说明书以观音莲明碱为配体的稀土金属配合物及其合成方法和用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及以观音莲明碱为配体的稀土金属配合物及其合成方法和用途。
背景技术
观音莲明碱(Lysicamine)属异喹啉类生物碱，在防己科金线吊乌龟、番荔枝科及睡莲科植物莲荷叶中都有提取出观音莲明碱成分。现代药理研究证明，观音莲明碱具有抗菌消炎及抗肿瘤的作用。从目前对观音莲明碱的研究情况看，主要包括两个方面：一方面为从不同科属(如北马兜铃根、酸枣仁、金线吊乌龟茎叶和凹叶厚朴等)的植物中对其进行定量提取和成分分析；另一方面，则是对其药理活性特别是抗肿瘤活性的研究，研究者已对观音莲明碱的药理作用进行了广泛的研究并取得较大进展，实验证明观音莲明碱具有显著的抗肿瘤、抗病毒、抑菌活性、抗真菌和抗细菌繁殖作用，近来的研究则更加针对于它的抗癌作用和抗HIV作用，已发现观音莲明碱对人类肝癌细胞HepG-2和肺癌细胞NCI-H460的生长具有显著的抑制作用，可以诱发癌细胞的凋亡，并对其作用机制进行了较为系统的探讨。
近年来随着生物无机化学的蓬勃发展无机药物研究成为热点研究领域，尤其以顺铂、卡铂、奥沙利铂等为代表的第一、二、三代铂类抗癌药物作为一线化疗药物的成功应用，真正标志着金属基药物研究与应用新时代的到来。其中，基于药用活性配体的药物无机化学研究在成为最受关注的研究热点之一。稀土元素对于我国具有重要战略价值和广泛应用前景，其中稀土在生物活性方面的应用独具特色，已被研究证明具有抗菌消炎、提高免疫力等功效；同时研究还表明许多蛋白质能够与稀土离子发生相互作用而引起生理活性的变化，如钙调蛋白(CaM)，是一种能够调节生物体内30多种酶的综合调节剂。目前以观音莲明碱为配体合成稀土金属配合物以及此类配合物的合成方法和药理活性研究，尚未有公开的研究成果和技术报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一系列新的以观音莲明碱为配体的稀土金属配合物，以及它们的合成方法和用途。
本发明以观音莲明碱为配体，与某些稀土阳离子进行合成，得到一系列抗肿瘤活性普遍高于观音莲明碱的稀土金属配合物。
观音莲明碱(Lysicamine)的分子式为C18H13NO3，分子量为291.31g/mol，其化学结构式如下式所示(以下所述的LY为观音莲明碱配体简称)：
该分子结构中，观音莲明碱母环的7位杂环N原子与8位羰基O原子具有较强的螯合配位能力，可在配位反应中形成N、O双齿螯合的配位方式，即以观音莲明碱的7-N、8-O两个原子与中心稀土金属阳离子M螯合配位，形成五元环螯合体。基于稀土金属阳离子M的配位方式和配位数，配体LY可与M形成物质的量之比为2:1类型的配合物，相应的配位结构式如如下式所示：
其中，M表示某种选自元素周期表中的三价稀土阳离子。
上述结构式中，所述M优选为LaⅢ、CeⅢ、PrⅢ、SmⅢ或EuⅢ。
上述配合物的合成方法为：按化学计量比称取观音莲明碱配体和稀土金属盐，溶解于极性溶剂中，然后混合进行配位反应(加热或回流)，即得到目标产物。本发明所述的合成方法中，所述作为原料的观音莲明碱配体可按现有技术进行合成或从相应的药用植物中提取，具体可参考现有文献(Bioorganic&Medicinal Chemistry，2004,12(2),439-446.给出文献名称)进行制备；所述观音莲明碱配体和稀土金属盐的物质的量之比通常为1～3：1，所述的稀土金属盐通常为稀土金属的硝酸盐(M(NO3)3·xH2O)。
具体在合成时，可采用溶液法或溶剂热法进行合成。
当采用溶液法合成时，包括以下步骤：
1)按化学计量比称取稀土金属盐和观音莲明碱配体，溶于极性溶剂中，得到混合溶液；
2)所得混合溶液于20℃至极性溶剂的沸点之间反应；
3)所得反应液过滤，沉淀物经洗涤、干燥，即得到相应的稀土金属配合 物。
该方法的步骤1)中，极性溶剂可以是现有技术中常规的选择，优选是采用选自水、甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜、氯仿和二氯甲烷中的一种或它们中任意两种以上的组合。当极性溶剂的选择为它们中两种以上的混合物时，它们之间的配比可为任意配比。所述极性溶剂的用量可根据需要确定，通常情况下，以1mmol的稀土金属盐计算，全部原料所用极性溶剂的总用量一般为10～100mL。在具体的溶解步骤中，可将稀土金属盐和观音莲明碱分别用极性溶剂溶解，再混合在一起反应；也可将稀土金属盐和观音莲明碱混合后再加极性溶剂。
该方法的步骤2)中，反应是否完全通过薄层层析跟踪检测，优选是将混合溶液在60℃至极性溶剂的沸点之间进行回流反应，当反应的时间为8～12h时，产率即可达50％以上；也可根据需要将反应时间控制在12以上。在进行反应时，可以根据反应物的性质，选择适当的反应环境，如对于光敏性物质和易氧化物质，需要分别采取避光和惰性气氛条件等。
该方法的步骤3)中，通常采用水、甲醇、乙醇、甲醇、氯仿或二氯甲烷等极性溶剂洗涤沉淀物。干燥条件可以是在30～80℃条件下的真空干燥或常压干燥。本方法中，产物一般以沉淀的形式生成，如果前序步骤1)中极性溶剂的加入量较大(如接近配比的上限)或选用的极性溶剂对产物的溶解性较好(如二甲基亚砜、丙酮、氯仿或二氯甲烷或它们中任意两种以上的组合等)，则反应后溶液可能呈澄清状态，此时可将反应后溶液减压蒸馏以除去部分溶剂，使产物以晶体形式析出，分离出晶体后再进行下一步操作。
为了加快观音莲明碱的溶解，当选用的极性溶剂中不含有氯仿时，可在混合溶液进行反应之前加入适量的助溶剂(也可以在溶解的时候加)。所述的助溶剂通常选用氯仿，其加入量可根据需要进行选择，具体可以按1mmol的观音莲明碱加入1～10mL氯仿来计算。
当采用溶剂热法合成时，所述的合成方法为：按化学计量比称取稀土金属盐和观音莲明碱配体，加入极性溶剂溶解，所得混合溶液置于容器中，经液氮冷冻后抽至真空，熔封，然后于60～150℃条件下反应，得到相应的稀土金属配合物。
上述溶剂热法中，极性溶剂可以是现有技术中常规的选择，优选是采用选自水、甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜、氯仿和二氯甲烷中的一种或它们中任意两种以上的组合。当极性溶剂的选择为它们中两种以上的混合物时，它们之间的配比可为任意配比。所述极性溶剂的用量可根据需要确定，通常情况下，以1mmol的稀土金属盐计算，全部原料所用极性溶剂的总用量一般为0.5～10mL。在具体的溶解步骤中，可将稀土金属盐和观音莲明碱分别用极性溶剂溶解，再混合在一起反应；也可将稀土金属盐和观音莲明碱混合后再加极性溶剂。该方法中，所述的容器通常为厚壁玻璃管，混合溶液在60～150℃条件下反应的时间通常为12～72h，产率即可在50％以上；也可根据需 要将反应时间延长至72h以上。反应完成后取出厚壁玻璃管，冷却、静置，即有产物生成。分离出产物，经洗涤、干燥后即得到相应的配合物。
本发明还包括上述以观音莲明碱为配体的稀土金属配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还包括上述以观音莲明碱为配体的稀土金属配合物为有效成分制备的抗肿瘤药物。
本发明以观音莲明碱为配体，与多种稀土离子配位反应合成了一系列具有抗肿瘤活性的观音莲明碱稀土金属配合物，通过考察其对多种肿瘤细胞株的抑制作用，发现该类稀土金属配合物表现出比观音莲明碱配体更优越的体外抗肿瘤活性，具有潜在的药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的LaⅢ－LY配合物单晶X射线衍射图；
图2为本发明实施例2制得的CeⅢ－LY配合物单晶X射线衍射图；
图3为本发明实施例3制得的PrⅢ－LY配合物单晶X射线衍射图；
图4为本发明实施例4制得的SmⅢ－LY配合物单晶X射线衍射图；
图5为本发明实施例5制得的EuⅢ－LY配合物单晶X射线衍射图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：以溶液法合成LaⅢ－LY配合物
取2mmol La(NO3)3·6H2O溶于10mL水，1mmol LY溶于20mL氯仿中，两溶液混合后，在65℃下搅拌回流反应12小时，反应完毕后，降至25℃，得到红色的溶液；减压浓缩除去大部分溶剂，有大量沉淀析出，冷却后过滤，所得沉淀经洗涤、干燥，得到红色固体产物(产率66％)。
对所得红色固体进行红外光谱、元素分析、电喷雾质谱、单晶衍射分析，具体波谱特性如下：
(1)红外光谱：IR(KBr):(Ar-H)2944(m),(C＝O)1609(m),(C＝C)1576/1481/1465(s),(C-O)13281267(vs),(C-N)1014(s)cm-1。
(2)元素分析：Anal.Calc.(for C36H26LaN5O15)C％：47.64；H％:2.890；N％:7.72Found.C％:47.42；H％:2.911；N％:7.70。
(3)电喷雾质谱:ESI-MS m/z:845.06,[La(LY)2(NO3)2]+，其中M为化合物的分子量。
(4)X射线单晶衍射谱，其谱图如图1所示。
因此可确定该产物为配合物[C36H26LaN5O15]。
实施例2：以溶液法合成CeⅢ-LY配合物
取2mmol Ce(NO3)3·6H2O溶于15mL乙醇，1mmol LY溶于10mL氯仿中，两溶液混合后，在70℃下搅拌回流反应8小时，反应完毕后，降至25℃，得到红色的溶液；过滤该溶液，将滤液减压浓缩除去大部分溶剂，静置，析出，分离得到红色晶体，洗涤、干燥，得到红色晶体产物(产率60％)。
对所得红色晶体进行红外光谱、元素分析、电喷雾质谱、单晶衍射分析，具体波谱特性如下：
(1)红外光谱：IR(KBr):(Ar-H)2942(m),(C＝O)1609(m),(C＝C)1577/1482/1466(s),(C-O)1329/1268(vs),(C-N)1013(s)cm-1。
(2)元素分析：Anal.Calc.(for C36H26N5O15Ce)C％：47.58；H％:2.88；N％:7.71Found.C％:47.43；H％:2.923；N％:7.69。
(3)电喷雾质谱，：ESI-MS m/z:846.06,[Ce(LY)2(NO3)2]+,其中M为化合物的分子量。
(4)X射线单晶衍射分析，其谱图如图2所示。
因此可确定该产物为配合物[C36H26CeN5O15]。
实施例3：以溶液法合成PrⅢ-LY配合物
取2mmol Pr(NO3)3·6H2O溶于10mL乙醇，1mmol LY溶于10mL乙醇中，两溶液混合后，在65℃下搅拌回流反应10小时，反应完毕后，降至25℃，得到红色的溶液；过滤该溶液，滤液减压浓缩除去大部分溶剂，静置，析出，分离得到红色晶体，洗涤、干燥，得到红色晶体产物(产率53％)。
对所得红色晶体进行红外光谱、元素分析、电喷雾质谱、单晶衍射分析，具体波谱特性如下：
(1)红外光谱：IR(KBr):(Ar-H)2938(m),(C＝O)1609(m),(C＝C)1578/1482/1411(s),(C-O)13091268(vs),(C-N)1014(s)cm-1。
(2)元素分析：Anal.Calc.(for C36H26CeN5O15)C％：47.58；H％:2.88；N％:7.71Found.C％:47.43；H％:2.923；N％:7.69。
(3)电喷雾质谱：ESI-MS m/z:847.06,[Pr(LY)2(NO3)2]+,其中M为化合物的分子量。
(4)X射线单晶衍射谱，其谱图如图3所示。
因此可确定该产物为配合物[C36H26PrN5O15]。
实施例4：以溶液法合成SmⅢ-LY配合物
2mmol Sm(NO3)3·6H2O溶于10mL二甲基亚砜，1mmol LY溶于10mL丙酮中，两溶液混合后，在65℃下搅拌反应9小时，回流反应是否完全可采用薄层层析跟踪检测，反应完毕后，降至25℃，得到红色的溶液；过滤该溶液，滤液减压浓缩除去大部分溶剂，静置，析出，分离得到红色晶体，洗涤、干燥，得到红色晶体产物(产率53％)。
对所得红色晶体进行红外光谱、元素分析、电喷雾质谱、单晶衍射分析，具体波谱特性如下：
(1)红外光谱：IR(KBr):(Ar-H)2948(m),(C＝O)1610(m),(C＝C)1578/1482/1411(s),(C-O)13111269(vs),(C-N)1015(s)cm-1。
(2)元素分析:Anal.Calc.(for C36H26SmN5O15)C％：47.05；H％:2.85；N％:7.62；Found.C％:46.83；H％:2.951；N％:7.54。
(3)电喷雾质谱:ESI-MS m/z:509.8[SmⅢ+LY+NO3+H2O-CH3]+,其中M为化合物的分子量。
(4)X射线单晶衍射谱，其谱图如图4所示。
因此可确定该产物为配合物[C36H26SmN5O15]。
实施例5：以溶液法合成EuⅢ-LY配合物
2mmol Sm(NO3)3·6H2O溶于10mL乙醇，1mmol LY溶于10mL二氯甲烷中，两溶液混合后，在80℃下搅拌回流反应8～12小时，反应完毕后，降至常温，得到红色的溶液；过滤溶液，将反应后溶液浓缩除去大部分溶剂，静置，析出，分离得到红色晶体，得到红色晶体产物(产率70％)。
对所得红色晶体进行红外光谱、元素分析、电喷雾质谱、单晶衍射分析，具体波谱特性如下：
(1)红外光谱：IR(KBr):(Ar-H)2943(m),(C＝O)1610(m),(C＝C)157914821412(s),(C-O)13081269(vs),(C-N)1015(s)cm-1。
(2)元素分析：Anal.Calc.(for C36H26EuN5O15)C％：46.97；H％:2.85；N％:7.61Found.C％:46.90；H％:2.94；N％:7.58。
(3)电喷雾质谱：ESI-MS m/z:859.07[Eu(LY)2(NO3)2]+,其中m为化合物的分子量。
(4)X射线单晶衍射谱，其谱图如图5所示。
因此可确定该产物为配合物[C36H26EuN5O15]。
实施例6：溶剂热法合成LaⅢ-LY配合物
称取LY有(0.05mmol,0.0145g)加入到一端封闭的25cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加2mL CHCl3和1mL CH3OH，然后称取La(NO3)3·6H2O(0.1mmol,0.0309g)加入到玻璃管中，液氮冷冻后并在抽真空条件下将开口端熔封,冷却混合均匀后置于80℃烘箱中，反应48小时后梯度降温管内生成红色六方块状晶体,反应后除去溶剂，取出所得的红色固体以水洗、乙醇洗，以去除未反应物及杂质，40℃真空干燥12小时，此产物经过红外光谱、通过电喷雾质谱，X射线单晶衍射，确定为配合物[C36H26LaN5O15](Yield:68％)。
实施例7：溶剂热法合成CeⅢ-LY配合物
称取LY(0.05mmol,0.0145g)加入到一端封闭的25cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加2mL CH3CH2OH，然后称取Ce(NO3)3·6H2O(0.1mmol,0.0434g)加入到玻璃管中，液氮冷冻后并在抽真空条件下将开口端熔封, 冷却混合均匀后置于100℃烘箱中，反应48小时后梯度降温管内生成红色六方块状晶体,反应后除去溶剂，取出所得的红色固体以水洗、乙醇洗，以去除未反应物及杂质，40℃真空干燥12小时，此产物经过红外光谱、通过电喷雾质谱，X射线单晶衍射，确定为配合物[C36H26CeN5O15](Yield:50％)。
实施例8：溶剂热法合成PrⅢ-LY配合物
分别称取LY(0.05mmol,0.0145g)和Pr(NO3)3·6H2O(0.1mmol,0.0435g)加入到一端封闭的25cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加1.5mL CHCl3和1mL CH3OH，液氮冷冻后在抽真空条件下将开口端熔封，混合均匀后置于60℃烘箱中，反应72小时后程序降温，管内生成深红色块状晶体，反应后除去溶剂，取所得的红色固体以水洗、乙醇洗，以去除未反应物及杂质，40℃真空干燥12小时，此产物经过红外光谱、通过电喷雾质谱，X射线单晶衍射，确定为配合物[C36H26PrN5O15](Yield:60％)。
实施例9：溶剂热法合成SmⅢ-LY配合物
分别称取LY(0.05mmol,0.0146g)和Sm(NO3)3·6H2O(0.1mmol,0.0444g)加入到一端封闭的25cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加1.5mL CH3OH，液氮冷冻后在抽真空条件下将开口端熔封，混合均匀后置于120℃烘箱中，反应72小时后程序降温，管内生成深红色块状晶体，反应后除去溶剂，取所得的红色固体以水洗、乙醇洗，以去除未反应物及杂质，40℃真空干燥12小时，此产物经过红外光谱、通过电喷雾质谱，X-射线单晶衍射分析，确定为配合物[C36H26SmN5O15](Yield:55％)。
实施例10：溶剂热法合成EuⅢ-LY配合物
分别称取LY(0.05mmol,0.0146g)和Eu(NO3)3·6H2O(0.1mmol,0.0446g)加入到一端封闭的25cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加1.5mL CH2Cl2，液氮冷冻后在抽真空条件下将开口端熔封，混合均匀后置于80℃烘箱中，反应72小时后降温，管内生成深红色块状晶体，反应后除去溶剂，取所得的红色固体以水洗、乙醇洗，以去除未反应物及杂质，40℃真空干燥12小时，此产物经过红外光谱、通过电喷雾质谱，X射线单晶衍射，确定为配合物[C36H26EuN5O15](Yield:65％)。
为了充分说明本发明所述的观音莲明碱稀土金属配合物在制药中的用途，申请人对本发明实施例1～5制得的稀土金属配合物进行了抗肿瘤活性实验。
一、稀土配合物及观音莲明碱配体对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性实验：
1、细胞株与细胞培养
本实验选用人肝癌细胞HepG-2、膀胱癌细胞株T-24、人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人肝癌细胞BEL-7404、等4种人类肿瘤细胞株和人正常肝细胞HL-7702。
所有细胞株均培养在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO2孵箱中培养。
2、待测化合物的配制
所用的配合物的纯度≥95％，将其DMSO储液用生理缓冲液稀释后配制成20μmol/L的终溶液，其中助溶剂DMSO的终浓度≤1％，测试该浓度下配合物对各种肿瘤细胞生长的抑制程度。
3、细胞生长抑制实验(MTT法)
(1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配制成个数浓度为5000/mL的细胞悬液，以每孔180μL接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000孔(边缘孔用无菌PBS填充)；
(2)5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设5个复孔；
(3)5％CO2，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察；
(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4h；
(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；
(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)。
(7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用下述公式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，再以Bliss法分别计算稀土配合物对上述几种肿瘤细胞株的IC50值。其结果如以下表1所示。
表1：配合物对不同肿瘤细胞株的IC50值(μM)
从IC50的结果来看，观音莲明碱配体及其稀土金属配合物对5种肿瘤细胞株都表现一定的增殖抑制活性，其中稀土金属配合物对人大细胞肺癌细胞NCI-H460和膀胱癌细胞株T-24的抗肿瘤活性较强，而对人正常肝细胞HL-7702相对较弱。由表中数据可见，稀土金属配合物配合物表现出比配体更高的活性，形成配合物后，活性得以增强,同时对癌细胞与正常细胞具有抗癌选择性。
由上述体外抗肿瘤活性测试结果可以看出，本发明所述的多种观音莲明碱配体的稀土金属配合物均表现出显著的广谱抗肿瘤活性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。