3 良 73.3
WPM5 良 63.3 优 96.7 优 80.0
平均 63.8 88.6 80.5
*基本培养基中附加BA 5.0mg/L和2，4-D 2.0mg/L；每种外植体在一种基本培养基上平均接种30个；培养基4周后统计。
从表2中可以看出，在基本培养基B5和WPM5上，3种外植体都能形成质量优良的愈伤组织，而且愈伤组织形成的频率在70％-96.7％，它们是更合适的基本培养基。
从表2中还可以看出，在供试的3种外植体中，以嫩梢段对供试的基本培养基的反应最好，在7种基本培养基中的愈伤形成率为88.6％，最差是芽，为63.8％，半木质化梢段居中，为80.5％。从形成愈伤组织的质量看，芽外植体基本都形成“良”级的愈伤；嫩梢在B5、WPM和WPM5中都能产生“优”级愈伤，半木质化梢段外植体只有在WPM5中才能形成“优”级愈伤。因此，嫩梢是最佳外植体。
实施例3：植物生长调节剂(PGR)对愈伤组织诱导的影响
根据实施例1和2的结果，用嫩梢为外植体，以WPM5为基本培养基，研究了细胞分裂素BA、2IP、KT或ZT(0、0.5、1.0、2.0或5.0，单位：mg/L，下同)单独使用和与生长素2，4-D、 IAA、IBA或NAA(0、0.5、1.0、2.0、3.0或5.0)配合使用对愈伤组织诱导的影响。培养基的配制按照实施例2的方法进行，外植体的消毒按照实施例1的方法进行。外植体的接种方式按照实施例2的方法进行。
将培养物置暗处培养2周，再转到光下培养。每天光照16h，暗8h，光照强度大约为1000-1500Lx。培养温度为25±1℃。
培养4周后观察统计，在有2，4-D(0.5、1.0、2.0或5.0mg/L)存在的条件下，4种细胞分裂素类从浓度1.0到5.0mg/L都能诱导嫩梢段产生愈伤组织，频率都在70％以上。高浓度的2，4-D(5.0mg/L)和高浓度的分裂素(2.0-5.0mg/L)能诱导97％以上的外植体形成愈伤组织，愈伤生长体积很大(直径可达到2cm以上)，绿红色而且质地十分紧密。经过继代培养后，愈伤仍然生长快而且十分紧密。在IAA存在的条件下，只有高浓度(2.0-5.0mg/L)的分裂素才能诱导形成愈伤。低浓度的分裂素(2.0mg/L以下)与低浓度的IAA(2.0mg/L以下)组合几乎难以诱导产生愈伤(频率在20％以下)，即使产生了愈伤，愈伤也很小，呈白色。IBA和NAA在1.0mg/L或以上，与4种分裂素(2.0-5.0mg/L)同时用时，能诱导80％以上的外植体形成愈伤，而且愈伤的质量都在“优”或“良”。在所用的4种分裂素中，诱导愈伤及所诱导愈伤质量高的依次为ZT，2IP，BA和KT。最好的PGR组合是ZT 5.0mg/L+IAA 3.0mg/L，96％以上的外植体都形成“优”级愈伤，其次为ZT 5.0mg/L+NAA或IBA 2.0mg/L，随后为2IP或BA 5.0mg/L+NAA或IBA 2.0mg/L。
实施例4：嫩梢离体培养高频率植株再生
嫩梢的表面消毒根据实施例1所筛选的最佳方案进行，愈伤组织的诱导根据实施例3所筛选的最佳培养基(即WPM5+ZT 5.0mg/L+IAA 3.0mg/L)和培养条件(暗处培养2周，再转到光下培养。每天光照16h，暗8h，光照强度大约为1000-1500Lx。培养温度为25±1℃)进行。
愈伤组织形成后，切成直径为0.5-0.6cm的小块，接种到芽分化与植株再生培养基中，每个瓶或每个培养皿(直径9cm)10块。芽分化与植株再生培养基以WPM5为基本培养基，附加PGR(单位：mg/L)BA、2IP、KT或ZT(0、0.5、1.0、2.0或5.0)和NAA、IBA或IAA(0、0.5、1.0、2.0或3.0)。首先将培养物放在暗处1-2天，然后转到光下。每天光照16h，暗8h，光照强度大约为2500-3000Lx，培养温度为25±1℃。
愈伤组织转接到分化或再生培养基上2周后，出现了分化的迹象，第3周就有小芽出现，第4周左右在合适的培养基上有90％以上的愈伤分化出小苗(图1，A)，再经过10天左右，小苗可以长到2-3个芽节(图1，B)。在合适的培养基上，平均一块愈伤分化出2-3株小苗(图1，B)。
植物生长调节剂(PGR)对芽苗再生的影响极大。在所试验的4种细胞分裂素类中，ZT最有利于美国红栌的试管植株再生。在含有ZT 2.0-5.0mg/L的培养基中，当附加IAA或NAA 2.0mg/L时，73-91％的愈伤组织和90％左右的嫩梢外植体能分化出小苗(表3)；当附加IBA时，芽苗分化频率降低到51％左右。2IP和BA对美国红栌的试管植株再生的作用相当，与适合浓度和种类的生长素配伍时，能诱导愈伤分化出芽苗，但分化的频率都低于ZT(表3)。
从生长素类的角度看，IAA最有利于美国红栌的试管植株再生，尤其是与ZT配合时；其次是NAA，再次是IBA。NAA和IBA与BA或2IP配合的效果也不及IAA与BA或2IP配合(表3)。
表3.植物生长调节剂(PGR)对美国红栌试管植株再生的影响*
PGR IAA IBA NAA
(mg/l) 0.5 1.0 2.0 3.0 0.5 1.0 2.0 3.0 0.5 1.0 2.0
3.0
2iP 0.5 F F F F F F F F F F F F
1.0 F F F F F F F F F F F F
2.0 F F D E F E E F F F D F
5.0 E D C B F F C D F F C C
BA 0.5 F F F F F F F F F F F F
1.0 F F F F F F F F F F F F
2.0 F F D E F F D E F F D F
5.0 E D C B F F C D F F C D
ZT 0.5 F F F F F F F F F F F F
1.0 F F F F F F F F F F F F
2.0 E D C B F F E D F F E D
5.0 D C B A F F B C F F B C
*每个组合平均30个外植体，在芽诱导分化培养基上培养4周后统计。
A，植株再生率≥90％；B，≥70％；C，≥50％；D，≥40％；E，≥30％；F，＜30％。
从表3可以看出，无论从芽苗的平均再生频率还是从平均每块愈伤再生的芽苗数看，美国红栌嫩梢试管植株再生的最佳生长调节剂组合是：ZT5.0mg/L+IAA 3.0mg/L，其后依次为：ZT 5.0mg/L+IAA 2.0mg/L，ZT 5.0mg/L+NAA或IBA 2.0mg/L，2IP或BA 5.0mg/L+IAA 2-3.0mg/L和2IP或BA 5.0mg/L+NAA或IBA 2.0mg/L。
实施例5：嫩梢离体培养快速高频率植株再生
根据实施例3和4的结果，研究了快速芽分化和植株再生的方法。
用嫩梢作外植体，根据实施例1所筛选的最佳方法进行表面消毒。嫩梢外植体经过表面消毒后，接种到根据实施例3所改良的固体愈伤诱导培养基(WPM5+BA 5.0mg/L+2，4-D 2.0mg/L+PVP 1％)上，于25±1℃暗培养1周(图版2，A)，随即再转接到根据实施例4改良的分化培养基(WPM5+ZT 5.0mg/L+IAA 3.0mg/L+PVP 1％)上进行培养，培养温度为25±1℃，每天16h照光，光照强度为2500-3000Lx。
培养2周左右在外植体基部出现分化的芽苗，再经过1周后，93.3％外植体分化出芽苗，平均每个外植体分化2-3个芽苗(图版2，B)。
实施例6：半木质化梢离体培养植株再生
取健康母本树上一年生半木质化的梢，按照实施例1筛选的最佳方法进行表面消毒。半木质化梢消毒后在无菌条件下切成长约1cm的片段，垂直或斜插实施例5所述的改良愈伤诱导固体培养基中(WPM5+BA 5.0mg/L+2，4-D 2.0mg/L+PVP 1％)，于25±1℃暗培养2周，再转接到实施例5所述的改良分化培养基(WPM5+ZT 5.0mg/L+IAA 3.0mg/L+PVP1％)上进行培养，培养温度为25±1℃，每天16h照光，光照强度为2500-3000Lx。
培养2周左右，将外植体转接到新鲜分化培养基上继代培养(以克服褐化)，培养的光温条件不变。培养2周左右，外植体切口处产生的微愈伤分化出芽苗，芽苗分化率83％以上，平均每个外植体分化2个以上的芽苗。
实施例7：腋芽直接诱导植株再生
取健康母本树上的嫩芽或半木质化梢的腋芽作为外植体，按照实施例1筛选的最佳方法进行表面消毒。表面消毒后，在无菌条件下将芽外层鳞片揭除，直接接种到根据实施例5所改良的芽诱导培养基(WPM5+ZT 5.0mg/L+IAA 3.0mg/L+PVP 1％+ GA3 1.0mg/L)中，在25±1℃暗培养1周后转到光下，进行16h光照培养，光照强度为2500-3000Lx。培养2周左右90％以上的芽开始萌动。将萌动的芽外植体转接到继代培养基(WPM5+ZT 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L+ GA3 3.0mg/L)，于弱光(1500-2000Lx)下继代培养，每天照光16h，培养温度25±1℃。培养2-3周，每个芽抽出5-6个芽节长的新梢。
实施例8：再生芽苗的伸长
按照实施例4-6方法所得到的再生芽达到2cm长时，从基本切下，接种到实施例7所述的继代培养基中(WPM5+ZT 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L+ GA3 3.0mg/L)中，于弱光(1500-2000Lx)下照光培养，每天照光16h，培养温度25±1℃。培养2周左右，芽苗达到5-6个芽节高(图版1，C；图版2，C)。
实施例9：再生苗的试管快速繁殖
将按照实施例7和8所述方法得到的具有5-6个芽节的芽苗或再生植株从其培养瓶(或其它培养容器)中取出，在无菌条件下切成单芽茎段，将单芽茎段垂直插入快速繁殖培养基(WPM5+ZT 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L+ GA3 3.0mg/L)中，插入深度以芽基部接触培养基为度。在弱光(1500-2000Lx)下照光培养，每天照光16h，培养温度25±1℃。培养2-3周，97％以上的单芽能抽出具有5-6个芽节的新梢。将所得到的新梢再切成单芽茎段，扦插到上述快速繁殖培养基中，物理培养条件不变。如此反复循环，直到所需要的苗量。
这样，在一个循环中，一个单芽段至少能繁殖5株苗。一个循环耗时15-18天，每年能作13-18个循环。苗木繁殖系数为5n(n 13)，由一个单芽，每年能繁殖100万株以上的苗木。
实施例10：再生苗的试管生根
实施例4-6所述得到的再生苗按照实施例8所述方法伸长后，或实施例7所述得到的苗和实施例9所述所得到的快繁苗达到5-6个芽节的高度后，用于试管生根。
作生根处理前，将上述苗转到2500-3000Lx光照强度下于25±1℃培养，每天照光16h。培养3-6天后，取出苗，切除其基部芽以下部分，垂直接种到生根培养基中(图2，D)。生根培养基以固体1/2MS为基本培养基，含蔗糖2％和植物生长调节剂BA或KT(0.0，0.5或1.0mg/L)和IAA或IBA或NAA(0.0，0.5，1.0，2.0 3.0mg/L)。将培养物置光下，每天光照16h，暗8h，光照强度大约为3500-4000Lx。培养温度为25±2℃。
生根培养2周后，开始观察到有根形成。在不含任何PGR的培养基中，没有根的形成；在含分裂素而不含生长素的培养基上，还是没有根的形成；在含生长素而不含分裂素的培养基上，也没有根的形成(表4)。而只有在同时含有分裂素和生长素的培养基上，才有根产生。这与多数木本植物不同。
与芽苗的分化不同，再生苗在含有KT加生长素的培养基中的生根要比在BA加生长素的培养基生根的频率高，特别是与IAA配合使用时。IAA对再生苗生根的效果比IBA和NAA好，这与芽苗再生相同。
在KT 1.0mg/L+IAA 3.0mg/L的培养基中，平均有96.7％的再生苗生根(图版1，D)，而在BA 1.0mg/L+IAA 3.0mg/L的培养基中，再生苗的生根率平均只有86.7％。在KT 1.0mg/L+IBA或NAA 2mg/l中，也有85％其它培养基的生根效率都低于70％(见表4)。
在以1/2WPM5为基本培养基，附加KT 1.0mg/L+IAA 3.0mg/L的改良生根培养基中，于强光(3500-4000Lx)下培养，每天光照16h，培养温度25±2℃，10天左右，平均98％以上的再生苗生根，每株苗平均有5条以上的根(图版2，E)。
表4.植物生长调节剂对美国红栌再生苗生根率的影响*
PGRs BA KT
(mg/l) 0.0 0.5 1.0 0.0 0.5 1.0
IAA 0.0 0 0 0 0 0 0
0.5 0 F F 0 F F
1.0 0 F D 0 E D
2.0 0 E C 0 D B
3.0 0 D B 0 C A
IBA 0.0 0 0 0 0 0 0
0.5 0 F F F F F
1.0 0 E D 0 E D
2.0 0 D C 0 D B
3.0 0 E D 0 E C
NAA 0.0 0 0 0 0 0 0
0.5 0 F F 0 F F
1.0 0 E E 0 E D
2.0 0 D C 0 C B
3.0 0 E C 0 D C
*.基本培养基为1/2MS，每个组合平均30株再生苗，在生根培养基上培养3周后统计。
生根率分级：A，≥95％；B，≥85％；C，≥75％；D，≥65％；E，≥50％；F，＜50％。
实施例11：生根苗移苗入土与驯化
再生苗或再生植株根据实施例10所述方法生根后，先在培养室或驯化温室(20-25℃)开瓶炼苗3-4天，再移栽到含有营养土的苗盘、苗盆或苗床中。营养土的组成为1份自然熟土加3份草(泥)炭土，或1份自然熟土加3份蛭石，即自然熟土∶草炭土或蛭石1∶3。移栽后，立即浇透水，用薄膜覆盖，放到温室，在20-25℃驯化。大约1周后，揭开覆盖的薄膜，置自然光下，夏天和秋天用遮阳膜或草帘遮阳，保持土壤湿度在持水量的75-85％、空气相对湿度85-95％。移栽后的1-4周内，浇少量的营养液，如1/4MS矿质元素液。移苗后4周观察，移栽成活率在94％以上(图版1，E；图版2，F)。移栽成活的苗木可以转移到普通温室、苗圃或在气候适当时直接定植到大田。
实施例12：苗木的规模工厂化生产
苗木的规模工厂化生产在异地由非本发明单位进行。苗木(组培)工厂有单人超净工作台5台，可供5人同时操作，有供培养25-30万瓶苗的培养架面积、高压灭菌锅等配制培养基的仪器设备和非智能化温室大约200m2。本发明单位派出技术人员指导。
规模工厂化生产从2002年7月开始，从本发明单位提供美国红栌母本苗5瓶。按照实施例9所述的方法进行苗木的快速繁殖。到2002年11月，该组培工厂的所有可用培养架架面已经布满了美国红栌瓶苗，计32万多株。按照实施例10所述方法使再生苗生根，再按照实施例11所述的方法移苗入土和驯化，到2002年12月已经生产驯化苗1万多株。