一种创伤弧菌快速检测试剂盒.pdf

本发明提供了一种创伤弧菌的快速检测试剂，本发明通过优化试剂组分，调整了表面活性剂的组分，同时加入水解酶UNG酶的方式，加快了反应速度，在较短的时间内，达到与常规检测方法等效的程度，这大大缩短了临床检测的应用时间，同时未影响临床结果的判断，能够快速的获得准确检测结果，对于海洋创伤弧菌的检测具有很大的临床应用价值。

权利要求书
1.  一种检测创伤弧菌的快速试剂盒，其特征在于，包括以下含量及体积的试剂：
（1）10×反应缓冲液                       2.5μL
（2）dNTP Mixture    10mM each         3.5μL
（3）表面活性剂
甜菜碱     5mmol/L                            2μL
AEO-9     5mmol/L                             2μL
（4）MgSO4     150mmol/L                   1μL
（5）Bst酶      16KU/mL                     0.5μL
（6）UNG酶     16KU/mL                   0.5μL
（7）钙黄绿素 4mmol/L                   1μL
（8）去离子水                                    4μL
（9）FIP引物        20umol/L                  2μL
BIP引物       20umol/L                       2μL
F3引物       5 umol/L                         1μL
B3引物       5 umol/L                         1μL ；
 （10）阳性对照DNA   10umol/L  ；
所述10×反应缓冲液包含以下含量的组分：
Tris-HCl缓冲液    PH 8.8             200mM
KCl                                             100mM
(NH4)2SO4                                                    100mM
MgSO4                                                              20mM
Triton X-100                                  1% ；
所述FIP引物的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的BIP引物的碱基序列如SEQ IN NO :2所示；
所述的F3引物的碱基序列如SEQ ID NO :3所示；
所述的B3引物的碱基序列如SEQ ID NO :4所示。

说明书一种创伤弧菌快速检测试剂盒
技术领域：
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种创伤弧菌快速检测试剂盒。
背景技术：
创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)是一种广泛分布于亚热带浅海水域及海产品如贝类、虾、蟹等，气候温暖的六月至十月，海中此类淡菌浓度高。创伤弧菌是革兰氏阴性菌，具移动性、弯曲的杆菌，单独存在或尾端连扬戊"C”或者“S"型。对酸吐敏感，pH6以下就不生长。目前已发现100多种，其中至少4种会致病。创伤弧菌的感染造成临床上的病症有两种：1、原发吐败血症(primary septicemia)此由肠胃感染引起的，是由于吃入生的或未煮熟的鱼虾类或生蚝，病人会有发热、恶心、呕吐、皮肤病变、坏死胜溃烂及败曲一症休克等症状。创伤弧菌可放出强烈毒素进入血液，将引起败血病及体克，诱发全身器官衰竭导致死亡，死亡率高达50%以上，如果因而休克，死亡率更是在百分之九十以上；2、伤口感染(infected wound)慢性肝炎患者或者免疫力弱的人，若皮肤有伤口又接触到含有病菌的海水或被虾、蟹类刺伤，就有可能被创伤弧菌感染。感染该菌种的初期，在感染部位有肿胀、红斑、进而形成水泡，之后伤口溃烂蔓延，创伤弧菌会入侵筋膜和肌肉的间隙，出现组织坏死或严重的蜂窝性组织炎，然后病菌沿着间隙直上继续感染。创伤弧菌感染病情发展快速，通常脚趾头蔓延到大腿只需一到两天时间。有时候甚至需要截肢来阻止感染蔓延，如果不幸很可能引发次发性败血症造成死亡，死亡率约为24%。
在LAMP反应中，不需要通过热变性将双链DNA变成单链， 因为双链DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任伺一条引物与双链DNA的互补链部位进行碱基互补配对延伸时，另一条链就会脱落成为单链。
LAMP的原理：环介导等温扩增技术是2000年由日本Notomi T等人研发的核酸扩增方法，其原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase )，在恒温条件(65℃左右)保温约1h，即可完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带，并可通过设计两条环引物使反应速度提升1/2~1/3。在DNA延伸合成时，从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合，产生焦磷酸镁衍生物，呈现白色沉淀，只需肉眼观察即能判断扩增与否；亦可用结合双链DNA的荧光染料SYBR GreenI染色，在紫外灯或日光照射透视下呈现强荧光。如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变。
LAMP的优点：环介导等温扩增技术具有以下优点：(1)特异性强：4条引物(或6条引物)对靶序列的6个特异序列区的识别，受非靶序列的影响小，保证了LAMP扩增的高度特异性；(2)敏感性高：检测限更低，仅为6个拷贝，高于PCR法；(3)快速：在1h内可将靶序列扩增至10--9~1010倍，产率可达到0.5 m g/mL 。向反应体系中添加2条环引物(Loop Primers )，可进一步提高LAMP反应的速度，缩短反应时间：(4)操作简便：不需PCR仪和特殊试剂，只需一恒定温度，即能扩增目标基因，模板也不需要热变性。扩增产物不需繁琐的电泳，肉眼即可判断。加入逆转录酶，还可进行RT LAMP，完成针对RNA病毒的扩增；(5)实时定量：可克服常规PCR只能定性检测的不足。可见，LAMP有利于在一些基层机构的应用和大规模样品的检测，为食品检测技术的发展提供了有力的技术支持，在食品卫生质量检验、临床疾病诊断及微阵列基因芯片的开发等领域具有广阔的应用前景。
因海洋创伤弧菌的危害性和快速发病的特点，需要快速进行检测。为了加快反应的速度，将常规的LAMP法检测创伤弧菌进行优化，选择了适宜的引物，通过两种表面活性剂的作用，增加反应组分的有效接触面积，加快反应的进行。试剂组分中加入与聚合酶等量的水解酶（UNG酶），可以有效将扩增反应时间控制在30分钟，比常规检测检测方法用时（50分钟）要短，加快了临床的检测时间，增强了LAMP法检测创伤弧菌的应用性。
发明内容
针对创伤弧菌检测试剂盒（LAMP法）检测时间较长的问题，本发明提供了一种创伤弧菌快速检测试剂盒（LAMP法）。本发明优化了组分，通过调整表面活性剂和加入UNG酶的作用，加快了检测的时间，增强了试剂的临床检测应用。
本试剂盒包括以下组分及含量的试剂：
（1）10×反应缓冲液                      2.5μL
（2）dNTP Mixture    10mM each          3.5μL
（3）表面活性剂
甜菜碱     5mmol/L                           2μL
AEO-9     5mmol/L                            2μL
（4）MgSO4     150mmol/L                  1μL
（5）Bst酶      16KU/mL                    0.5μL
（6）UNG酶     16KU/mL                   0.5μL
（7）染料    钙黄绿素 4mmol/L            1μL
（8）去离子水                                  4μL
（9）FIP引物        20umol/L             2μL
BIP引物       20umol/L                    2μL
F3引物       5 umol/L                      1μL
B3引物       5 umol/L                      1μL ；
（10）阳性对照DNA   10umol/L  ;
用两条外引物扩增出创伤弧菌vvhA基因后，取其片段（217bp）重组入质粒所得。
所述10×反应缓冲液 包含以下含量的组分：
Tris-HCl缓冲液    PH 8.8              200mM
KCl                                         100mM
(NH4)2SO4                                                100mM
MgSO4                                                        20mM
Triton X-100                                 1% ；
所述FIP引物的碱基序列如下：
5’AATCCGCGTCCCAGGCTTTCCTGACGCCAACGCCTTCCGTT’3 （SEQ ID NO:1）
BIP引物的碱基序列：
5’AGCGTGTCCAGTCCGTCTAGCGCCAGTGCCCACAGGTCGTG’3  (SEQ IN NO :2)
F3引物的碱基序列：
5’CAACGTCACCATGGGCGTTA ’3  (SEQ ID NO :3)
B3引物的碱基序列：
5’GCTTTAGAAGTCTTATGACC ’3  (SEQ ID NO :4)
本试剂盒使用过程的主要步骤如下：
1、 取各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存。
2、 预混溶液的配制（请在冰上进行）
（1）反应按照下表比例进行配制（1次反应量）

（2）分装后，请轻轻弹击试管，使其充分混合后放入简易微量离心机中离心数秒，以此作为预混溶液。
（3）样本反应加入2uL样本DNA；阴性对照反应使用去离子水2uL；阳性对照反应使用阳性对照DNA 2uL，使总量达到25ul。
（4）扩增反应
1）将已配制好、分装完毕的反应试管置于恒温金属浴中，在63℃条件下反应30分钟。
2）80℃条件下恒温5分钟或95℃条件下恒温2分钟，使酶灭活以终止反应。
【结果判读】
若与阳性对照一样发出黄绿色荧光，则判定为阳性；若与阴性对照一样未发出荧光，则判定为阴性。
本发明优化了组分，通过调整表面活性剂和加入UNG酶的作用，加快了检测的时间，增强了试剂的临床检测应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
现有资料显示常规临床检测海洋创伤弧菌检测（LAMP法）试剂的组成和检测方法如下：
（1）10*反应缓冲液※1
（2）dNTP Mixture:10mM each
（3）甜菜碱：5mol/L
（4）MgSO4:150mmol/L
（5）Bst酶：8000U/mL
（6）染料:钙黄绿素 4mmol/L
（7）去离子水
（8）FIP引物  20umol/L
     BIP引物   20umol/L
     F3引物    5 umol/L
     B3引物   5 umol/L
（9）阳性对照DNA※2  10 umol/L
※1:组成
Tris-HCl （PH 8.8）       200mM
KCl                            100mM
(NH4)2SO4                                  100mM
MgSO4                                         20mM
Triton X-100              1%
※2:阳性对照DNA，是用两条外引物扩增出创伤弧菌vvhA基因后，取其片段（217bp）重组入质粒所得。
【操作步骤】
1 取-20℃下保存的各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存。
2 预混溶液的配制（请在冰上进行）
（1）反应按照下表比例进行配制（1次反应量）

（2）分装后，请轻轻弹击试管，使其充分混合后放入简易微量离心机中离心数秒，以此作为预混溶液。
（3）样本反应加入2uL样本DNA；阴性对照反应使用去离子水2uL；阳性对照反应使用阳性对照DNA 2uL，使总量达到25ul。
（4）扩增反应
 1）将已配制好、分装完毕的反应试管置于恒温金属浴中，在63℃条件下反应50分钟。
 2）80℃条件下恒温5分钟或95℃条件下恒温2分钟，使酶灭活以终止反应。
实施例2
    本发明试剂组成和检测方法如下：
（1）10×反应缓冲液
Tris-HCl （PH 8.8）             200mM
KCl                            100mM
(NH4)2SO4                                  100mM
MgSO4                                       20mM
Triton X-100                      1%
（2）dNTP Mixture:10mM each
（3）表面活性剂（甜菜碱5mmol/L、AEO-9 5mmol/L）
（4）MgSO4:150mmol/L
（5）Bst酶：16KU/mL
（6）UNG酶：16KU/mL
（7）染料:钙黄绿素 4mmol/L
（8）去离子水
（9）FIP引物    20umol/L
BIP引物      20umol/L
F3引物      5 umol/L
B3引物     5 umol/L
（10）阳性对照DNA    10 umol/L
用两条外引物扩增出创伤弧菌vvhA基因后，取其片段（217bp）重组入质粒所得。
本试剂盒主要的操作步骤：
1 取-20℃下保存的各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存。
2 预混溶液的配制（请在冰上进行）
（1）反应按照下表比例进行配制（1次反应量）

（2）分装后，请轻轻弹击试管，使其充分混合后放入简易微量离心机中离心数秒，以此作为预混溶液。
（3）样本反应加入2uL样本DNA；阴性对照反应使用去离子水2uL；阳性对照反应使用阳性对照DNA 2uL，使总量达到25ul。
（4）扩增反应
1）将已配制好、分装完毕的反应试管置于恒温金属浴中，在63℃条件下反应30分钟。
2）80℃条件下恒温5分钟或95℃条件下恒温2分钟，使酶灭活以终止反应。
实施例3
利用实施例1和实施例2的试剂，对50例临床样本进行检测，检测结果利用四格表分析如下：

A：本试剂诊断阳性；B：假阳性；C：假阴性；D：本试剂诊断阴性。
阳性符合率=A /（A+C）×100%=22/22×100%=100%
阴性符合率=D /（B+D）×100%=26/28×100%=92.9%
总符合率= （A+D）/（A+B+C+D）×100%=48/50×100%=96%
实施例2为本发明的试剂组分，在常规试剂（实施例1）组分和原理的基础上，修改了引物的组分，加入推动反应的表面活性剂，通过本发明与常规检测方法比对，总符合率为96%，能够达到临床中90%符合要求，说明了本发明的试剂组分，虽然在检测时间上缩短了，但是检测结果能够与临床常规检测方法的结果一致，在有效加快反应的基础上，对试剂应用没有影响。针对于2例利用本发明试剂检测为阳性的样本，送交第三方检测机构进行PCR检测后，确定为阳性，说明本发明的试剂更加的准确。
实施例4
    试剂组成和检测方法如下：
（1）10×反应缓冲液
Tris-HCl （PH 8.8）             200mM
KCl                            100mM
(NH4)2SO4                                  100mM
MgSO4                                       20mM
Triton X-100                      1%
（2）dNTP Mixture:10mM each
（3）表面活性剂（甜菜碱5mmol/L、AEO-9 5mmol/L）
（4）MgSO4:150mmol/L
（5）Bst酶：16KU/mL
（6）UNG酶：16KU/mL
（7）染料:钙黄绿素 4mmol/L
（8）去离子水
（9）FIP引物    20umol/L
BIP引物    20umol/L
F3引物    5 umol/L
B3引物    5 umol/L
（10）阳性对照DNA    10 umol/L
用两条外引物扩增出创伤弧菌vvhA基因后，取其片段（217bp）重组入质粒所得。
本试剂盒主要的操作步骤：
1 取-20℃下保存的各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存。
2 预混溶液的配制（请在冰上进行）
（1）反应按照下表比例进行配制（1次反应量）

（2）分装后，请轻轻弹击试管，使其充分混合后放入简易微量离心机中离心数秒，以此作为预混溶液。
（3）样本反应加入2uL样本DNA；阴性对照反应使用去离子水2uL；阳性对照反应使用阳性对照DNA 2uL，使总量达到25ul。
（4）扩增反应
1）将已配制好、分装完毕的反应试管置于恒温金属浴中，在63℃条件下反应50分钟。
2）80℃条件下恒温5分钟或95℃条件下恒温2分钟，使酶灭火以终止反应。
    利用实施例1、实施例2、实施例4对灵敏度进行检测，同一阳性样本，利用阴性样本进行梯度稀释，稀释梯度如下表所示。
结果如下表所示。
通过检测，虽然实施例4将反应时间进行延长，但是对于检测结果没有影响，说明了本发明的试剂在预期的30分钟就可以扩增完成，与实施例1（常规试剂）检测对比显示，优化后的组分，明显缩短了检测时间。
本发明通过优化试剂组分，调整了表面活性剂的组分，同时加入水解酶UNG酶的方式，加快了反应速度，在较短的时间内，达到与常规检测方法等效的程度，这大大缩短了临床检测的应用时间，同时未影响临床结果的判断，能够快速的获得准确检测结果，对于海洋创伤弧菌的检测具有很大的临床应用价值。