新的二肽基肽酶IV抑制剂和它们用于降低血压水平的用途 【技术领域】
本发明涉及二肽基肽酶IV和二肽基肽酶IV样酶活性抑制剂，更具体地说，涉及含有所述化合物的药物组合物，和所述化合物用于降低哺乳动物血压水平和相关疾病的用途。
背景技术
二肽基肽酶IV(DPIV)为切割肽链的N-末端二肽的丝氨酸蛋白酶，所述肽链优选在倒数第二位含有脯氨酸残基。虽然DPIV在哺乳动物系统中的生物作用尚未完全确认，但据信它在神经肽代谢、T细胞激活和HIV进入淋巴样细胞中起重要作用。
本发明提供DPIV抑制剂用于预防和治疗由DPIV和DPIV样酶抑制介导的病症，特别是用于降低血压水平和相关疾病的新用途，以及例如用于抑制DPIV和DPIV样酶的药物组合物和抑制所述酶活性的方法。
本发明涉及一种治疗方法，特别是一种用于降低哺乳动物血压水平的方法，并涉及用于此方法的化合物和组合物。二肽基肽酶IV(DPIV；EC 3.4.14.5；CD26)是在多种组织，包括上皮细胞和白细胞亚类上表达的脯氨酸后(较小程度为丙氨酸后、丝氨酸后或甘氨酸后)切割的丝氨酸蛋白酶。此外，它是在其胞外域显示其活性的膜相关外肽酶。
低分子量二肽基肽酶IV抑制剂的实例为诸如以下的试剂：四氢异喹啉-3-酰胺衍生物、N-取代的2-氰基吡咯和-吡咯烷、N-(N′-取代的甘氨酰)-2-氰基吡咯烷、N-(取代的甘氨酰)-噻唑烷、N-(取代的甘氨酰)-4-氰基噻唑烷、氨基-酰基-二羟硼基-脯氨酰-抑制剂、环丙基稠合的吡咯烷和杂环化合物。在以下文献中描述了二肽基肽酶IV抑制剂：US 6,380,398、US 6,011,155、US 6,107,317、US 6,110,949、US6,124,305、US 6,172,081、WO 95/15309、WO 99/61431、WO 99/67278、WO 99/67279、DE 198 34 591、WO 97/40832、DE 196 16 486 C2、WO 98/19998、WO 00/07617、WO 99/38501、WO 99/46272、WO99/38501、WO 01/68603、WO 01/40180、WO 01/81337、WO 01/81304、WO 01/55105、WO 02/02560和WO 02/14271，本文引用这些文献作参考，特别是有关这些抑制剂、它们的定义、用途和它们地制备。
术语DPIV样酶涉及在结构和/或功能上与DPIV/CD26相关的酶蛋白(Sedo&Malik，Dipeptidyl peptidase IV-like molecules：homologous proteins or homologous activities？Biochimica et BiophysicaActa 2001，36506：1-10)。本质上，这一小组酶在进化过程中涉及从寡肽或多肽的N-末端释放H-Xaa-Pro-二肽和H-Xaa-Ala-二肽。它们表现出共同的特征，即在Pro位置还容纳(accomotate)Ala、Ser、Thr和其它具有小疏水侧链的氨基酸如Gly或Val。水解效力等级为Pro＞Ala＞＞Ser，Thr＞＞Gly、Val。相同的蛋白仅以少量存在，使得仅可以完成Pro后或Ala后切割。虽然蛋白DPIV、DP II、FAPα(Seprase)、DP 6、DP 8和DP 9在结构上相关并表现出高序列同源性，但吸诱素(attractin)是一种特别的功能性DPIV样酶，其特征是类似的活性和抑制模式。
在WO 01/19866、WO 02/04610、WO 02/34900和WO 02/31134中公开了其它DPIV样酶。WO 01/19866公开了一种与DPIV和成纤维细胞激活蛋白(FAP)结构和功能类似的新的人二肽基氨基肽酶(DPP8)。WO 02/34900公开了一种与DPIV和DPP8的氨基酸序列具有显著同源性的新的二肽基肽酶9(DPP9)。WO 02/31134公开了三种DPIV样酶，DPRP1、DPRP2和DPRP3。序列分析揭示，DPRP1与WO 01/19866中公开的DPP8相同，DPRP2与DPP9相同，DPRP3与WO 02/04610中公开的KIAA1492相同。
高血压通常是一种无症状病症(symptomless condition)，其中动脉中的异常高压增大出现问题如中风、动脉瘤、心力衰竭、心肌梗死和肾损伤的危险。对于许多人，高血压一词表明过度紧张、神经质或压力。然而，在医学术语中，高血压指血压升高的病症，而不论其原因。其已经被称为“沉默杀手”，因为其通常很多年不导致症状，直到重要器官被损伤。高血压被定义为静止收缩压平均为140mmHg或更高，静止舒张压平均为90mmHg或更高，或者两种情况均存在。在高血压中，通常收缩压和舒张压均升高。
作为糖尿病的继发效应，控制血压和消化过程的神经受损。这导致血压摆动、吞咽困难和改变的胃肠功能，伴有腹泻发作。此外，作为糖尿病的继发效应，动脉粥样硬化斑在心脏、脑、腿和阴茎中堵塞和阻塞大动脉或中等大小的动脉。小血管壁被损伤，以至于血管不再正常地输送氧并可能渗漏。
高血压的进一步的定义和分类在Merck Manual of MedicalInformation-Home Edition，Merck&Co.，2000中给出。当人的收缩压和舒张压进入不同的类别时，将较高的类别用于分类血压。例如，160/92被分类为2期高血压，而180/120被分类为4期高血压。将心血管问题的危险减至最低的最佳血压为低于120/80mmHg。然而，通常必须对低读数进行评价。
类别 收缩压 舒张压
正常血压 低于130mmHg 低于85mmHg
高正常血压 130～139 85～89
1期(轻微)高血压 140～159 90～99
2期(中度)高血压 160～179 100～109
3期(重度)高血压 180～209 110～119
4期(极重度)高血压 210或更高 120或更高
如果人具有重度或长期的高血压并且不进行治疗，由于脑、眼、心脏和肾的损伤，诸如头痛、疲劳、恶心、呕吐、呼吸短促、不安以及视力障碍的症状出现。有时候，有重度高血压的人发生由脑肿胀而导致的瞌睡甚至昏迷。这种病症称为高血压脑病，需要急诊治疗。
不进行治疗的高血压增加人在较早年龄发生心脏病(如心力衰竭或心肌梗死)、肾衰竭和中风的危险。高血压是中风的最重要的危险因素。高血压也是人可以对其做些工作的心肌梗死的三个主要危险因素之一；其他两个危险因素是吸烟和高血胆固醇水平。
【发明内容】
本发明提供式1-12的DPIV抑制剂及其相应的药学可接受的酸加成盐形式用于降低哺乳动物血压水平或相关疾病的新用途。
缺乏DPIV酶活性和表达的突变体F344大鼠中外肽酶DPIV表达减少和DPIV样活性缺乏导致血压降低。测试了缺乏DPIV酶活性的突变体F344次代品系和野生型样F344。两周内通过渗透性小型真空泵长期胃内灌输异亮氨酰氰基吡咯烷TFA和异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐剂量依赖性地降低大鼠的血压。因此，通过使用不同的DPIV抑制剂(异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐；异亮氨酰氰基吡咯烷TFA)进行长期治疗，血压得以降低，这提示两种不同的DPIV抑制剂/配体的保护样种类作用。异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐和异亮氨酰氰基吡咯烷TFA可能通过间接地介导相应作用的DPIV底物水平增加而防止高血压。
本发明涉及一种新方法，在该方法中哺乳动物血中酶二肽基肽酶(DPIV或CD26)的活性，或DPIV样酶活性被特异性酶效应物降低将导致内源的，或外源给予的促胰岛肽(肠降血糖素)、肠抑胃肽/胃抑多肽1-42(GIP1-42)和胰高血糖素样肽-17-36酰胺(GLP-17-36)(或这些肽的类似物)的降解减少。由DPIV和DPIV样酶降解导致的这些肽或它们的类似物的浓度降低将因此而减少或延迟。
作为由DPIV活性降低导致的内源的，或外源给予的肠降血糖素或它们的类似物的稳定性增加的结果，它们的促胰岛作用得以增强，导致从胰岛分泌胰岛素的强力刺激，以及更快速地从血中除去葡萄糖。结果，葡萄糖耐量得以改善。
作为结果，由长期升高的循环葡萄糖浓度导致的与糖尿病相关的代谢异常，包括糖和脂质代谢异常、糖尿和糖尿病酮症酸中毒，以及慢性改变如微血管和大血管疾病、多神经病和糖尿病视网膜病变得以预防或缓解，特别是高血压水平得以降低。
本发明是一种降低升高的血糖浓度和升高的血压水平的新方法。其简单、可商业使用，并且适用于治疗，特别是人的由升高的或异常的血糖和/或血压水平导致的疾病的治疗。
【附图说明】
参照附图可以对本发明有更进一步的理解，其中：
图1显示DPIV催化的GIP1-42(a)和GLP-7-36(b)的水解的MALDI-TOF分析以及异亮氨酰噻唑烷对它们的抑制。
图2显示在DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷的存在下，体内GLP-1代谢产物的血清存在的HPLC分析。
图3显示DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷对十二指肠内葡萄糖刺激的大鼠的不同血液参数的影响。
图4显示用DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷长期口服治疗肥胖(fa/fa)VDF朱克鼠(Zucker rat)在12周的药物施用期间对禁食血糖的影响。
图5用DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷长期治疗肥胖(fa/fa)VDF朱克鼠在8周的药物施用内对收缩血压的影响(使用尾套法(tail-cuffprocedure)测量收缩血压)。
图6显示分别口服给予5mg/kg、15mg/kg、50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰吡咯烷和安慰剂后，在糖尿病朱克鼠中血糖水平的剂量依赖性降低；
图7显示分别口服给予5mg/kg、15mg/kg、50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰噻唑烷和安慰剂后，在糖尿病朱克鼠中血糖水平的剂量依赖性降低；
图8显示在将谷氨酰胺酰噻唑烷口服给予威斯塔鼠(Wistar rat)后发现的降解产物焦谷氨酰胺酰噻唑烷的化学结构；以及
图9显示在将谷氨酰胺酰噻唑烷口服给予肥胖威斯塔鼠后获得的大鼠血浆提取物的色谱图。在2.95分钟处的峰代表谷氨酰胺酰噻唑烷，而在6.57分钟处的峰代表焦谷氨酰胺酰噻唑烷。
具体实施方案
本发明的目的是一种降低血糖和/或血压水平的简单的新方法，其中由酶二肽基肽酶IV(DPIV或CD26)或DPIV样酶的效应物诱导的哺乳动物血中这些酶活性的降低将导致内源(或外源给予的)促胰岛肽肠抑胃肽1-42(GIP1-42)和胰高血糖素样肽酰胺-17-36(GLP-17-36)(或这些肽的类似物)的降解减少。通常由DPIV和DPIV样酶降解导致的这些肽或它们的类似物的浓度降低将因此而减少或延迟。
本发明基于以下重大发现，即二肽基肽酶IV(DPIV或CD26)或DPIV样酶在哺乳动物体内的酶活性降低导致改善的葡萄糖耐量和高血压的降低。
我们观察到：
1.二肽基肽酶IV(DPIV或CD26)或DPIV样酶活性的降低导致葡萄糖刺激的内源释放的或外源给予的肠降血糖素(或它们的类似物)稳定性增加，结果是给予DPIV或DPIV样蛋白的效应物可以用于控制循环中的肠降血糖素降解。
2.肠降血糖素(或它们的类似物)的增加的生物稳定性导致胰岛素反应的改变。
3.由二肽基肽酶IV(DPIV或CD26)或DPIV样酶减少导致的循环肠降血糖素的增加的稳定性导致随后的胰岛素诱导的葡萄糖处置的改变，表明葡萄糖耐量可以通过施用DPIV效应物而得到改善。
4.高血压水平得到降低。
因此，本发明涉及二肽基肽酶IV(DPIV)或DPIV样酶活性的效应物用于降低如在表现临床不适的基础和餐后高血糖的哺乳动物中发现的升高的血糖和/或血压水平的用途。更具体而言，本发明的用途的特征在于在哺乳动物代谢病理异常如糖尿、高脂血症、糖尿病酸中毒、糖尿病视网膜病变和糖尿病的预防或缓解中给予DPIV或DPIV样酶活性的效应物。在进一步优选的实施方案中，本发明涉及用于降低如在表现临床不适的基础和餐后高血糖的哺乳动物中发现的升高的血糖水平的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物治疗有效量的二肽基肽酶IV(DPIV)或DPIV样酶活性的效应物。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及在降低如在表现临床不适的基础和餐后高血糖的哺乳动物中发现的升高的血糖和/或血压水平的方法中使用的二肽基肽酶IV(DPIV)或DPIV样活性的效应物。
可以在降低哺乳动物中DPIV和DPIV样蛋白浓度或酶活性的药物配方如酶抑制剂、底物、假底物、DPIV基因表达抑制剂、靶酶蛋白的结合蛋白或抗体或者如这些不同化合物的组合中采用本发明给予的DPIV和DPIV样酶的效应物。本发明的效应物是，例如，DPIV抑制剂如二肽衍生物或二肽模拟物如丙氨酰pyrolidide、异亮氨酰噻唑烷以及假底物N-缬氨酰脯氨酰、O-苯甲酰羟胺。这些化合物可以从文献[DEMUTH，H.-U.，Recent developments in the irreversibleinhibition of serine and cysteine proteases，J.Enzyme Inhibition 3，249(1990)]中了解或者可以根据文献中描述的方法合成。
本发明的方法是降低哺乳动物血中升高的循环葡萄糖浓度和降低高血压水平的新方法。
本发明涉及二肽基肽酶IV(DPIV)抑制领域，更具体地说，涉及DPIV和DPIV样酶活性抑制剂用于降低哺乳动物高血压水平或相关疾病的新用途，以及含有所述化合物的药物组合物。
与本领域中其它建议的方法相比，本发明特别地提供一种使用低分子量二肽基肽酶IV抑制剂的可以口服实现的疗法。本发明代表一种用于降低哺乳动物血压水平或相关疾病的新方法。它使用方便，可在商业上使用，并适用于治疗方案，特别是关于人疾病的治疗方案。
在这些发现的基础上，根据本发明，研究DPIV表达和酶活性在血压中的作用揭示，口服给予DPIV抑制剂导致血压水平降低。
本发明的目的是开发二肽基肽酶IV抑制剂和/或配体，它们表现出高生物利用度。在另一个优选的实施方案中，本发明提供DPIV抑制剂，该抑制剂在靶组织中具有可精确预测的活性时间。
可口服利用的低分子量试剂的实例为通式A-B-C的稳定和不稳定的二肽基肽酶IV抑制剂的前药，其中A代表氨基酸，B代表A和C之间的化学键或氨基酸，而C代表不稳定或稳定的二肽基肽酶IV抑制剂。在WO 99/67278和WO 99/67279中描述了它们，本文引用所述文献关于条件、定义、使用和生产所述前药的教导作为参考。尤其是本文引用A、B和C的详细定义作为参考。
本发明涉及一种新方法，其中酶二肽基肽酶(DPIV或CD 26)活性或DPIV样酶活性的降低，或DPIV特异性配体的结合在由酶效应物诱导的哺乳动物器官中发挥有益作用，并导致哺乳动物血压降低。结果是具有升高血压的哺乳动物将受益于用DPIV和DPIV样酶活性抑制剂进行的治疗。
本发明的方法和用途包括使用这些酶的抑制剂或配体，通过抑制DPIV或相关酶活性来预防哺乳动物，包括人的升高的血压或降低血压和相关疾病。DPIV抑制剂的口服给予在大部分情况下可能是优选的。
现在将参考以下实施例例示本发明，这些实施例集中于DPIV样活性和/或结合降低血压和血糖的作用。
在一个说明性实施方案中，本发明涉及二肽样化合物和类似于二肽化合物的化合物及其盐的用途，这些化合物由氨基酸和噻唑烷或吡咯烷基团形成，在下文中称为二肽样化合物。优选氨基酸和噻唑烷或吡咯烷基团用酰胺键连接。
特别适于本发明目的的是二肽化合物，其中的氨基酸优选地选自天然氨基酸，如亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸。
根据本发明使用的二肽样化合物在10μM的(二肽化合物)浓度下将二肽基肽酶IV活性或DPIV类似酶活性降低至少10％，特别是至少40％。通常活性降低至少60％或至少70％也是需要的。优选的效应物也可能表现出活性降低最大20％或30％。
优选的化合物为N-缬氨酰脯氨酰、O-苯甲酰羟胺、丙氨酰吡咯烷、异亮氨酰噻唑烷如L-别异亮氨酰噻唑烷、L-苏型异亮氨酰吡咯烷和它们的盐，特别是延胡索酸盐，和L-别异亮氨酰吡咯烷和它的盐。特别优选的化合物为式1和2的谷氨酰胺酰吡咯烷和谷氨酰胺酰噻唑烷：
进一步优选的化合物在表1中给出。
二肽样化合物的盐可以1∶1或2∶1的二肽(类似物)组分与盐组分的摩尔比存在。例如，这种盐为(Ile-Thia)2延胡索酸。
表1：进一步优选的二肽化合物的结构 效应物 H-Asn-吡咯烷 H-Asn-噻唑烷 H-Asp-吡咯烷 H-Asp-噻唑烷 H-Asp(NHOH)-吡咯烷 H-Asp(NHOH)-噻唑烷 H-Glu-吡咯烷 H-Glu-噻唑烷 H-Glu(NHOH)-吡咯烷 H-Glu(NHOH)-噻唑烷 H-His-吡咯烷 H-His-噻唑烷 H-Pro-吡咯烷 H-Pro-噻唑烷 H-Ile-azididine H-Ile-吡咯烷 H-L-allo-Ile-噻唑烷 H-Val-吡咯烷 H-Val-噻唑烷
在另一个优选的实施方案中，本发明提供式3的肽化合物用于竞争性调节二肽基肽酶IV催化的用途：
其中
A、B、C、D和E独立地为任何氨基酸部分，包括蛋白原氨基酸、非蛋白原氨基酸、L-氨基酸和D-氨基酸，且其中E和/或D可以不存在。
涉及式(3)的进一步条件：
A为除D-氨基酸之外的氨基酸；
B为选自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮杂环丁烷-(2)-羧酸(acetidine-(2)-carboxylic acid)和2-哌啶酸的氨基酸，
C为除Pro、Hyp、氮杂环丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸和N-烷基化的氨基酸例如N-甲基缬氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸，
D为任何氨基酸或不存在，且
E为任何氨基酸或不存在，
或者
C为除Pro、Hyp、氮杂环丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基缬氨酸和肌氨酸、D-氨基酸之外的任何氨基酸；
D为选自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮杂环丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的任何氨基酸，且
E为除Pro、Hyp、氮杂环丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基缬氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸。
可以用于本发明的氨基酸的实例为L和D-氨基酸、N-甲基-氨基酸；allo-和threo-形式的Ile和Thr，例如它们可以是α-、β-或ω-氨基酸，其中优选α-氨基酸。
整个权利要求书和说明书中的氨基酸的实例为：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)和半胱氨酸(Cys)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、羟脯氨酸(Hyp)、β-丙氨酸(β-Ala)、2-氨基辛酸(Aoa)、氮杂环丁烷-(2)-羧酸(azetidine-(2)-carboxylic acid，Ace)、2-哌啶酸(Pip)、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸等、α-氨基异丁酸(Aib)、肌氨酸(Sar)、鸟氨酸(Om)、瓜氨酸(Cit)、高精氨酸(Har)、叔丁基丙氨酸(叔丁基-Ala)、叔丁基甘氨酸(叔丁基-Gly)、N-甲基异亮氨酸(N-MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)、环己基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、磺基丙氨酸(Cya)和甲硫氨酸亚砜(MSO)、乙酰-Lys，修饰的氨基酸如磷酰-丝氨酸(Ser(P))、苄基-丝氨酸(Ser(Bzl))和磷酰-酪氨酸(Tyr(P))、2-氨基丁酸(Abu)、氨基乙基半胱氨酸(AECys)、羧甲基半胱氨酸(Cmc)、脱氢丙氨酸(Dha)、脱氢氨基-2-丁酸(Dhb)、羧基谷氨酸(Gla)、高丝氨酸(Hse)、羟基赖氨酸(Hyl)、顺式羟脯氨酸(cisHyp)、反式羟脯氨酸(transHyp)、异缬氨酸(Iva)、焦谷氨酸(Pyr)、正缬氨酸(Nva)、2-氨基苯甲酸(2-Abz)、3-氨基苯甲酸(3-Abz)、4-氨基苯甲酸(4-Abz)、4-(氨基甲基)苯甲酸(Amb)、4-(氨基甲基)环己烷羧酸(4-Amc)、青霉胺(Pen)、2-氨基-4-氰基丁酸(Cba)、环烷烃羧酸。
ω-氨基酸的实例为，例如：5-Ara(氨基戊酸)、6-Ahx(氨基己酸)、8-Aoc(氨基辛酸)、9-Anc(氨基壬酸)、10-Adc(氨基癸酸)、11-Aun(氨基十一酸)、12-Ado(氨基十二酸)。
其它氨基酸为：2，3-二氢化茚基甘氨酸(Igl)、二氢吲哚-2-羧酸(Idc)、八氢吲哚-2-羧酸(Oic)、二氨基丙酸(Dpr)、二氨基丁酸(Dbu)、萘基丙氨酸(1-Nal)、(2-Nal)、4-氨基苯丙氨酸(Phe(4-NH2))、4-苯甲酰苯丙氨酸(Bpa)、二苯丙氨酸(Dip)、4-溴苯丙氨酸(Phe(4-Br))、2-氯苯丙氨酸(Phe(2-Cl))、3-氯苯丙氨酸(Phe(3-Cl))、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、3，4-氯苯丙氨酸(Phe(3，4-Cl2))、3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、3，4-氟苯丙氨酸(Phe(3，4-F2))、五氟苯丙氨酸(Phe(F5))、4-胍基苯丙氨酸(Phe(4-胍基))、高苯丙氨酸(hPhe)、3-jodo苯丙氨酸(Phe(3-J))、4-jodo苯丙氨酸(Phe(4-J))、4-甲基苯丙氨酸(Phe(4-Me))、4-硝基苯丙氨酸(Phe-4-NO2))、联苯基丙氨酸(Bip)、4-膦酰基甲基苯丙氨酸(Pmp)、环己基甘氨酸(Ghg)、3-吡啶基丙氨酸(3-Pal)、4-吡啶基丙氨酸(4-Pal)、3，4-脱氢脯氨酸(A-Pro)、4-酮脯氨酸(Pro(4-keto))、硫代脯氨酸(Thz)、六氢异烟酸(isonipecotic acid)(lnp)、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)、炔丙基甘氨酸(Pra)、6-羟基正亮氨酸(NU(6-OH))、高酪氨酸(hTyr)、3-jodo酪氨酸(Tyr(3-J))、3，5-二jodo酪氨酸(Tyr(3，5-J2))、d-甲基-酪氨酸(Tyr(Me))、3-NO2-酪氨酸(Tyr(3-NO2))、磷酸酪氨酸(Tyr(PO3H2))、烷基甘氨酸、1-氨基茚满-1-羧酸、2-氨基茚满-2-羧酸(Aic)、4-氨基-甲基吡咯-2-羧酸(Py)、4-氨基-吡咯烷-2-羧酸(Abpc)、2-氨基四氢萘-2-羧酸(Atc)、二氨基乙酸(Gly(NH2))、二氨基丁酸(Dab)、1，3-二氢-2H-isoinole-羧酸(Disc)、高环己基丙氨酸(hCha)、高苯丙氨酸(hPhe或Hof)、反式-3-苯基-氮杂环丁烷-2-羧酸、4-苯基-吡咯烷-2-羧酸、5-苯基-吡咯烷-2-羧酸、3-吡啶基丙氨酸(3-Pya)、4-吡啶基丙氨酸(4-Pya)、苯乙烯基丙氨酸、四氢异喹啉-1-羧酸(Tiq)、1，2，3，4-四氢去甲哈尔满(norharmane)-3-羧酸(Tpi)、β-(2-thienryl)-丙氨酸(Tha)。
编码在遗传密码中的氨基酸的氨基酸置换也包括在本发明范围内的肽化合物中，且可以归类在这种一般方案内。
蛋白原氨基酸定义为来源于天然蛋白的α-氨基酸。非蛋白原氨基酸定义为所有其它氨基酸，这些氨基酸不是常见的天然蛋白的构件。
所得的肽可以合成为游离的C-末端酸或合成为C-末端酰胺形式。游离酸肽或酰胺可以通过侧链修饰而改变。这些侧链修饰包括，例如但不限于，高丝氨酸形成、焦谷氨酸形成、二硫键形成、天冬酰胺或谷氨酰胺残基的脱酰胺、甲基化、叔丁基化、叔丁氧羰基化、4-甲基苄基化、硫代茴香基化(thioanysilation)、硫代羟甲苯基化(thiocresylation)、苄氧基甲基化、4-硝基苯基化、苄氧羰基化、2-硝基苯甲酰化、2-硝基亚磺酰化、4-甲苯磺酰化、五氟苯基化、二苯基甲基化、2-氯苄氧羰基化、2，4，5-三氯苯基化、2-溴苄氧羰基化、9-芴基甲氧羰基化、三苯基甲基化、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰化、羟基化、甲硫氨酸氧化、甲酰化、乙酰化、茴香基化、苄基化、苯甲酰化、三氟乙酰化、天冬氨酸或谷氨酸羧化、磷酰化、硫酸化、半胱氨酰化、用戊糖、脱氧己糖、己糖胺、己糖或N-乙酰己糖胺糖基化(glycolysation)、法呢基化、肉豆蔻酰化、生物素基化、棕榈酰化、硬脂酰化、香叶基香叶基化、谷胱甘肽基化、5′-腺苷基化、ADP-核糖基化、用N-羟乙酰神经氨酸、N-乙酰神经氨酸、吡哆醛磷酸、硫辛酸、4′-磷酸泛酰巯基乙胺或N-羟基琥珀酰亚胺修饰。
在式(3)的化合物中，根据标准命名法，氨基酸部分A、B、C、D和E分别以常规方式通过酰胺键与相邻部分连接，从而使氨基酸(肽)的氨基末端(N-末端)在左边，而氨基酸(肽)的羧基末端(C-末端)在右边。
在本申请人的发明之前，已知的体外脯氨酸特异性丝氨酸蛋白酶二肽基肽酶IV的肽底物为三肽Diprotin A(Ile-Pro-Ile)、Diprotin B(Val-Pro-Leu)和Diprotin C(Val-Pro-Ile)。申请人已意外地发现本文以上和以下公开的药理学剂量的化合物担当哺乳动物的体内二肽基肽酶IV底物，通过竞争性催化降低血压并缓解哺乳动物代谢病理异常如糖尿、高脂血症、代谢性酸中毒和糖尿病。
用作二肽基肽酶IV和DPIV样酶调节剂的本发明的特别优选的化合物包括显示DPIV结合的Ki值，在静脉内和/或口服给予威斯塔鼠后在体内有效地抑制DPIV的化合物。
进一步优选的化合物为式4的肽基酮：
其中
A选自
X1为H或酰基或氧羰基基团，包括所有氨基酸和肽残基，
X2为H、n＝2-4的-(CH)n-NH-C5H3N-Y或C5H3N-Y(二价吡啶基残基)，而Y选自H、Br、Cl、I、NO2或CN，
X3为H或苯基或吡啶基残基，未被取代或被一、二或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基残基取代，
X4为H或苯基或吡啶基残基，未被取代或被一、二或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基残基取代，
X5为H或烷基、烷氧基或苯基残基，
X6为H或烷基残基；
对于n＝1
X选自H、OR2、SR2、NR2R3、N+R2R3R4，其中
R2代表酰基残基，所述酰基残基未被取代或被一、二或更多个烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基取代，或者R2代表所有氨基酸和肽残基，或烷基残基，它们未被取代或被一、二或更多个烷基、环烷基、芳基和杂芳基残基取代，
R3代表烷基和酰基官能团，其中R2和R3可以是饱和与不饱和碳环或杂环结构的一种或多种环结构的部分，
R4代表烷基残基，其中R2和R4或R3和R4可以是饱和与不饱和碳环或杂环结构的一种或多种环结构的部分，
对于n＝0
X选自
其中
B代表O、S、NR5，其中R5为H、亚烷基或酰基，
C、D、E、F、G、H独立地选自不饱和与饱和烷基、氧烷基、硫烷基、氨基烷基、羰基烷基、酰基、氨基甲酰基、芳基和杂芳基残基；且
对于n＝0和n＝1
Z选自H、C1-C9的支链或单链烷基残基或C2-C9的支链或单链链烯基残基、C3-C8的环烷基残基、C5-C7的环烯基残基、芳基或杂芳基残基，或者选自所有天然氨基酸或其衍生物的所有侧链的侧链。
而且，根据本发明，式5、6、7、8、9、10和11的化合物，包括它们的所有立体异构体和药学可接受的盐得到公开并可以使用：
其中
R1为H、支链或直链C1-C9烷基残基、支链或直链C2-C9链烯基残基、C3-C8环烷基、C5-C7环烯基、芳基残基或杂芳基残基或者天然氨基酸或其衍生物的侧链；
R3和R4选自H、羟基、烷基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基或卤素，
A为H或碳酸的等排物(isoster)，如选自CN、SO3H、CONHOH、PO3R5R6、四唑、酰胺、酯、酸酐、噻唑和咪唑的官能团；
B选自
其中
R5为H、n＝2-4的-(CH)n-NH-C5H3N-Y和C5H3N-Y(二价吡啶基残基)，Y＝H、Br、Cl、I、NO2或CN，
R10为H、酰基、氧羰基或氨基酸残基，
W为H或苯基或吡啶基残基，未被取代或被一、二或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基残基取代，
W1为H、烷基、烷氧基或苯基残基，
Z为H或苯基或吡啶基残基，未被取代或被一、二或更多个烷基、烷氧基、卤素、硝基、氰基或羧基残基取代，
Z1为H或烷基残基，
D为可以未被取代或被一、二或更多个烷基取代的环状C4-C7烷基、C4-C7链烯基残基或环状4-7元杂烷基或环状4-7元杂烯基残基，
X2为O、NR6、N+(R7)2或S，
X3至X12独立地选自CH2、CR8R9、NR6、N+(R7)2、O、S、SO和SO2，包括所有饱和与不饱和结构，
R6、R7、R8、R9独立地选自H、支链或直链C1-C9烷基残基、支链或直链C2-C9链烯基残基、C3-C8环烷基残基、C5-C7环烯基残基、芳基或杂芳基残基，
附加条件是：
式6：如果A不为H，则X6为CH，
式7：如果A不为H，则X10为C，
式8：如果A不为H，则X7为CH，
式9：如果A不为H，则X12为C。
在整个说明书和权利要求书中，表述“酰基”可以指C1-20酰基残基，优选C1-8酰基残基，特别优选C1-4酰基残基，“环烷基”可以指C3-12环烷基残基，优选C4、C5或C6环烷基残基，“碳环”可以指C3-12碳环残基，优选C4、C5或C6碳环残基。“杂芳基”定义为芳基残基，其中1-4，优选1、2或3个环原子被杂原子如N、S或O取代。“杂环”定义为环烷基残基，其中1、2或3个环原子被杂原子如N、S或O取代。“肽”选自二肽至十肽，优选二肽、三肽、四肽和五肽。用于形成“肽”的氨基酸可以选自以上列出的氨基酸。
由于蛋白在体内的广泛分布和涉及DPIV、DPIV活性和DPIV相关蛋白的多种机制，采用DPIV抑制剂的全身治疗(肠内或肠胃外给药)可能导致一系列不期望的副作用。
而且要解决的问题是提供可以用于靶向影响局部有限的病理生理过程和生理过程的化合物。特别地，本发明的问题在于获得DPIV或DPIV类似活性的局部有限的抑制，用于靶向干预局部活性底物的活性的调节。
根据本发明，通过通式(12)的化合物解决此问题：
其中
A为在侧链中具有至少一个官能团的氨基酸，
B为与A的侧链的至少一个官能团共价连接的化合物，
C为酰胺连接于A的噻唑烷、吡咯烷、氰基吡咯烷、羟脯氨酸、脱氢脯氨酸或哌啶基。
这些化合物可以，例如用于通过作用于血管内皮中的DPIV或DPIV样酶来降低血压。
根据本发明的一个优选的实施方案，所用的药物组合物包含至少一种通式(12)的化合物和至少一种适于作用部位的常规辅剂。
优选A为α-氨基酸，特别是在侧链中具有一、二或更多个官能团的天然α-氨基酸，优选苏氨酸、酪氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸。
优选B为链长度达20个氨基酸的寡肽、摩尔质量达20000g/mol的聚乙二醇、任选地取代的具有8-50个C原子的有机胺、酰胺、醇、酸或芳族化合物。
在整个说明书和权利要求书中，表述“烷基”可以指C1-50烷基，优选C6-30烷基，特别是C8-12烷基；例如烷基可以是甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基。在表述“烷氧基”中的表述“烷”，在表述“烷酰基”中的“烷”的定义与“烷基”的定义相同；芳族化合物优选为取代或任选地未被取代的苯基、苄基、萘基、联苯基或蒽基，它们优选具有至少8个C原子；表述“链烯基”可以指C2-10链烯基，优选C2-6链烯基，它们在任何期望的位置具有双键并可以是取代或未被取代的；表述“炔基”可以指C2-10炔基，优选C2-6炔基，它们在任何期望的位置具有叁键并可以是取代或未被取代的；表述“取代的”或取代基可以指被一个或多个，优选一个或两个烷基、链烯基、炔基、一价或多价酰基、烷酰基、烷氧烷酰基或烷氧烷基的任何期望的取代；上述取代基进而可以具有一个或多个(但优选为零个)烷基、链烯基、炔基、一价或多价酰基、烷酰基、烷氧烷酰基或烷氧烷基作为侧基；各自具有8-50个C原子，优选10-20个C原子的有机胺、酰胺、醇或酸可以具有式(烷基)2N-或烷基-NH-、-CO-N(烷基)2或-CO-NH(烷基)、-烷基-OH或-烷基-COOH。
尽管式(12)的化合物具有延伸的侧链官能团，它仍可以与酶二肽基肽酶Ⅳ和类似酶的活性中心结合，但不再被肽转运蛋白PepT1活性转运。作为结果的本发明的化合物的转运能力降低或大大受限导致DPIV和DPIV样酶活性的局部或部位定向的抑制。
根据本发明使用的式(12)的化合物或其它化合物和前药可以分别以消旋体的形式或光学纯化合物的形式，优选以式(12)的A部分的L-threo或L-allo的形式存在或使用。
因此，通过延伸/扩展侧链修饰，例如超出7个碳原子数目的侧链修饰，可能实现转运能力的大幅降低(参见实施例12)。表12.1中的实例清楚地表明，通过增加侧链的空间大小，物质的转运能力降低。根据本发明，通过空间和立体延伸侧链，例如超过一取代的苯基、羟基胺基或氨基酸残基的原子基团大小的侧链，可能改变或抑制靶物质的转运能力。
根据本发明，式(12)的化合物以部位特异性方式抑制哺乳动物体内的DPIV或DPIV样酶活性。因此可能有效地影响局部生理和病理生理症状(炎症、银屑病、关节炎、自体免疫疾病、变态反应、癌、转移、血管内皮中的血压)，同时大幅降低副作用。
优选的式(12)的化合物是，链长度为3-15，特别是4-10个氨基酸的寡肽，和/或摩尔质量为至少250g/mol，优选至少1500g/mol和达15000g/mol的聚乙二醇，和/或具有至少12个C原子，优选达30个C原子的任选地取代的有机胺、酰胺、醇、酸或芳族化合物。
可以将本发明的化合物转化为酸加成盐，特别是药学可接受的酸加成盐，或以上述形式使用。药学可接受的盐一般采取其中氨基酸碱基侧链被无机或有机酸质子化的形式。代表性的有机或无机酸包括盐酸、氢溴酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、苦杏仁酸、甲磺酸、羟基乙磺酸、苯磺酸、草酸、双羟萘酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、己糖酸或三氟乙酸。式(1)-(12)的化合物的所有药学可接受的酸加成盐形式均包括在本发明的范围内。
考虑到游离化合物及其盐形式的化合物之间的紧密关系，不管本文何时提及化合物，它还意指相应的盐，条件是这种盐是可能的或在这些情况下是合适的。
本发明在其范围内还包括本发明的化合物的前药。一般而言，这种前药是这些化合物的可以在体内容易地转化为期望的治疗活性化合物的官能衍生物。因此在这些情况下，本发明的用途包括用一种或多种所要求的化合物的前药形式治疗所述的多种疾病，所述前药在给予受试者后在体内转化为上述化合物。例如在以下文献中描述了用于选择和制备适宜的前药衍生物的常规方法：“Design of Prodrugs”，ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985和专利申请DE 198 28 113和DE 19828 114，本文引用所述文献作为参考。
当根据本发明的化合物或前药具有至少一个手性中心时，它们可以相应地以消旋体存在。当这些化合物或前药具有两个或更多个手性中心时，它们还可以以非对映体存在。应该理解，所有这些异构体及其混合物都包括在本发明的范围内。而且，所述化合物或前药的某些结晶形式可以以多晶型物存在并同样包括在本发明内。此外，某些所述化合物可以与水(即水合物)或常规有机溶剂形成溶剂化物，而这些溶剂化物也包括在本发明的范围内。
所述化合物，包括它们的盐，也可以它们的水合物的形式获得，或者包含用于它们的结晶的其它溶剂。
如上述，本发明的化合物和前药，以及它们相应的药学可接受的酸加成盐形式用于抑制DPIV和DPIV样酶活性。如实施例7和8所述，可以使用DPIV活性实验体外测定Ki值和IC50值，从而证明本发明的化合物和前药，以及它们相应的药学可接受的酸加成盐形式抑制DPIV和DPIV样酶活性的能力。
如实施例11所述，可以通过口服或血管内给予威斯塔鼠来证明本发明的化合物和它们相应的药学可接受的酸加成盐形式体内抑制DPIV的能力。本发明的化合物在口服和血管内给予威斯塔鼠后在体内抑制DPIV活性。
DPIV存在于多种哺乳动物器官和组织例如肠刷状缘(GutschmidtS.等人，“In situ”-measurements of protein contents in the brush borderregion along rat jejunal villi and their correlations with four enzymeactivities，Histochemistry 1981，72(3)，467-79)、外分泌上皮细胞、肝细胞、肾小管、内皮、肌成纤维细胞(Feller A.C.等人，A monoclonalantibody detecting dipeptidyl peptidase IV in human tissue.VirchowsArch.A.Pathol.Anat.Histopathol.1986；409(2)：263-73)、神经细胞、某些表面上皮，例如输卵管、子宫和精囊(vesicular gland)的外侧膜，存在于腔细胞质例如精囊上皮中，并存在于布伦纳腺的粘液细胞中(Hartel S.等人，Dipeptidyl peptidase(DPP)IV in rat organs.Comparisonof immunohistochemistry and active histochemistry，Histochemistry 1988；89(2)：151-61)、生殖器官例如附睾尾和壶腹、精囊和它们的分泌物中(Agrawal&Vanha-Perttula，Dipeptidyl peptidases in bovinereproductive organs and secretions.Int.J.Androl.1986，9(6)：435-52)。在人血清中存在二肽基肽酶的两种分子形式(Krepela E.等人，Demonstration of two molecular forms of dipeptidyl peptidase IV innormal human serum.Physiol.Bohemoslov.1983，32(6)：486-96)。血清高分子量形式的DPIV在活化的T细胞表面表达(Duke-Cohan J.S.等人，Serum high molecular weight dipeptidyl peptidase IV(CD26)issimilar to a novel antigen DPPT-L released from activated T cells.J.Immunol.1996，156(5)：1714-21)。
本发明的化合物和前药，以及它们相应的药学可接受的酸加成盐形式能够在体内抑制DPIV。在本发明的一个实施方案中，来自所有哺乳动物组织和器官的DPIV以及仍未发现的DPIV的所有分子形式、同系物和表位都包括在本发明的范围内。
在少数的脯氨酸特异性蛋白酶组中，最初相信DPIV是对作为多肽链的氨基末端倒数第二位残基的脯氨酸具有特异性的唯一膜结合酶。但是，最近已鉴定了其它分子，甚至结构上与DPIV不同源但具有相应的酶活性的分子。目前鉴定的DPIV样酶例如成纤维细胞激活蛋白α、二肽基肽酶IVβ、二肽基氨基肽酶样蛋白、N-乙酰化的α连接的酸性二肽酶、休眠细胞脯氨酸二肽酶、二肽基肽酶II、吸诱素和二肽基肽酶IV相关蛋白(DPP 8)，且它们描述在以下的综述文章中：Sedo&Malik(Sedo&Malik，Dipeptidyl peptidase IV-like molecules：homologous proteins or homologous activities？Biochimica et BiophysicaActa 2001，36506：1-10)。其它DPIV样酶公开在WO 01/19866、WO02/04610和WO 02/34900中。WO 01/19866公开了结构和功能类似于DPIV和成纤维细胞激活蛋白(FAP)的新的人二肽基氨基肽酶(DPP8)。WO 02/04610的二肽基肽酶V样酶在本领域中是已知的。在Gene Bank数据库中，此酶注册为KIAA1492。在本发明的另一个优选的实施方案中，来自所有哺乳动物组织和器官的具有DPIV样酶活性的蛋白，以及仍未发现的蛋白的所有分子形式、同系物和表位都包括在本发明的范围内。
本发明的化合物和前药，以及它们相应的药学可接受的酸加成盐形式抑制DPIV样酶的能力可以使用实施例9所述的体外测定Ki值的酶活性实验证明。例如测定本发明的化合物抗猪二肽基肽酶II的Ki值为：对于谷氨酰胺酰吡咯烷，Ki＝8.52*10-5M±6.33*10-6M；而对于谷氨酰胺酰噻唑烷，Ki＝1.07*10-5M±3.81*10-7M。
在另一个实施方案中，本发明的化合物和前药，以及它们相应的药学可接受的酸加成盐形式仅有低的(可能没有)对非DPIV和非DPIV样脯氨酸特异性酶的抑制活性。如在实施例10中所述，例如用谷氨酰胺酰噻唑烷和谷氨酰胺酰吡咯烷，没有发现二肽基肽酶I和脯氨酰寡肽酶的抑制。两种化合物对氨酰基脯氨酸二肽酶的效力均显著低于对DPIV的效力。测定对氨酰基脯氨酸二肽酶的IC50值为：对于谷氨酰胺酰噻唑烷，IC50＞3mM；而对于谷氨酰胺酰吡咯烷，IC50＝3.4*10-4M±5.63*10-5。
本发明提供预防或治疗需要其的受试者中由DPIV或DPIV样酶活性的调节介导的病症的方法，所述方法包括以有效治疗所述病症的量和剂量方案给予本发明的任何化合物或其药物组合物。此外，本发明包括本发明的化合物和前药以及它们相应的药学可接受的酸加成盐形式用于制备预防或治疗受试者的由DPIV活性的调节介导的病症的药物的用途。所述化合物可以通过任何常规给药途径给予患者，包括但不限于，静脉内、口服、皮下、肌内、皮内、肠胃外给药及其组合。
在另一个说明性实施方案中，本发明提供式1-12的化合物和它们相应的药学可接受的前药和酸加成盐形式在药物组合物中的配方。
本文所用的术语“受试者”指动物，优选哺乳动物，最优选人，它是治疗、观察或实验的对象。
本文所用的术语“治疗有效量”意指研究者、兽医、医生或其它临床医生寻求的在组织系统、动物或人中引起生物或药物反应，包括缓解在治疗的疾病或病症的症状的活性化合物或药学试剂的量。
本文所用的术语“组合物”意指包括含有治疗有效量的所要求的化合物的产品和任何直接或间接地由所要求的化合物的组合得到的产品。
为了制备本发明所用的药物组合物，首先根据常规药物复合技术，将作为活性成分的一种或多种式1-12的化合物或它们相应的药学可接受的前药或酸加成盐形式与药物载体混合，所述载体根据给药例如口服或肠胃外给药如肌内给药所需的制剂形式而采用多种形式。在制备口服剂型的组合物中，可以使用任何常规药物介质。因此，对于液体口服制剂如混悬剂、酏剂和溶液剂，适宜的载体和添加剂可以有利地包括水、乙二醇、油、醇、食用香料、防腐剂、着色剂等；对于固体口服制剂如散剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂(gelcap)和片剂，适宜的载体和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于片剂和胶囊剂给药方便，因而它们代表最有利的口服单元剂型，在这种情况下使用固体药物载体。如果需要的话，片剂可以通过标准技术包糖衣或包肠溶衣。对于肠胃外给药，载体通常包含无菌水，虽然也可以包括其它成分，例如用于帮助溶解或用于保存。
也可以制备注射混悬剂，在这种情况下可以使用适宜的液体载体、助悬剂等。本文的药物组合物的每剂量单元，如片剂、胶囊剂、散剂、注射剂、一茶匙量(teaspoonful)等含有转运上述有效剂量所需量的活性成分量。本文的药物组合物的每剂量单元，如片剂、胶囊剂、散剂、注射剂、栓剂、一茶匙量等含有约0.01mg至约1000mg(优选约5至约500mg)，并可以约0.01至约300mg/kg体重/天(优选1-50mg/kg/天)的剂量给药。但是，剂量可以根据患者的需要、在治疗的病症的严重程度和所用的化合物而改变。可以采用每日给药或周期后(post-periodic)给药。通常剂量由医师根据患者的特征、他的/她的病症和期望的治疗效果来调节。
优选这些组合物为诸如以下的单元剂型：片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、无菌肠胃外溶液或混悬剂、计量气雾剂或液体喷雾剂、滴剂、安瓿、自我注射器装置或栓剂；用于口、肠胃外、鼻内、舌下或直肠给药，或者用于吸入或吹入给药。或者，所述组合物可以适于一周一次或一月一次给药的形式存在；例如可以使用活性化合物的不溶性盐，如癸酸盐以提供用于肌内注射的长效制剂。对于制备固体组合物如片剂，将主要的活性成分与药物载体，例如常规片剂成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶和其它药物稀释剂如水理想地混合，以形成含有本发明的化合物或其药学可接受的盐的均匀混合物的固体处方设计前组合物。当说这些处方设计前组合物均匀时，它意指活性成分理想地均匀分散在整个组合物中，从而使组合物可以容易地再分为同等有效的剂型，如片剂、丸剂和胶囊剂。然后可以将这种固体处方设计前组合物再分成含约0.01至约1000mg，优选约5至约500mg的本发明的活性成分的上述类型的单元剂型。
可以有利地将所述新组合物的片剂或丸剂包衣或复合，以提供带来延长作用优点的剂型。例如，片剂和丸剂可以包含内部剂量和外部剂量组分，后者为在前者上的外壳的形式。两组分可以由肠溶层分开，该肠溶层用于抗胃中崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。许多材料可以用作这种肠溶层或包衣，这些材料包括具有诸如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的材料的许多聚合酸。
可以有利地引入本发明的新组合物用于口服或注射的液体剂型包括水溶液、适宜调味的糖浆、含水或油的混悬剂、用食用油如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油调味的乳剂，以及酏剂和类似的药物载体。用于含水混悬剂的适宜的分散剂或助悬剂包括合成和天然树胶如黄芪胶、阿拉伯胶、藻酸盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。
当用于制备本发明的化合物的方法产生立体异构体的混合物时，可以通过常规技术如制备色谱法分离这些异构体。这些化合物可以制成外消旋形式，或者可以通过对映体特异性合成或拆分而制备单独的对映体。例如，可以通过诸如以下的标准技术将所述化合物拆分成它们的组成对映体：与光学活性酸，如(-)-二对甲苯甲酰-d-酒石酸和/或(+)-二对甲苯甲酰-1-酒石酸成盐而形成非对映体对，然后分步结晶并再生游离碱。还可以通过形成非对映体酯或酰胺，然后进行色谱分离并除去手性辅剂而拆分化合物。或者，可以使用手性HPLC柱拆分化合物。
在制备本发明的化合物的任何方法的过程中，可能需要和/或期望保护相关的任何分子上的敏感性或反应性基团。这可以通过常规保护基实现，如在Protective Groups in Organic Chemistry，ed.J.F.W.MeOmie，Plenum Press，1973；和T.W.Greene&P.G.M.Wuts，Protective Groupa in Organic Synthesis，John Wiley&Sons，1991中所述，本文引用这些文献作为参考。这些保护基可以在随后阶段使用本领域中已知的方法方便地除去。
本发明所述的由二肽基肽酶IV和DPIV样酶调节的病症的治疗方法还可以使用包含一种或多种本文定义的化合物和药学可接受的载体的药物组合物来完成。该药物组合物可以含有约0.01mg至1000mg，优选约5至约500mg的一种或多种所述化合物，并可以组成任何适于所选择的给药模式的剂型。载体包括必需的和惰性的药物载体，包括但不限于粘合剂、助悬剂、润滑剂、食用香料、甜味剂、防腐剂、染料和包衣。适于口服给药的组合物包括固体形式，如丸剂、片剂、囊片、胶囊剂(各自包括中等释放、定时释放和延时释放配方)、颗粒剂、散剂和液体形式如溶液剂、糖浆剂、酏剂、乳剂和混悬剂。用于肠胃外给药的形式包括无菌溶液剂、乳剂和混悬剂。
有利地，本发明的化合物可以一次日剂量给药，或者总日剂量可以每天二、三或四次的分开的剂量给药。而且，本发明的化合物可以通过局部应用适宜的鼻内载体，以鼻内形式给药，或通过本领域技术人员已知的透皮药贴给药。为了以透皮递送系统的形式给药，在整个剂量方案中剂量给药当然是连续的而不是间歇的，需要相应地改变剂量强度以获得期望的治疗效果。
更优选地，对于片剂或胶囊剂形式的口服给药，可以将活性药物组分与口服、无毒的药学可接受的惰性载体如乙醇、甘油、水等组合。而且，如果期望或必需的话，还可以将适宜的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂引入此混合物中。适宜的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄芪胶或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶和在本领域中已知的其它化合物。
液体形式适于处在调味助悬剂或分散剂如合成和天然树胶，如黄芪胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等中。对于肠胃外给药，无菌悬浮液和溶液是期望的。当期望静脉内给药时，使用一般含有适宜防腐剂的等渗制剂。
本发明的化合物还可以脂质体递送系统，如小单室载体、大单室载体和多室载体的形式给药。可以使用本领域中良好描述的方法，由多种磷脂如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱形成脂质体。
本发明的化合物还可以与作为靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这些聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺酚、聚羟基乙基天冬酰胺酚或被棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。而且，本发明的化合物可以与一类用于实现药物控释的可生物降解的聚合物偶联，这些聚合物例如聚乙酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲嵌段共聚物。
在需要治疗所述疾病的任何时候，本发明的化合物可以在任何前述组合物中，并根据本领域中确立的剂量方案给药。
产品的日剂量可以在0.01-1.000mg/成人/天的宽范围内变化。对于口服给药，组合物优选以片剂形式提供，所述片剂含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250、500和1000毫克活性成分，用于根据症状调节待治疗患者的剂量。有效量的药物通常以约0.1mg/kg至约300mg/kg体重/天的剂量水平提供。优选范围为约1至约50mg/kg体重/天。这些化合物可以每天1-4次的方案给药。
最佳的给药剂量可以由本领域技术人员容易地确定，且它随所用的特定化合物、给药方式、制剂强度、由于给药方式导致的生物利用度以及疾病的推进而改变。此外，在调节剂量中一般应考虑与特定的治疗患者有关的因素，包括患者年龄、体重、饮食和给药时间。
本发明的化合物或组合物可以在饭前、饭时或饭后服用。如果在饭时服用，可以将本发明的化合物或组合物混入膳食或以上述的单独剂型服用。
实施例
实施例1：二肽样化合物的合成
1.1异亮氨酰噻唑烷盐的一般合成
将Boc-保护的氨基酸BOC-Ile-OH置于乙酸乙酯中并将批料冷却至约-5℃。滴加N-甲基吗啉，在恒温下滴加特戊酰氯(pivalic acid)(实验室规模)或新己酰氯(中试规模)。将反应物搅拌数分钟从而活化。连续滴加N-甲基吗啉(实验室规模)和噻唑烷盐酸盐(实验室规模)，加入噻唑烷(中试规模)。以常规方式，使用盐溶液，以中试规模进行实验室中的处理，用NaOH和CH3COOH溶液纯化批料。
使用HCl/二噁烷(实验室规模)或H2SO4(中试规模)进行BOC保护基的去除。在实验室中用EtOH/乙醚结晶盐酸盐。
在中试规模下，加入NaOH/NH3制备游离胺。将延胡索酸溶于热乙醇，滴加游离胺，(Ile-Thia)2延胡索酸盐(M＝520.71gmol-1)沉淀。通过电泳进行异构体和对映体的分析。
1.2谷氨酰胺酰吡咯烷游离碱的合成
酰化：
将N-苄基-氧羰基谷氨酰胺(2.02g，7.21mmol)溶于35ml THF中并使其变为-15℃。往此混合物中加入CAIBE(氯甲酸异丁酯)(0.937ml，7.21mmol)和4-甲基吗啉(0.795ml，7.21mmol)并将溶液搅拌15min。通过TLC检查混合酸酐的形成(洗脱剂：CHCl3/MeOH：9/1)。暖至-10℃后加入吡咯烷(0.596ml，7.21mmol)。将混合物变为室温并搅拌过夜。
处理：
滤出形成的沉淀并蒸发溶剂。将所得的油置于乙酸乙酯(20ml)中并用饱和硫酸氢钠溶液洗涤，然后用饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤。分离有机层，干燥并蒸发。通过TLC检查所得产物的纯度(洗脱剂：CHCl3/MeOH：9/1)
收率：1.18g，蜡状固体
切割：
将1.18g所得的固体Z保护的化合物溶于40ml无水乙醇中。往溶液中加入约20mg在炭上的Pd(10％，FLUKA)，并在氢气氛下将悬浮液振荡3小时。通过TLC监测反应的进展(洗脱剂：CHCl3/MeOH：9/1)。反应结束后除去，得到游离碱。
收率：99％
通过TLC检查纯度：正丁醇/AcOH/水/乙酸乙酯：1/1/1/1，Rf＝0.4。通过NMR分析检测反应产物的同一性。
1.3谷氨酰胺酰噻唑烷盐酸盐的合成
酰化：
将N-叔丁基-氧羰基谷氨酰胺(2.0g，8.12mmol)溶于5ml THF中并使其变为-15℃。往此混合物中加入CAIBE(氯甲酸异丁酯)(1.06ml，8.12mmol)和4-甲基吗啉(0.895ml，8.12mmol)并将溶液搅拌15min。通过TLC检查混合酸酐的形成(洗脱剂：CHCl3/MeOH：9/1)。暖至-10℃后另外加入等量的4-甲基吗啉(0.895ml，8.12mmol)和噻唑烷盐酸盐(1.02g，8.12mmol)。将混合物变为室温并搅拌过夜。
处理：
滤出形成的沉淀并蒸发溶剂。将所得的油置于氯仿(20ml)中并用饱和硫酸氢钠溶液洗涤，然后用饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤。分离有机层，干燥并蒸发。通过TLC检查所得产物的纯度(洗脱剂：CHCl3/MeOH：9/1)
收率：1.64g，固体
切割：
将640mg所得的固体Boc保护的化合物溶于3.1ml在二噁烷(12.98M，20当量)中的冰冷HCl中并将其置于冰上。通过TLC监测反应的进展(洗脱剂：CHCl3/MeOH：9/1)。在反应完成后除去溶剂，并将所得的油置于甲醇中并再次蒸发。此后用磷-V-氧化物干燥所得的油，并用乙醚研磨两次。通过HPLC检查纯度。
收率：0.265g
通过HPLC检查纯度。通过NMR分析检查反应产物的同一性。
1.4谷氨酰胺酰吡咯烷盐酸盐的合成
酰化：
将N-叔丁基-氧羰基谷氨酰胺(3.0g，12.18mmol)溶于7ml THF中并使其变为-15℃。往此混合物中加入CAIBE(氯甲酸异丁酯)(1.6ml，12.18mmol)和4-甲基吗啉(1.3ml，12.18mmol)并将溶液搅拌15min。通过TLC检查混合酸酐的形成(洗脱剂：CHCl3/MeOH：9/1)。暖至-10℃后加入1当量吡咯烷(1.0ml，12.18mmol)。将混合物变为室温并搅拌过夜。
处理：
滤出形成的沉淀并蒸发溶剂。将所得的油置于氯仿(20ml)中并用饱和硫酸氢钠溶液洗涤，然后用饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤。分离有机层，干燥并蒸发。通过TLC检查所得产物的纯度(洗脱剂：CHCl3/MeOH：9/1)
收率：2.7g，固体
切割：
将2.7g所得的固体溶于13.0ml在二噁烷(12.98M，20当量)中的冰冷HCl中并将其置于冰上。通过TLC监测反应的进展(洗脱剂：CHCl3/MeOH：9/1)。在反应完成后除去溶剂，并将所得的油置于甲醇中并再次蒸发。此后用磷-V-氧化物干燥所得的油，并用乙醚研磨两次。
收率：980mg
通过HPLC检查纯度。通过NMR分析检查反应产物的同一性。
实施例2：所选择的二肽化合物的化学表征
2.1熔点测定
在来自Leica Aktiengesellschaft的Kofler加热平台显微镜上测定熔点，数值未经校正，或者在DSC装置(Heumann-Pharma)上测定。
2.2旋光度
在来自Perkin-Elmer公司的“Polarimeter 341”或更高级的仪器上，在不同波长下记录旋光值。
2.3质谱的测定条件
通过在来自PE Sciex公司的“API 165”或API 365“上进行电喷雾电离(ESI)而记录质谱。使用c＝10μg/ml的大约浓度进行操作，将物质置于MeOH/H2O 50∶50，0.1％HCO2H中，使用喷雾泵(20μl/min)进行灌输。以正电模式[M+H]+进行测定，ESI电压为U＝5600V。
2.4.结果
2.4.1异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐(异构体)测试物质Mp(℃)CE(min)MS[α]H2OL-threo-IT*F150DSC160203-10.7(405nm)D-threo-IT*F147158203未测定L-allo-IT*F145-6154203-4.58(380nm)D-allo-IT*F144-61502034.5(380nm)
IT*F＝异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐
NMR和HPLC数据证实所讨论的物质的同一性。
2.4.2其它异亮氨酰噻唑烷盐测试IT*盐M(gmol-1)MP(℃)琥珀酸盐522.73116酒石酸盐352.41122延胡索酸盐520.71156盐酸盐238.77169磷酸盐300.32105
实施例3：Xaa-Pro-Yaa三肽的合成
在肽合成器SP 650(Labortec AG)上，应用Fmoc/tBu策略进行所有的合成。保护的氨基酸购自Novabiochem或Bachem。三氟乙酸(TFA)购自Merck，三异丙基硅烷(TIS)购自Fluka。
使用20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)将预填充的Fmoc-Yaa-Wang树脂(2.8g/取代水平0.57mmol/g)脱保护。用DMF洗涤后，将2eq(1.1g)Fmoc-Pro-OH溶液溶于DMF中(12ml溶剂/克树脂)。加入2eq(1.04g)2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)和4eq(1.11ml)N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，并将其置于反应容器中。室温下将混合物振荡20min。然后重复偶联循环。随后用DMF、二氯甲烷、异丙醇和乙醚洗涤后，将所得的Fmoc-Pro-Ile-Wang树脂干燥，然后在偶联最后的氨基酸衍生物之前分成6份。
如上述除去Fmoc保护基。然后将在DMF中的0.54mmol Boc-氨基酸、0.54mmol TBTU和0.108mmol DIEA振荡20min。重复偶联循环。最后洗涤肽树脂并如上述干燥。
使用三氟乙酸(TFA)的混合物从树脂上切割肽，进行2.5小时，所述混合物包含以下净化剂：TFA/H2O/三异丙基硅烷(TIS)＝9.5/0.25/0.25。
粗品肽的收率平均为80-90％。在Nucleosil C18柱(7μm，250*21.20mm，100A)上通过HPLC纯化粗品肽，使用0.1％TFA/H2O的线性梯度，以6ml/min增大0.1％TFA/乙腈的浓度(40min内从5％增至65％)。
冻干得到纯肽，通过电喷雾质谱和HPLC分析进行鉴定。
3.1结果-化学合成后Xaa-Pro-Yaa三肽的鉴定 肽 质量(计算) 质量(实验)1 [M+H+] HPLC k′2 Abu-Pro-Ile 313.4 314.0 5.7 Cha-Pro-Ile 381.52 382.0 10.4 Nva-Pro-Ile 327.43 328.2 6.82 Phg-Pro-lle 361.44 362.2 7.9 Nle-Pro-Ile 341.45 342.2 8.09 Pip-Pro-Ile 338.56 340.0 6.5 Thr-Pro-Ile 329.4 330.0 5.12 Trp-Pro-Ile 414.51 415.2 9.85 Phe-Pro-Ile 375.47 376.2 8.96 Ser-Pro-Ile 315.37 316.3 5.24 Ser(P)-Pro-Ile 395.37 396.0 3.35 Tyr(P)-Pro-Ile 471.47 472.3 5.14 Val-Pro-Val 313.4 314.0 5.07 Ile-Pro-Val 327.43 328.5 6.41 Ile-Pro-allo-Ile 341.4 342.0 7.72 Val-Pro-aIlo-Ile 327.4 328.5 6.51 Tyr-Pro-allo-Ile 391.5 392.0 7.02 2-氨基辛酸-Pro-Ile 369.5 370.2 10.63Ser(Bzl)-Pro-Ile 405.49 406.0 9.87Orn-Pro-Ile 342.42 343.1 3.73Tic-Pro-Ile 387.46 388.0 8.57Aze-Pro-Ile 311.4 312.4 5.29Aib-Pro-Ile 313.4 314.0 5.25叔丁基-Gly-Pro-Ile 341.47 342.1 7.16Ile-Hyp-Ile 356.45 358.2 6.57叔丁基-Gly-Pro-Val 327.4 328.4 6.32叔丁基-Gly-Pro-Gly 285.4 286.3 3.74叔丁基-Gly-Pro-Ile-酰胺 340.47 341.3 7.8叔丁基-Gly-Pro-D-Val 327.4 328.6 7.27叔丁基-Gly-Pro-叔丁基-Gly 341.24 342.5 9.09Ile-Pro-叔丁基-Gly 341.47 342.36 6.93Val-Pro-叔丁基-Gly 327.4 328.15 5.98
1[M+H+]通过电喷雾质谱以正电离模式测定。
2RP-HPLC条件：
柱： LiChrospher 100 RP 18(5μm)，125×4mm
检测(UV)： 214nm
梯度系统： 乙腈(ACN)/H2O(0.1％TFA)
15min内从5％ACN至50％，
流速： 1ml/min
k’＝(tr-t0)/t0
t0＝1.16min
叔丁基-Gly定义为：
Ser(Bzl)和Ser(P)分别定义为苄基丝氨酸和磷酰丝氨酸。
Tyr(P)定义为磷酰酪氨酸。
实施例4：肽基酮的合成
H-Val-Pro-OMe*HCl 2
将Boc-Val-OH(3.00g，13.8mmol)溶于10ml无水THF中并冷却至-15℃。往混合物中加入CAIBE(1.80ml，13.8mmol)和NMM(1.52ml，13.8mmol)，并搅拌溶液直至完成混合酸酐的形成。然后将混合物变为-10℃并加入NMM(1.52ml，13.8mmol)，随后加入H-Pro-OMe*HCl(2.29g，13.8mmol)。使混合物达到室温并静置过夜。在除去溶剂和常规处理后，不经进一步表征而获取所得的酯1。将酯1溶于HCl/HOAc(5ml，6N)中，并在0℃下静置直至完成Boc基团的除去。然后除去溶剂并用乙醚处理所得的油，得到白色固体2。
收率：2.5g，80％
Z-Ala-Val-Pro-OMe 3
以与上述1相同的方式处理Z-Ala OH(3.5g，15.7mmol)和2(4.18g，15.7mmol)，得到3，为白色固体。
收率：4.2g，64％
Z-Ala-Val-Pro-OH 4
将3(4.2g，9.6mmol)溶于30ml水/丙酮(1/5v/v)并加入11.6mlNaOH(1N)。反应完成后，蒸发除去有机溶剂并用15ml NaHCO3溶液(饱和)稀释所得的溶液。然后用10ml乙酸乙酯萃取混合物三次。此后加入HCl(15％，在水中)使溶液变为pH 2。用30ml乙酸乙酯萃取所得的混合物三次。分离有机层并用盐水洗涤三次，干燥(Na2SO4)并蒸发。
收率：3.5g，87％
Z-Ala-Val-Pro-CH2-Br 5
将4(2.00g，4.76mmol)溶于15ml无水THF中，并使用CAIBE(0.623ml，4.76mmol)和NMM(0.525ml，4.76mmol)将其转化为混合酸酐(参见化合物1)。滤出所形成的沉淀并冷却至-15℃。然后在氩气氛下将重氮甲烷(23.8mmol，在30ml乙醚中)滴入溶液中。在将混合物于0℃下静置1小时后，加入1.27ml HBr(33％，在AcOH中)，并在室温下将溶液搅拌30min。然后加入70ml乙醚并用20ml水洗涤混合物。分离有机层并干燥(Na2SO4)和蒸发。
收率(粗品)：1.8g，80％
Z-保护的酰氧基亚甲基酮
将酸(2eq)溶于DMF中并加入等摩尔量的KF。室温下将悬浮液搅拌1小时。然后加入溴亚甲基(brommethylene)(1eq)组分，并将溶液搅拌过夜。然后在真空下除去溶剂，将所得的油溶于氯仿中并用盐水洗涤。随后分离有机层，干燥(Na2SO4)并除去溶剂。使用硅胶和庚烷/氯仿对产物进行柱色谱纯化。
Z-Ala-Val-Pro-CH2O-C(O)-CH3 6
乙酸(230μl，4.02mmol)，KF(0.234g，4.02mmol)，5(1.00g，2.01mmol)
收率：0.351g，36％
Z-Ala-Val-Pro-CH2O-C(O)-Ph 7
苯甲酸(0.275g，2.25mmol)，KF(0.131mg，2.25mmol)，5(0.56g，1.13mmol)
收率：0.34g，56％
脱保护
将Z-保护的化合物溶于HBr/AcOH中并搅拌。当反应完全时加入乙醚，滤出形成的白色沉淀并干燥。
H-Ala-Val-Pro-CH2O-C(O)CH3*HBr 8
6(0.351g，0.73mmol)
收率：0.252g，98％
H-Ala-Val-Pro-CH2O-C(O)-Ph*HBr 9
7(0.34g，0.63mmol)
收率：0.251g，99％
实施例5：环烷基酮的合成
Boc-异亮氨酸(isoleucinal)2
将草酰氯(714μl，8.28mmol)溶于10ml无水二氯甲烷中并使其变为-78℃。然后滴加DMSO(817μl，8.28mmol)。将溶液于-78℃下搅拌20min。随后加入1(1.00g，4.6mmol)并将混合物搅拌20min。然后加入TEA(2.58ml，18.4mmol)并使混合物达到室温。用己烷/乙酸乙酯(2/1v/v)稀释混合物并加入10ml HCl(10％，在水中)。分离有机层并用20ml二氯甲烷萃取水相。收集所有的有机层并用盐水洗涤，然后用水洗涤，接着干燥。使用硅胶和庚烷/氯仿对产物进行柱色谱纯化。
收率：0.52g，52％
N-1-[环戊基(羟基)甲基]-2-甲基丁基氨基甲酸叔丁酯3
将2(0.52g，2.42mmol)溶于10ml无水THF中并冷却至0℃。然后加入环戊基溴化镁(1.45ml的2M溶液)。反应完成后，加入2ml水，并通过加入HCl水溶液而中和溶液。然后加入二氯甲烷，分离有机层并干燥(Na2SO4)。蒸发后将所得的油不经进一步表征而使用。
N-[1-(环戊基羰基)-2-甲基丁基]氨基甲酸叔丁酯4
如1一样处理3(0.61g，2.15mmol)。草酰氯(333μl，3.87mmol)，DMSO(382μl，5.37mmol)，TEA(1.2ml，8.59mmol)
收率：0.180g，30％
氯化1-环戊基-3-甲基-1-氧-2-戊鎓(pentanaminium)5
将4(0.18g，0.63mmol)溶于2ml HCl(7N，在二噁烷中)。反应完成后除去溶剂，并使用氯仿/甲醇/水梯度对所得的油进行硅胶柱色谱纯化。用乙醚研磨所得的油。
收率：0.060g，54％
实施例6：侧链修饰的DPIV抑制剂的合成
6.1 Boc-谷氨酰-噻唑烷(Boc-Glu-Thia)的合成
根据方法B(见方法第6.4部分)使Boc-Glu(OMe)-OH与Thia*HCl反应，根据方法G水解Boc-Glu(OMe)-Thia。
6.1.1 Boc-Glu-Thia的分析数据化合物经验式Mr合成方法收率MS[M+H]+TLC：Rf/系统m.p.[α]20D浓度溶剂元素分析(计算/实测)％HPLCRt[分]/系统Boc-Glu-ThiaC13H22N2O5S318.38B+G62％319.50.52/A10.42/B1115-118℃-3.1c＝1甲醇C：49.04/48.89H：6.96/6.82N：8.80/8.5913.93/A2
1薄层色谱
系统A：氯仿/甲醇 90∶10
系统B：苯/丙酮/乙酸 25∶10∶0.5
系统C：正丁醇/EA/乙酸/H2O 1∶1∶1∶1
2HPLC分离条件：
柱：Nucleosil C-18，7μ，250mm×21mm
洗脱剂：等度，40％ACN/水/0.1％TFA
流速：6ml/min
λ＝220nm
6.2侧链修饰的Boc-谷氨酰噻唑烷
通过引入不同大小的基团而在γ-羧酸官能团上修饰Boc-Glu-Thia。通过所述基团的氨基形成酰胺键而将它们偶联于γ-羧酸官能团，根据具体的基团而使用不同的偶联方法。使用所述的方法将以下氨基组分连接到Boc-Glu-Thia上：氨基组分偶联方法(参见3.4部分)收率聚乙二醇胺(Mr≈8000)C93％H-Gly-Gly-Gly-OHD+E49％H-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-OHD+E86％
在2种情况下，反应产物的纯化不同于合成的一般描述。
Boc-Glu(Gly5)-Thia
在搅拌过夜时产物已经从混合物中沉淀出来；然后将其滤出，用0.1N HCl和大量的水洗涤，随后用P4O10在真空下干燥。
Boc-GIu(PEG)-Thia
与常规方法相反，将合成的原料溶于500倍过量的DMF中。在反应完成后，真空下完全除去DMF并将残留物溶于大量甲醇中。在倾入乙醚，形成上层后，产物与未反应的PEG一起沉淀出来。通过在制备HPLC分离在凝胶过滤柱(Pharmazia，Sephadex G-25，90μm，260mm-100mm)上进行精细纯化。
分离条件：洗脱剂：水；流速：5ml/min；λ＝220nm
6.2.2侧链修饰的Boc-谷氨酰噻唑烷的合成数据化合物经验式Mr收率MS[M+H]+TLC/Rf/系统m.p.[α]20D浓度溶剂元素分析(计算/实测)％HPLCRt[min]/系统Boc-Glu(Gly3)-ThiaC19H31N5O8S489.5449％490.5C：46.62H：6.38N：14.31Boc-Glu(Gly5)-ThiaC23H37N7O10S603.6486％604.50.09/C从202℃分解n.dm.C：45.76/45.6H：6.18/6.11N：16.24/16.5611.93/A2Boc-Glu(PEG)-Thia93％≈8000(质量重点)52-53℃n.dm.n.dm.n.dm.
2HPLC分离条件：
柱：Nucleosil C-18，7μ，250mm×21mm
洗脱剂：等度，40％ACN/水/0.1％TFA
流速：6ml/min
λ＝220nm
6.3侧链修饰的谷氨酰噻唑烷
使用方法F从表6.2.2中所述的化合物上切割N-末端Boc保护基。用Gly衍生物修饰的物质通过制备HPLC分离纯化，且它以三氟乙酸盐存在。以与Boc保护的前体相同的方式在凝胶过滤柱上将H-Glu(PEG)-Thia纯化。
6.3.1侧链修饰的谷氨酰噻唑烷的合成数据化合物经验式Mr收率MS[M+H]+TLC/Rf/系统m.p.[α]20D浓度溶剂元素分析(计算/实测)％HPLCRt[min]/系统H-Glu(Gly3)-Thia*TFAC16H24N5O8SF3503.4594％503.450.32/C91-94℃+4.1c＝1甲醇C：38.17/37.56H：4.80/4.78N：13.91/13.437.84/C3H-Glu(Gly5)-Thia*TFAC20H30N7O10SF3617.5598％617.550.25/C105-107℃n.dm.C：38.90/38.82H：4.90/4.79N：5.88/15.398.22/C3H-Glu(PEG)-Thia*HCl92％≈8000(质量重点)n.dm.n.dm.n.dm.
3HPLC分离条件：
柱：Nucleosil C-18，7μ，250mm×21mm
洗脱剂：ACN/水/0.1％TFA
梯度：在30分钟内20％ACN→90％ACN
流速：6ml/min
λ＝220nm
n.dm.一未检测或不可检测
6.4一般合成方法
方法A：通过混合酸酐方法使用CFIBE作为活化试剂进行的肽键连接
将10mmol N-末端保护的氨基酸或肽溶于20ml无水THF中。将溶液冷却至-15℃±2℃。在每种情况下在搅拌下将10mmol N-MM和10mmol氯甲酸异丁酯连续加入，并严格保持所述的温度范围。约6min后，加入10mmol氨基组分。当氨基组分为盐时，再往反应混合物中加入10mmol N-MM。然后将反应混合物在冷状态下搅拌2小时并在室温下搅拌过夜。
使用旋转蒸发器浓缩反应混合物，将其置于EA中，用5％KHSO4溶液、饱和NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。真空下除去溶剂后，用EA/戊烷重结晶化合物。
方法B：通过混合酸酐方法使用特戊酰氯作为活化试剂进行的肽键连接
将10mmol N-末端保护的氨基酸或肽溶于20ml无水THF中。将溶液冷却至0℃。在每种情况下在搅拌下将10mmol N-MM和10mmol特戊酰氯连续加入，并严格保持所述的温度范围。约6min后，将混合物冷却至-15℃，且一旦到达更低的温度即加入10mmol氨基组分。当氨基组分为盐时，再往反应混合物中加入10mmol N-MM。然后将反应混合物在冷状态下搅拌2小时并在室温下搅拌过夜。
如方法A中所述进行进一步的处理。
方法C：使用TBTU作为活化试剂的肽键连接
将10mmol N-末端保护的氨基酸或肽和10mmol C-末端保护的氨基组分溶于20ml无水DMF中。将溶液冷却至0℃。在每种情况下在搅拌下将10mmol DIPEA和10mmol TBTU连续加入。将反应混合物于0℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌过夜。真空下完全除去DMF并如方法中所述处理产物。
方法D：活性酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)的合成
将10mmol N-末端保护的氨基酸或肽和10mmol N-羟基琥珀酰亚胺溶于20ml无水THF中。将溶液冷却至0℃并在搅拌下加入10mmol二环己基碳二亚胺。0℃下将反应混合物再搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。滤出所得的N，N′-二环己基脲，真空下除去溶剂，并用EA/戊烷重结晶剩余的产物。
方法E：使用N-羟基琥珀酰亚胺酯的酰胺键连接
将10mmol C-末端未保护的氨基组分引入NaHCO3溶液(20mmol，在20ml水中)中。室温和搅拌下，缓慢滴加溶于10ml二噁烷中的10mmol N-末端保护的N-羟基琥珀酰亚胺酯。继续搅拌反应混合物过夜并在真空下除去溶剂。
如方法A中所述进行进一步的处理。
方法F：Boc保护基的切割
将3ml 1.1N HCl/冰醋酸(方法F1)或3ml 1.1N HCl/二噁烷(方法F2)或在DCM中的3ml 50％TFA(方法F3)加入1mmol Boc保护的氨基酸吡咯烷(pyrrolidide)、噻唑烷(thiazolidide)或肽中。通过TLC监测RT下的切割。反应完成后(约2小时)，使用无水乙醚沉淀盐酸盐形式的化合物，通过抽吸进行纯化，并在真空下用P4O10干燥。使用甲醇/乙醚重结晶或再沉淀产物。
方法G：水解
将1mmol肽甲酯溶于10ml丙酮和11ml 0.1M NaOH溶液中并在室温下搅拌。通过TLC监测水解过程。反应完成后，真空下除去丙酮。使用浓K2HSO4将剩余的水溶液酸化至到达pH 2-3。然后用EA将产物萃取数次；用饱和NaCl溶液洗涤合并的乙酸乙酯部分并用NaSO4干燥，真空下除去溶剂。用EA/戊烷结晶。
实施例7：Ki测定
为了进行Ki测定，使用来自猪肾的对甘氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺的特异性活性为37.5U/mg的二肽基肽酶IV，储备溶液中的酶浓度为1.41mg/ml。
试验混合物：
将100μl浓度范围分别为1*10-5M-1*10-8M的测试化合物与50μl不同浓度(0.4mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM)的甘氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺和100μl HEPES(40mM，pH 7.6；离子强度＝0.125)混合。在30℃下将试验混合物预温育30min。预温育后，加入20μlDPIV(1∶600稀释)，并在30℃和λ＝405nm下，在10min内，使用平板读数器(HTS7000 plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)测定由于4-硝基苯胺释放而产生的黄颜色。
使用Graphit version 4.0.13、4.0.13和4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)计算Ki值。
7.1结果-DPIV抑制的Ki值化合物 Ki[M]H-Asn-吡咯烷 1.20*10-5H-Asn-噻唑烷 3.5*10-6H-Asp-吡咯烷 1.4*10-8H-Asp-噻唑烷 2.9*10-6H-Asp(NHOH)-吡咯烷 1.3*10-5H-Asp(NHOH)-噻唑烷 8.8*10-6H-Glu-吡咯烷 2.2*10-6H-Glu-噻唑烷 6.1*10-7H-Glu(NHOH)-吡咯烷 2.8*10-6H-Glu(NHOH)-噻唑烷 1.7*10-6H-His-吡咯烷 3.5*10-6H-His-噻唑烷 1.8*10-6H-Pro-吡咯烷 4.1*10-6H-Pro-噻唑烷 1.2*10-6H-Ile-azididine 3.1*10-6H-Ile-吡咯烷 2.1*10-7H-L-threo-Ile-噻唑烷 8.0*10-8H-L-allo-Ile-噻唑烷 1.9*10-7D-苏型异亮氨酰-噻唑烷-延胡索酸盐 无抑制D-别异亮氨酰-噻唑烷-延胡索酸盐 无抑制H-L-threo-Ile-噻唑烷-琥珀酸盐 5.1*10-8H-L-threo-Ile-噻唑烷-酒石酸盐 8.3*10-8H-L-threo-Ile-噻唑烷-延胡索酸盐 8.3*10-8H-L-tgreo-Ile-噻唑烷-盐酸盐 7.2*10-8H-L-threo-Ile-噻唑烷-磷酸盐 1.3*10-7H-Val-吡咯烷 4.8*10-7H-VaI-噻唑烷 2.7*10-7Diprotin A 3.45*10-6Diprotin B 2.24*10-5Nva-Pro-Ile 6.17*10-6Cha-Pro-Ile 5.99*10-6Nle-Pro-Ile 9.60*10-6Phe-Pro-Ile 1.47*10-5Val-Pro-Val 4.45*10-6Ile-Pro-Val 5.25*10-6Abu-Pro-Ile 8.75*10-6Ile-Pro-allo-Ile 5.22*10-6Val-Pro-allo-Ile 9.54*10-6Tyr-Pro-allo-Ile 1.82*10-5AOA-Pro-Ile 1.26*10-5叔丁基-Gly-Pro-Ile 3.10*10-6Ser(Bzl)-Pro-Ile 2.16*10-5Aze-Pro-Ile 2.05*10-5叔丁基-Gly-Pro-Val 3.08*10-6Gln-Pyrr 2.26*10-6Gln-Thia 1.21*10-6Val-Pro-叔丁基-Gly 1.96*10-5叔丁基-Gly-Pro-Gly 1.51*10-5Ile-Pro-叔丁基-Gly 1.89*10-5叔丁基-Gly-Pro-IleNH2 5.60*10-6叔丁基-Gly-Pro-D-Val 2.65*10-5叔丁基-Gly-Pro-叔丁基-Gly 1.41*10-5Ile-环戊基酮 6.29*10-6叔丁基-Gly-环己基酮 2.73*10-4Ile-环己基酮 5.68*10-5Val-环戊基酮 1.31*10-5Val-Pro-甲基酮 4.76*10-8Val-Pro-酰氧基甲基酮 1.05*10-9Val-Pro-苯甲酰甲基酮 5.36*10-10Val-Pro-苯并噻唑甲基酮 3.73*10-8H-Glu-Thia 6.2*10-7H-Gly(NHOH)-Thia 1.7*10-6H-Glu(Gly3)-Thia 1.92*10-8H-Glu(Gly5)-Thia 9.93*10-8H-Glu(PEG)-Thia 3.11*10-6
叔丁基-Gly定义为：
Ser(Bzl)和Ser(P)分别定义为苄基-丝氨酸和磷酰-丝氨酸。
Tyr(P)定义为磷酰-酪氨酸。
实施例8：IC50值的测定
将100μl抑制剂储备溶液与100μl缓冲液(HEPES pH 7.6)和50μl底物(Gly-Pro-pNA，最终浓度0.4mM)混合并在30℃下预温育。通过加入20μl纯化的猪DPIV而开始反应。在405nm下在10min内使用HTS 7000 Plus平板读数器(Perkin Elmer)测定产物pNA的形成并计算斜率。最终的抑制剂浓度范围为1mM-30nM。为了进行IC50的计算，使用GraFit 4.0.13(Erithacus Software)。
8.1结果-IC50值的测定化合物 IC50[M]异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐 1.28*10-7Diprotin A 4.69*l0-6Diprotin B 5.54*10-5Phg-Pro-Ile 1.54*10-4Nva-Pro-Ile 2.49*10-5Cha-Pro-Ile 2.03*10-5Nle-Pro-Ile 2.19*10-5Ser(P)-Pro-Ile 0.012Tyr(P)-Pro-Ile 0.002Phe-Pro-Ile 6.20*10-5Trp-Pro-Ile 3.17*10-4Ser-Pro-Ile 2.81*10-4Thr-Pro-Ile 1.00*10-4Val-Pro-Val 1.64*10-5Ile-Pro-Val 1.52*10-5Abu-Pro-Ile 3.43*10-5Pip-Pro-Ile 0.100Ile-Pro-allo-Ile 1.54*10-5Val-Pro-allo-Ile 1.80*10-5Tyr-Pro-allo-Ile 6.41*10-5AOA-Pro-Ile 4.21*10-5叔丁基-Gly-Pro-Ile 9.34*10-6Ser(Bzl)-Pro-Ile 6.78*10-5Tic-Pro-Ile 0.001Orn-Pro-Ile 2.16*10-4Gln-Thia 5.27*10-6AZe-Pro-Ile 7.28*10-5Ile-Hyp-Ile 0.006叔丁基-Gly-Pro-Val 1.38*10-5Gln-Pyrr 1.50*10-5Val-Pro-叔丁基-Gly 6.75*10-5叔丁基-Gly-Pro-Gly 5.63*10-5Ile-Pro-叔丁基-Gly 8.23*10-5叔丁基-Gly-Pro-IleNH2 2.29*10-5叔丁基-Gly-Pro-D-Val 1.12*10-4叔丁基-Gly-Pro-叔丁基-Gly 2.45*10-5Aib-Pro-Ile 无抑制Ile-环戊基酮 3.82*10-5叔丁基-Gly-环己基酮 2.73*10-4Ile-环己基酮 2.93*10-4Val-环戊基酮 4.90*10-5Val-环己基酮 0.001Val-Pro-甲基酮 5.79*10-7Val-Pro-酰氧基甲基酮 1.02*10-8Val-Pro-苯甲酰基甲基酮 1.79*10-8Val-Pro-苯并噻唑甲基酮 1.38*10-7
叔丁基-Gly定义为：
Ser(Bzl)和Ser(P)分别定义为苄基-丝氨酸和磷酰-丝氨酸。
Tyr(P)定义为磷酰-酪氨酸。
实施例9：DPIV样酶-二肽基肽酶II的抑制
如果N-末端未被质子化，则DP II(3.4.14.2)从寡肽中释放N-末端二肽(McDonald，J.K.，Ellis，S.&Reilly，T.J.，1966，J.Biol.Chem.，241，1494-1501)。P1位的Pro和Ala是优选的残基。酶活性描述为DPIV样活性，但DP II具有酸性pH-最佳值。所用的酶从猪肾中纯化。
试验：
将100μl浓度范围为1*1-4M-5*10-8M的谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷与100μl缓冲液(40mM HEPES，pH 7.6，0.015％Brij，1mM DTT)、50μl赖氨酰丙氨酰氨基甲基香豆素溶液(5mM)和20μl猪DP II(在缓冲液中稀释250倍)混合。在30℃和λ激发＝380nm，λ发射＝465nm下使用平板读数器(HTS7000plus，AppliedBiosystems，Weiterstadt，Germany)进行荧光测定25min。使用Graphit4.0.15(Erithacus Software，Ltd.，UK)计算Ki值，并测定如下：对于谷氨酰胺酰吡咯烷，Ki＝8.52*10-5M±6.33*10-6M；而对于谷氨酰胺酰噻唑烷，Ki＝1.07*10-5M±3.81*10-7M。
实施例10：交叉反应酶
测试谷氨酰胺酰吡咯烷和谷氨酰胺酰噻唑烷的抗二肽基肽酶I、脯氨酰寡肽酶和氨酰基脯氨酸二肽酶的交叉反应效力。
二肽基肽酶I(DPI，组织蛋白酶C)：
DPI或组织蛋白酶C是从它们的底物的N-末端切割二肽的溶酶体半胱氨酸蛋白酶(Gutman，H.R.&Fruton，J.S.，1948，J.Biol.Chem.，174，851-858)。它归类于半胱氨酸蛋白酶。所用的酶购自Qiagen(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)。为了获得完全活性的酶，将酶在MES缓冲液pH 5.6(40mM MES，4mM DTT，4mM KCl，2mMEDTA，0.015％Brij)中稀释1000倍并在30℃下预温育30min。
试验：
将50μl浓度范围为1*10-5M-1*10-7M的谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷与110μl缓冲液-酶-混合物混合。将试验混合物于30℃下预温育15min。预温育后，加入100μl组氨酰丝氨酰-硝基苯胺(2*10-5M)，并在30℃和λ激发＝380nm，λ发射＝465nm下使用平板读数器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)测定由于β-硝基苯胺释放而产生的黄颜色10min。
使用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd.，UK)计算IC50值。没有发现由谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷导致的DP I酶活性的抑制。
脯氨酰寡肽酶(POP)
脯氨酰寡肽酶(EC 3.4.21.26)是从Xaa-Pro键的N-末端部分切割肽的丝氨酸型内切蛋白酶(Walter，R.，Shlank，H.，Glass，J.D.，Schwartz，I.L.&Kerenyi，T.D.，1971，Science，173，827-829)。底物是分子量达3000Da的肽。所用的酶是重组人脯氨酰寡肽酶。在如现有技术其它地方所述的标准条件下在大肠杆菌中进行重组表达。
试验：
将100μl浓度范围为1*10-4M-5*10-8M的谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷与110μl缓冲液(40mM HEPES，pH 7.6，0.015％Brij，1mM DTT)和20μl POP溶液混合。将试验混合物于30℃下预温育15min。预温育后，加入50μl甘氨酰脯氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺溶液(0.29mM)，并在30℃和λ＝405nm下，使用平板读数器(sunrise，Tecan，Crailsheim，Germany)测定由于4-硝基苯胺释放而产生的黄颜色10min。使用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd.，UK)计算IC50值。没有发现由谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷导致的POP活性的抑制。
氨酰基脯氨酸二肽酶(X-Pro二肽酶)
Bergmann&Fruton首先描述了氨酰基脯氨酸二肽酶(EC 3.4.13.9)(Bergmann，M.&Fruton，JS，1937，J.Biol.Chem.189-202)。氨酰基脯氨酸二肽酶从Xaa-Pro二肽中释放N-末端氨基酸，且其pH最佳值为6-9。
将来自猪肾的氨酰基脯氨酸二肽酶(ICN Biomedicals，Eschwege，Germany)溶于(1mg/ml)试验缓冲液(20mM NH4(CH3COO)2，3mMMnCl2，pH 7.6)中。为了获得完全活性的酶，将溶液于室温下预温育60min。
试验：
将450μl浓度范围为5*10-3M-5*10-7M的谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷与500μl缓冲液(20mM NH4(CH3COO)2，pH 7.6)和250μl Ile-Pro-OH(0.5mM，在试验混合物中)混合。将试验混合物于30C下预温育5min。预温育后，加入75μl氨酰基脯氨酸二肽酶(在试验缓冲液中1∶10稀释)，并在30℃和λ＝220nm下使用UV/Vis光度计，UV1(Thermo Spectronic，Cambridge，UK)测定20min。
使用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd.，UK)计算IC50值。测定它们如下：对于谷氨酰胺酰噻唑烷，IC50＞3mM；而对于谷氨酰胺酰吡咯烷，IC50＝3.4*10-4M±5.63*10-5。
实施例11：血管内和口服给予威斯塔鼠后DPIV抑制活性的测定动物
从Tierzucht Schnwalde(Schnwalde，Germany)购得体重范围为250-350g的雄性威斯塔鼠(Shoe：Wist(Sho))。
饲养条件
在常规条件下，使用受控的温度(22+2℃)，以12/12小时光/暗循环(在06:00AM给光)单一笼养大鼠。允许其随意获取标准丸状固体食物(ssniffSoest，Germany)和用HCl酸化的自来水。
导管插入颈动脉
在≥一周的饲养条件适应后，在全身麻醉(腹膜内注射0.25ml/kg b.w.Rompun[20％]，BayerVital，Germany和0.5ml/kg b.w.Ketamin 10，Atarost GmbH&Co.，Twistringen，Germany)下将导管植入威斯塔鼠的颈动脉。使动物恢复一周。每周用肝素-盐水(100IU/ml)冲洗导管三次。如果导管功能不良，则将第二根导管插入相应的大鼠的对侧颈动脉。从外科手术恢复一周后，使该动物恢复至研究。如果第二根导管功能不良，则将动物从研究中撤出。补充新的动物并以计划的顺序继续进行实验，所述实验起始于导管植入后至少7天。
实验设计
通过口服和血管内(动脉内)途径给予具有完整导管功能的大鼠安慰剂(1ml盐水，0.154mol/l)或测试化合物。在禁食过夜后，在-30、-5和0min收集100μl肝素化动脉血样。将测试物质新鲜溶于1.0ml盐水(0.154mol/l)中，并在0min时通过饲管(75mm；Fine ScienceTools，Heidelberg，Germany)口服或通过血管内途径给药。在口服给药的情况下，将另外1ml体积的盐水注入动脉导管。在动脉内给药的情况下，立即用30μl盐水冲洗导管并通过饲管另外口服给予1ml盐水。
在施用安慰剂或测试物质后，在2.5、5、7.5、10、15、20、40、60和120min，从有意识的不受限制的大鼠的颈动脉导管取动脉血样。将所有的血样收集到冰冷的填充有10μl 1M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)的Eppendorf管(Eppendorf-Netheler-Hinz，Hamburg，Germany)中用于血浆DPIV活性测定。立即将Eppendorf管离心(12000rpm持续2min，Hettich Zentrifuge EBA 12，Tuttlingen；Germany)：将血浆部分保存在冰上直至分析或在-20℃下冷冻直至分析。所有的血浆样品用以下数据标记：
·序号
·动物号
·取样日期
·取样时间
分析方法
用于测定血浆DPIV活性的试验混合物由80μl试剂和20μl血浆样品组成。在30℃下预温育2min后于相同的温度下在390nm对来自底物甘氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺的黄色产物4-硝基苯胺的形成进行动力学测定。DPIV活性以mU/ml表示。
统计方法
用PRISM3.02(GraphPad Software，Inc.)进行统计学评价和制图。以描述的方式分析所有参数，包括平均值和SD。
11.1结果-在tmax的体内DPIV抑制结构剂量(mg/kg) i.v.(％) p.o.(％)Gln-Pyrr 100 80 67Gln-Thia 100 88 71Diprotin A 100 73 无抑制Diprotin B 100 50 无抑制Tyr(P)-Pro-Ile 100 37 无抑制叔丁基-Gly-Pro-Ile 100 71 28叔丁基-Gly-Pro-Val 100 72 25Ala-Val-Pro-酰氧基甲基酮 100 89 86Ala-Val-Pro-苯甲酰甲基酮 100 97 76Ile-环戊基酮 100 34 15
实施例12：侧链修饰的谷氨酰噻唑烷作为非易转运的DPIV抑制剂的作用
用不同链长的聚乙二醇或甘氨酸寡聚物作为X(参见描述合成的实施例的方法A)，合成侧链修饰的谷氨酰噻唑烷。研究了那些衍生物的结合特征和它们被肽转运蛋白PepT1转运的能力。
令人惊奇地，发现侧链修饰仅轻微地改变化合物与DPIV的结合特征。相反，侧链修饰大幅地降低抑制剂被肽转运蛋白转运的能力。
因此，侧链修饰的DPIV或DPIV样酶抑制剂非常适于在体内实现部位定向的DPIV抑制。
12.1结果：所选择的DPIV抑制剂的转运能力化合物氨基酸噻唑烷EC50(mM)-1Imax(nA)2H-Ile-Thia0.9825±8H-Glu-Thia1.135±13侧链修饰的谷氨酰噻唑烷H-Gly(NHOH)-Thia3.1842±11H-Glu(Gly3)-Thia8.54n.d.3H-GIu(GIy5)-Thia＞10n.d.3H-Glu(PEG)-Thia＞10n.d.3
1 50％抑制3H-D-Phe-Ala(80mM)与PepT1-表达P.pastoris细胞结合的化合物的有效浓度(EC50值)
2在X.leavis的PepT1-表达卵母细胞上的转运特征-通过双电极电压夹方法，I＝由转运产生的向内电流
实施例13：DPIV-催化的肠降血糖素GIP1-42和GLP-17-36体内水解的抑制
可能使用纯化的酶或混合人血清抑制由DPIV和DPIV样酶活性导致的肠降血糖素的体内水解(图1)。
根据本发明，两种肽激素的体内酶催化的水解的完全抑制如下实现：将30mM GIP1-42或30mM GLP-17-36和20mM异亮氨酰噻唑烷(1a)，一种可逆DPIV-抑制剂在20％的混合血清中在pH 7.6和30℃下温育24小时(1b和1c，均为上部谱(upper spectra)。将合成的GIP1-42(5mM)和合成的GLP-17-36(15μM)和人血清(20％)一起在0.1mMTRICINE Puffer中在pH 7.6和30℃下温育24小时。在不同的时间间隔后抽取温育实验的样品(在GIP1-42的情况下2.5pmol，在GLP-17-36的情况下7.5pmol)。将样品用2’，6’-二羟基乙酰苯作为基质进行共结晶并通过MALDI-TOF质谱进行分析。图谱(图1)显示每份样品250单激光发射(single laser shot)的蓄积。
(1b)m/z 4980.1±5.3的单峰相应于DPIV底物GIP1-42(M 4975.6)，而质量m/z 4745.2±5.5的信号相应于DPIV释放的产物GIP3-42(M4740.4)。
(1c)m/z 3325.0±1.2的单峰相应于DPIV底物GLP-17-36(M3297.7)，而质量m/z 3116.7±1.3的信号相应于DPIV释放的产物GLP-19-36(M 3089.6)。
在不含抑制剂的对照实验中，肠降血糖素几乎完全降解(图1b和1c，均为底部谱(bottom spectra))。
实施例14：通过DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷的GLP17-36体内降解的抑制
在DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷(静脉注射在0.9％盐溶液中的1.5M抑制剂)存在或不存在下对大鼠和对照循环中的天然肠降血糖素(此例中为GLP-17-36)的代谢进行分析。在试验的时间进程中，在0.1mg/kg的抑制剂异亮氨酰噻唑烷的浓度下，所治疗的动物(n＝5)中没有发生促胰岛肽激素GLP-17-36的降解(图2)。
为了分析在DPIV抑制剂存在和不存在下肠降血糖素的代谢产物，试验动物和对照动物在最初静脉注射抑制剂和/或盐水给药20分钟后再接受静脉注射50-100pM 125I-GLP-17-36(比活为约1μCi/pM)。在2-5分钟的温育时间后收集血样并用20％乙腈提取血浆。随后用RP-HPLC分离肽提取物。在12-18分钟间收集洗脱液的多个部分并用γ-计数器进行计数。数据以相对于最大值的每分钟数目(cpm)表示。
实施例15：静脉注射给予DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷后体内的胰岛素反应的调节以及血糖水平的降低
附图显示在异亮氨酰噻唑烷(0.1mg/kg)存在和不存在下对十二指肠内(i.d.)给予大鼠葡萄糖的循环葡萄糖和胰岛素反应。与未治疗的对照相比，接受DPIV效应物的动物中的循环葡萄糖浓度的降低更快。在每千克大鼠输注0.05mg/min DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷结束后所观察到的效应是剂量依赖性的并且是可逆的。与十二指肠内葡萄糖刺激的动物不同，在抑制剂治疗的对照动物中静脉注射给予相同量的葡萄糖后没有可观察到的可比的效应。在图3中证明了这些关系，显示所选择的血浆参数的抑制剂依赖性变化：A-DPIV活性，B-血浆胰岛素水平，C-血糖水平。
实施例16：在12周的口服药物施用期间长期治疗肥胖朱克鼠对禁食血糖的影响
长期施用DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐导致所选择的糖尿病大鼠模型中禁食血糖的显著降低和几乎正常化(图4)。
动物
将六对雄性肥胖(fa/fa)VDF朱克鼠同窝出生仔畜在440g体重时(年龄为11+0.5周)随机分配入对照组或治疗(异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐)组。单独豢养动物，12小时光/暗循环(6am开始给光)，并允许其随意获取标准大鼠食品和水。
每日监测和药物给予的方案
治疗组通过口服管饲每日两次(8:00a.m.和5:00p.m.)接受10mg/kg异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐，持续100天，而对照动物接受由1％葡萄糖溶液组成的载体给药。每隔两天评价体重、早晨和晚上的血糖，以及食品和水摄入。从尾部血流获得用于葡萄糖测定的血样，并用SureStep葡萄糖分析仪(Lifescan Danada Ltd.，Burnaby)进行测量。
每月评价葡萄糖耐量的方案
从试验开始，每四周进行口服葡萄糖耐量测试(OGTT)：在1700h给药并口服给予1g/kg葡萄糖后，动物禁食18小时。此时间等于异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐的约12个循环半衰期。
实施例17：用DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷长期口服治疗朱克鼠对收缩血压的影响
长期施用DPIV抑制剂异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐导致所选择的糖尿病大鼠模型中收缩血压的稳定化(图5)。
动物
将六对雄性肥胖(fa/fa)VDF朱克鼠同窝出生仔畜在440g体重时(年龄为11±0.5周)随机分配入对照组或治疗(异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐)组。单独豢养动物，12小时光/暗循环(6am开始给光)，并允许其随意获取标准大鼠食品和水。
每日监测和药物给予的方案
治疗组通过口服管饲每日两次(8:00a.m.和5:00p.m.)接受10mg/kg异亮氨酰噻唑烷延胡索酸盐，持续100天，而对照动物接受由1％葡萄糖溶液组成的载体给药。用尾套法每周测量收缩血压。
试验动物(n＝5，雄性威斯塔鼠，200-225g)最初接受在0.9％盐溶液中的1.5M异亮氨酰噻唑烷(▲)或相同体积的普通0.9％盐水(■)(对照组n＝5)。试验组在30分钟试验时间内另外接受0.75M/min的抑制剂输注(*)。对照组在相同的时间间隔内接受无抑制剂的0.9％盐溶液输注。在开始时间t＝0，十二指肠内给予所有动物1g/kg 40％右旋糖溶液(w/v)的葡萄糖剂量。以10分钟时间间隔收集所有试验动物的血样。使用全血分析葡萄糖(Lifescan One Touch II分析仪)，而在血浆中分析DPIV活性和胰岛素浓度。在10和160mU/ml的范围内，胰岛素放射免役测定灵敏[PEDERSON，R.A.，BUCHAN，A.M.J.，ZAHEDI-ASH，S.，CHEN，C.B.&BROWN，J.C.Reg.Peptides.3，53-63(1982)]。DPIV活性用分光光度法进行估计[DEMUTH，H.-U.和HEINS，J.，On the catalytic Mechanism of Dipeptidyl Peptidase IV.in DipeptidylPeptidase IV(CD26)in Metabolism and the Immune Response(B.Fleischer，Ed.)R.G.Landes，Biomedical Publishers，Georgetown，1-35(1995)]。所有数据均表示为平均值±s.e.m。
实施例18：口服给予谷氨酰胺酰吡咯烷后肥胖朱克鼠中的剂量增加研究
动物
N＝30只雄性朱克鼠(fa/fa)购自Charles River(Sulzfeld，德国)，平均年龄为11周(5-12周)，平均体重为350g(150-400g)。交付后将它们饲养＞12周，直至几乎所有肥胖朱克鼠均具有明显的糖尿病特征。N＝3只动物被用于测试三种逐级增加的谷氨酰胺酰吡咯烷对安慰剂(盐水)的剂量。
豢养条件
将动物在具有受控制的温度(22±2℃)，12/12小时光/暗循环(在06:00 AM开始给光)的标准化条件下单笼豢养。允许其随意获取无菌标准小丸食品(ssniffSoest，德国)和用HCl酸化的自来水。
颈动脉插管术
准备适应了豢养条件的24-31周(平均：25周)龄的肥胖朱克鼠用于研究。在全身麻醉(腹膜内注射0.25ml/kg b.w.Rompun[2％]，BayerVital，德国和0.5ml/kg b.w.Ketamin 10，Atarost GmbH&Co.，Twistringen，德国)下将导管植入肥胖朱克鼠的颈动脉中。允许动物恢复一周。每周用肝素-盐水(100IU/ml)冲洗导管三次。
试验设计
将安慰剂(1ml盐水，0.154mol/1)或剂量逐渐增加的谷氨酰胺酰吡咯烷(5、15和50mg/kg b.w.)给予N＝8只朱克鼠的组。将375mg谷氨酰胺酰吡咯烷溶于1000μl DMSO(E.Merck，Darmstadt；德国[二甲基亚砜p.a.])中。加入10ml盐水，将每份含34.09mg谷氨酰胺酰吡咯烷的1ml等分试样贮存在-20℃下。为了制备测试物质，将剂量依赖性等分试样在盐水中稀释。
在禁食过夜后，在-10分钟时经饲管(15G，75mm；Fine ScienceTools，Heidelberg，德国)将安慰剂或测试物质口服给予肥胖朱克鼠。在±0分钟时经第二饲管给予2g/kg b.w.葡萄糖(40％溶液，B.BraunMelsungen，Melsungen，德国)的口服葡萄糖耐量测试(OGTT)。在-30分钟、-15分钟、±0分钟和在5、10、15、20、30、40、60、90和120分钟将来自尾静脉的静脉血样收集入20μl玻璃毛细管中，这些毛细管被放置于填充有1ml溶液的标准管中用于血糖测量。
所有血样均标记有如下数据：
●序号
●动物号
●取样日期
●取样时间
分析方法
用葡萄糖氧化酶法(Super G Glucose分析仪；Dr.MüllerGertebau，Freital，德国)测量葡萄糖水平。
统计方法
用PRISM3.02(GraphPad Software，Inc.)进行统计学评价和制图。以描述方式分析所有的参数，包括平均值和SD。
药物对葡萄糖耐量的影响
安慰剂治疗的糖尿病朱克鼠显示显著升高的血糖移动，表明明显的糖尿病葡萄糖耐量。给予5mg/kg b.w.谷氨酰胺酰吡咯烷导致糖尿病朱克鼠中有限的葡萄糖耐量改善。给予15mg/kg和50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰吡咯烷后实现了升高的血糖水平的显著降低和葡萄糖耐量的改善(参见图6)。
实施例19：口服给予谷氨酰胺酰噻唑烷后肥胖朱克鼠中的剂量增加研究
动物
N＝30只雄性朱克鼠(fa/fa)购自Charles River(Sulzfeld，德国)，平均年龄为11周(5-12周)，平均体重为350g(150-400g)。交付后将它们饲养＞12周，直至几乎所有肥胖朱克鼠均具有明显的糖尿病特征。N＝8只动物的组被用于测试三种逐级增加的谷氨酰胺酰噻唑烷对安慰剂(盐水)的剂量。
豢养条件
将动物在具有受控制的温度(22±2℃)，12/12小时光/暗循环(在06:00 AM开始给光)的标准化条件下单笼豢养。允许其随意获取无菌标准小丸食品(ssniffSoest，德国)和用HCl酸化的自来水。
颈动脉插管术
准备适应了豢养条件的24-31周(平均：25周)龄的肥胖朱克鼠用于研究。在全身麻醉(腹膜内注射0.25ml/kg b.w.Rompun[2％]，BayerVital，德国和0.5ml/kg b.w.Ketamin 10，Atarost GmbH&Co.，Twistringen，德国)下将导管植入肥胖朱克鼠的颈动脉中。允许动物恢复一周。每周用肝素-盐水(100IU/ml)冲洗导管三次。
试验设计
将安慰剂(1ml盐水，0.154mol/l)或剂量逐渐增加的谷氨酰胺酰噻唑烷(5、15和50mg/kg b.w.)给予N＝8只朱克鼠的组。将相应量的谷氨酰胺酰噻唑烷溶于1000μl盐水中。
在禁食过夜后，在-10分钟时经饲管(15G，75mm；Fine ScienceTools，Heidelberg，德国)将安慰剂或测试物质口服给予肥胖朱克鼠。在±0分钟时经第二饲管给予2g/kg b.w.葡萄糖(40％溶液，B.BraunMelsungen，Melsungen，德国)的口服葡萄糖耐量测试(OGTT)。在-30分钟、-15分钟、±0分钟和在5、10、15、20、30、40、60、90和120分钟将来自尾静脉的静脉血样收集入20μl玻璃毛细管中，这些毛细管被放置于填充有1ml溶液的标准管中用于血糖测量。
所有血样均标记有如下数据：
●序号
●动物号
●取样日期
●取样时间
分析方法
用葡萄糖氧化酶法(Super G Glucose分析仪；Dr.MüllerGertebau，Freital，德国)测量葡萄糖水平。
统计方法
用PRISM3.02(GraphPad Software，Inc.)进行统计学评价和制图。以描述方式分析所有的参数，包括平均值和SD。
药物对葡萄糖耐量的影响
安慰剂治疗的糖尿病朱克鼠显示显著升高的血糖移动，表明明显的糖尿病葡萄糖耐量。给予5mg/kg b.w.、15mg/kg和50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰噻唑烷导致糖尿病朱克鼠中升高的血糖水平的显著降低和葡萄糖耐量的改善(参见图7)。
实施例20：口服给予威斯塔鼠后谷氨酰胺酰噻唑烷的体内失活动物试验设计
如实施例9中所述，将谷氨酰胺酰噻唑烷口服给予威斯塔鼠。
分析方法
施用安慰剂或谷氨酰胺酰噻唑烷后，在2.5、5、7.5、10、15、20、40、60和120分钟时从清醒不受约束的大鼠的颈动脉导管取动脉血样，以测定谷氨酰胺酰噻唑烷的降解产物的形成。
为了进行分析，使用在C18柱体上进行的简单固相萃取过程从血浆中分离感兴趣的化合物。用在连接有以大气压化学电离(APCI)阳性模式工作的串联质谱的Lichrospher 60 RP Select B柱上进行的反相液相色谱分析萃取物。使用内标法进行定量。
结果
将谷氨酰胺酰噻唑烷口服给予威斯塔鼠后，发现该化合物的降解。使用LC/MS，可以将降解产物定义为焦谷氨酰胺酰噻唑烷。参见图8和9。