检测血清中HDAC1MRNA转录水平的RTPCR引物、评估高血糖人群并发肠癌易感性的试剂盒及评估方法.pdf

本发明涉及一种RT-PCR试剂盒及利用该试剂盒评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法。属于实时荧光定量逆转录聚合酶链反应试剂盒开发与人体病理学相结合的技术领域。检测血清中GPR78mRNA转录水平的RT-PCR引物：引物F：5’-GCTCCACATCAGTCCTTCC-3’；引物R：5’-GGTCGTCTTCGTCCTCATC-3’。本发明建立了利用特异性引物检测外周静脉血清HDAC1 mRNA的方法；由于本方法采用了定量PCR扩增技术，使得检测HDAC1 mRNA的敏感性大大提高，能保证在极少的标本中获得足够的信息。

权利要求书
1.  检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物，其特征在于：
引物F：5’- GCTCCACATCAGTCCTTCC -3’；
引物R：5’- GGTCGTCTTCGTCCTCATC -3’。

2.  检测血清中HDAC1 mRNA转录水平用于评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的RT-PCR试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的RT-PCR引物。

3.  根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于还包含内参引物，所述内参引物如下：
引物F：5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3'；
引物R：5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。

4.  根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于还包含RNA提取试剂、逆转录试剂和PCR反应液；
所述RNA提取试剂的组分及浓度如下：Trizol试剂355～800ml、氯仿200～400μL、异丙醇600～1000μL、无水乙醇1.75～5.00mL、DEPC水290～1000μL；
所述逆转录试剂组分及浓度如下：150～250U/μL逆转录酶2μL、4～6×逆转录缓冲液4μL、12～50 mmol/L dNTPs 4μL、0.1～1.2mol/L DTT 2μL、35～45U/μL RNA酶抑制剂0.5μL；
所述PCR反应液组分及浓度如下：Syber GreenⅠ荧光核酸染料25μL、DNA聚合酶100U/ml、dNTPs 0.2 mmol/L、氯化镁6 mmol/L、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐16.5 mmol/L、氯化钾89.3 mmol/L、DEPC水50μL～60μL。

5.  根据权利要求4所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于所述Trizol试剂具体为：重蒸苯酚200mL、8-羟基喹啉0.2g 、β- 巯基乙醇1.2g /二硫苏糖醇0.5g 、异硫氢酸胍100g 、蒸馏水118mL 、0.75M 柠檬酸钠7.04mL 、10％十二烷基肌氨酸钠10.56mL和2M 醋酸钠20mL。

6.  根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于逆转录反应体系如下：
引物F                     1μL、
引物R                     1μL、
RNA模板                  2μL、
逆转录酶                  2μL、
5×逆转录缓冲液          4μL、
25mM  dNTPs             4μL、
0.1 M  DTT                2μL、
RNA酶抑制剂              0.5μL
DEPC水 余量
总体积                20μL。

7.  根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于扩增体系如下：
引物F                     1μL、
引物R                     1μL、
cDNA模板                 2μL、
SYBR Green I荧光核酸染料   2μL
DEPC水                   余量
总体积                50μL。

8.  通过检测血清中HDAC1 mRNA转录水平来评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法，包括以下步骤：
血清总RNA的提取
收集评估对象的清晨空腹外周静脉血5ml，置于冷冻离心机中，4℃下调整转速2500-3000 r/min，离心8-10min后用无菌吸管吸取血清2 ml～3ml；
将上述血清加入含有1mL Trizol试剂的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于冰上；
置于超净台中，温育5min，12000r/min，离心10min；
吸上清于新的1.5mL离心管中，加入200μL的氯仿，摇匀，室温静置2min，4℃，12000r/min，离心10min；
吸取上清于新的1.5mL离心管中，加入600μL的异丙醇，混合均匀，室温静置15min，4℃，12000r/min，离心15min，弃上清；
加入1mL75%的无水乙醇漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清；所述75%的无水乙醇的组成为750μL无水乙醇+250μL DEPC水；
加入1mL无水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清，室温干燥10min；
加入40μL的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存备用；
逆转录合成cDNA
采用权利要求6所述的RT-PCR试剂盒进行逆转录，反应程序：42℃，50min；85℃，5min；反应结束后离心，置于-20℃保存；
Real-time PCR扩增
采用权利要求7所述RT-PCR试剂盒进行扩增，反应程序如下：95℃ ，10min；95℃，15 Sec； 60℃，1min；95℃，15 Sec；60℃，15 Sec；
验证目的基因表达
分析统计HDAC1 mRNA的相对表达量，采用SDS 2.3软件分析结果，Ct为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，采用比较Ct值法计算样本中HDAC1 mRNA 相对表达量；计算2^(-△Ct)值表示样品中目的基因初始mRNA相对表达量，△Ct是同一个样本中目的基因Ct值减去内参Ct值；按2^(-△Ct)换算成基因表达量；以样本2的2^(-△Ct)值校正为1作为参照，计算出目的基因的相对表达量；使用SPSS19.0统计软件，计数数据以均数±标准差                                               表示；以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有显著统计学意义。

说明书检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物、评估高血糖人群并发肠癌易感性的试剂盒及评估方法
检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物、用于评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的RT-PCR试剂盒及评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法。
技术领域

本发明涉及一种引物、试剂盒以及评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法；尤其涉及一种检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物、用于评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的RT-PCR试剂盒及评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法。属于实时荧光定量逆转录聚合酶链反应试剂盒开发与人体病理学相结合的技术领域。
背景技术
据世界卫生组织（WHO）统计，全世界逾2.2亿人患有糖尿病，2004年有340万人死于高血糖引发的严重并发症，至2030年因患糖尿病而死亡的人数将再增加一倍。在年龄≧20岁的中国人群中，糖尿病和糖尿病前期患病率分别为9.7%和15.5%，以此推算目前中国有近一亿成年人患有糖尿病，约1.5亿成年人处于糖尿病前期，中国已成为世界上糖尿病患者最多的国家。
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约100万新发病例，在恶性肿瘤发病率居第3～5位，并呈逐年上升趋势；其死亡率约为20.51%，居第4～5位；我国结直肠癌每年新发病例高达13万～16万人，目前患病率已经高达69.9/10万，已经成为中国三大癌症之一，全国肿瘤登记中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》统计结直肠癌已达肿瘤发病率、死亡率的第五位，并逐年升高。
国内外多项流行病学证实糖尿病与结直肠癌发病率及预后密切相关，高血糖状态被认为是结直肠癌发病及进展的重要危险因素之一。糖尿病尤其是2型糖尿病与结直肠癌具有诸多共同的发病风险因素，如肥胖、高热量饮食、缺乏运动等。对于某些高血糖人群（尤其是T2DM患者）可能已成为易患结直肠癌的高危人群。长期的高血糖状态可能通过激活某些基因表达，进而参与了结直肠癌的发生发展。因此，筛选出可用于高血糖人群并发结直肠癌易感性预警、病程及预后评估的糖尿病并发结直肠癌分子标志物，进而进行有针对性地早诊早治，对肿瘤患者的病程及预后判断、治疗方案制定、生存率提高及生活质量的改善均具有重要意义。
1983 年Mμllis 发明了聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术。PCR技术是一种体外核酸扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。由于该项技术具有简便快速、特异性和灵敏度高、重复性好等突出优点，因此被广泛应用于基础研究和临床诊断。但是传统的PCR 技术在应用中存在着不能对特定mRNA 进行准确定量，以及操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，因此不能够满足实际工作需要，使其应用受到限制。
随着实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR, qPCR）的出现，人们可以真正做到对PCR 样本中微量mRNA 的精确定量。qPCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程，并能对起始模板进行定量分析。RT-PCR需要荧光探针参与，在PCR 的反应体系中加入一对含有待测基因特定碱基的引物序列，该引物序列能与模板核酸发生特异性杂交。PCR 每复制一个核苷酸片段，就有一个荧光信号被释放出来，产物与荧光信号产生一对一的对应关系。随着产物的增加，荧光信号亦随之增强，当信号增强到某一阈值时（根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，计算出99.7％的置信度大于平均值的荧光值，即为阈值），此时的循环次数即循环阈值Ct(cycle threshold，Ct) 被记录下来。该循环参数Ct 和PCR 体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系。利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的Ct 值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟合制成标准曲线，再根据待测样品的Ct 值就可以准确的确定起始模板的数量，因此根据PCR 产物的荧光强度即可计算出初始模板的数量。实时荧光定量PCR 具有特异性强、灵敏度高、定量准确、操作安全等优点，使用该方法扩增特异性mRNA，是一种高灵敏度、高特异性、操作简便的方法。
因此，本领域迫切希望利用RT-qPCR技术将高血糖人群的状态予以监控，届时将容易地评估高血糖人群并发结直肠癌的易感性及预后，有助于糖尿病并发结直肠癌患者的早期预警、早诊早治、预后评估，对于降低我国糖尿病、结直肠癌的高发病率、高致死率具有重大的应用价值。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物。
本发明解决上述问题的技术方案如下：
检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物：
引物F：5’-GCTCCACATCAGTCCTTCC -3’；引物R：5’- GGTCGTCTTCGTCCTCATC-3’。
本发明的还提供了另一种技术方案，如下：
检测血清中HDAC1 mRNA转录水平用于评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的RT-PCR试剂盒，包含上述RT-PCR引物。
作为上述技术方案的优选，还包含内参引物，所述内参引物如下：
引物F：5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3'；
引物R：5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。
作为上述技术方案的优选，还包含RNA提取试剂、逆转录试剂和PCR反应液；
所述RNA提取试剂的组分及浓度如下：Trizol试剂355～800ml、氯仿200～400μL、异丙醇600～1000μL、无水乙醇1.75～5.00mL、DEPC水290～1000μL；
所述逆转录试剂组分及浓度如下：150～250U/μL逆转录酶2μL、4～6×逆转录缓冲液4μL、12～50 mmol/L dNTPs 4μL、0.1～1.2mol/L DTT 2μL、35～45U/μL RNA酶抑制剂0.5μL；
所述PCR反应液组分及浓度如下：Syber GreenⅠ荧光核酸染料25μL、DNA聚合酶100U/ml、dNTPs 0.2 mmol/L、氯化镁6 mmol/L、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐16.5 mmol/L、氯化钾89.3 mmol/L、DEPC水50μL～60μL。
作为上述技术方案的优选，所述Trizol试剂具体为：重蒸苯酚200mL、8-羟基喹啉0.2g 、β- 巯基乙醇1.2g /二硫苏糖醇0.5g 、异硫氢酸胍100g 、蒸馏水118mL 、0.75M 柠檬酸钠7.04mL 、10％十二烷基肌氨酸钠10.56mL和2M 醋酸钠20mL。
作为上述技术方案的优选，逆转录反应体系如下：
引物F                     1μL、
引物R                     1μL、
RNA模板                  2μL、
逆转录酶                  2μL、
5×逆转录缓冲液          4μL、
25mM  dNTPs             4μL、
0.1 M  DTT                2μL、
RNA酶抑制剂              0.5μL
DEPC水                                余量
总体积                      20μL。
作为上述技术方案的优选，扩增体系如下：
引物F                     1μL、
引物R                     1μL、
          cDNA模板                 2μL、
          SYBR Green I荧光核酸染料   2μL
DEPC水                   余量
总体积                     50μL。
本发明的再一个目的是提供通过检测血清中HDAC1 mRNA转录水平来评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法，其技术方案如下：
通过检测血清中HDAC1 mRNA转录水平来评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法，包括以下步骤：
一、         血清总RNA的提取
（1）   收集评估对象的清晨空腹外周静脉血5ml，置于冷冻离心机中，4℃下调整转速2500-3000 r/min，离心8-10min后用无菌吸管吸取血清2 ml～3ml；
（2）   将上述血清加入含有1mL Trizol试剂的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于冰上；
（3）   置于超净台中，温育5min，12000r/min，离心10min；
（4）   吸上清于新的1.5mL离心管中，加入200μL的氯仿，摇匀，室温静置2min，4℃，12000r/min，离心10min；
（5）   吸取上清于新的1.5mL离心管中，加入600μL的异丙醇，混合均匀，室温静置15min，4℃，12000r/min，离心15min，弃上清；
（6）   加入1mL75%的无水乙醇漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清；所述75%的无水乙醇的组成为750μL无水乙醇+250μL DEPC水；
（7）   加入1mL无水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清，室温干燥10min；
（8）   加入40μL的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存备用；
二、         逆转录合成cDNA
采用上述RT-PCR试剂盒进行逆转录，反应程序：42℃，50min；85℃，5min；反应结束后离心，置于-20℃保存；
三、         Real-time PCR扩增
采用上述RT-PCR试剂盒进行扩增，反应程序如下：95℃ ，10min；95℃，15 Sec； 60℃，1min；95℃，15 Sec；60℃，15 Sec；
四、         验证目的基因表达
分析统计HDAC1 mRNA的相对表达量，采用SDS 2.3软件分析结果，Ct为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，采用比较Ct值法计算样本中HDAC1 mRNA 相对表达量；计算2^(-△Ct)值表示样品中目的基因初始mRNA相对表达量，△Ct是同一个样本中目的基因Ct值减去内参Ct值；按2^(-△Ct)换算成基因表达量；以样本2的2^(-△Ct)值校正为1作为参照，计算出目的基因的相对表达量；使用SPSS19.0统计软件，计数数据以均数±标准差 表示；以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有显著统计学意义。
本发明上述方法不属于专利法25条第3款规定的疾病的诊断与治疗方法。原因如下：其一，该方法在体外实施；其二，根据该方法得出的结果，无论好坏都不能直接作为判断疾病与否的指标，该结果只能用于评估特定人群（糖尿病患者，尤其是2型糖尿病患者）将来患结直肠癌的可能性，以及对其当前健康状况的评估，有助于糖尿病并发结直肠癌的早期预警、早诊早治、预后评估。
目前国内外尚未见关于高血糖状态并发结直肠癌的特异性分子标志物的报道。
本研究组收集了391名结直肠癌患者的初入院空腹血糖值，统计不同血糖水平结直肠癌患者所占百分比，并析不同血糖水平与临床病理参数的相关性。我们发现，高血糖并发的结直肠癌患者高达29.67%，高血糖并发结直肠癌的患者肿瘤直径更大、分化程度更差，提示血糖水平可明显影响结直肠癌患者的肿瘤恶性程度及进展程度。
本研究组采用Illumina Hiseq第二代测序平台对并发及不并发高血糖的结直肠癌肿瘤组织及正常肠组织样本分别进行了高通量转录组测序，通过信息学分析后，初步筛选了一批在糖尿病并发结直肠癌组织中表达量具有显著差异的分子标志物。为进一步验证上述筛选的分子标志物对于高血糖并发结直肠癌病程及预后评估的可靠性，我们收集了120例结直肠癌患者肿瘤、正常组织及血清样本，收集了120例糖尿病患者血清样本，检测上述两类患者初入院时清晨空腹血糖水平，根据血糖水平及良恶性分类后，进一步采用实时定量PCR法验证了上述两类患者相关样本中特异性分子标志物的mRNA水平。
我们的验证结果发现，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase 1, HDAC1)在并发高血糖的结直肠癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于并发高血糖结直肠癌患者的正常肠组织，在正常血糖的结直肠癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于正常血糖的结直肠癌患者正常肠组织。而在正常肠粘膜细胞及健康人群外周血中不表达或低表达。我们认为HDAC1在高血糖状态下并发结直肠癌的发生发展中具有较高的特异性及灵敏性，可以作为糖尿病并发结直肠癌的标志物之一。
HDAC1是一类蛋白酶，对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。一般情况下,组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，并由组蛋白乙酰化转移酶（histone acetyltransferase, HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）共同调控。HAT将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，HDAC使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制。在癌细胞中，HDAC的过度表达导致去乙酰化作用的增强，通过恢复组蛋白正电荷, 从而增加DNA与组蛋白之间的引力, 使松弛的核小体变得十分紧密, 不利于特定基因的表达, 包括一些肿瘤抑制基因。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACi）则可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化，从而调控细胞凋亡及分化相关蛋白的表达和稳定性，诱导细胞凋亡及分化，成为一类新的抗肿瘤药物。HDACi不仅对多种血液系统肿瘤和实体瘤具有良好的治疗作用，而且具有肿瘤细胞相对较高选择性和低毒的优点。而2011年Nature杂志报道的研究发现HDAC1在2型糖尿病中发挥重要的调控血糖作用。
综上所述，本发明的有益效果是：
1、本发明产品将通过检测高血糖状态人群外周静脉血清样本中HDAC1 mRNA 表达水平，可用于评估高血糖人群并发结直肠癌的易感性及预后，有助于糖尿病并发结直肠癌患者的早期预警、早诊早治、预后评估，对于降低我国糖尿病、结直肠癌的高发病率、高致死率具有重大的应用价值；
2、本发明建立了利用特异性引物检测外周静脉血清HDAC1 mRNA 的方法；由于本方法采用了定量PCR 扩增技术，使得检测HDAC1 mRNA 的敏感性大大提高，能保证在极少的标本中获得足够的信息；
3、本发明还提供了作为阳性对照（标准品）的含有高表达HDAC1基因的cDNA模板（体积2μL）；标准品碱基序列为：GGCATCTGGCTTCTGTTACGTCAATGATATCGTCTTGGCCATCCTGGAACTGCTAAAGTATCACCAGAGGGTGCTGTACATTGACATTGATATTCACCATGGTGACGGCGTGGAAGAGGCCTTCTACACCACGGACCGGGTCATGACTGTGTCCTTTCATAAGTATGGAGAGTACTTCCCAGGA；
4、本发明还提供了作为阴性对照的不表达或低表达HDAC1基因的cDNA模板（体积2μL）。
附图说明
图1显示的是本发明血清样本提取总RNA琼脂糖凝胶电泳；
图2显示的是本发明Agilent 2100芯片检测样本1的RNA样品完整性；
图3显示的是本发明Agilent 2100芯片检测样本2的RNA样品完整性；
图4显示的是本发明HDAC1 mRNA扩增动力学曲线；
图5显示的是本发明GAPDH mRNA 扩增动力学曲线；
图6显示的是本发明HDAC1 mRNA的相对表达量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。但应明确，本文上述说明以及下述实施例仅是用作举例说明，并不构成对本发明范围的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
 1.引物设计和合成
1.1 HDAC1 基因引物设计与合成
拟扩增的HDAC1 基因标准品序列为HDAC1 基因第10、11外显子区1089-1264碱基，以HDAC1 全长mRNA序列为模板设计引物。标准品PCR上游引物F序列为：5’- GCTCCACATCAGTCCTTCC -3’；下游引物R序列为：5’- GGTCGTCTTCGTCCTCATC -3’。
1.2 GAPDH基因引物设计与合成
拟扩增的内参照基因人类甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)序列为GAPDH基因第6、7外显子区1065-1174碱基，以GAPDH长mRNA序列为模板设计引物，GAPDH基因上游引物F序列为：5'-CACCCAC TCCTCCACCTTTG-3'；下游引物R序列为：5' –CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。
 2.含有高表达HDAC1基因的cDNA模板、不表达或低表达HDAC1基因的cDNA模板制备方法
2.1 有关试剂的配制：
(1) DEPC水配制方法：
在1000mL的双重蒸馏水（ddH2O）中加入1mLDEPC原液，磁力搅拌器搅拌过夜。
(2) 1 mol/L Tris·Cl（pH =8.0）配制方法：800 mL蒸馏水中溶解121.1 g Tris，加浓HCl调pH至8.0，定容至1 L，高压灭菌备用。
(3) 50×TAE缓冲液配制方法：500 mL双蒸水中溶解242 g Tris，加入100 mL 0.5 mol/L EDTA （pH =8.0）、57.1 mL冰乙酸，定容至1 L，室温保存备用。
2.2 血清总RNA的提取
(1)  以EDTA-K2抗凝真空负压采血管收集特定人群1、特定人群2的清晨空腹外周静脉血各5ml（分别为样本1、样本2），置于冷冻离心机中，4℃下调整转速2500-3000 r/min，离心8-10min后用无菌吸管吸取血清2 ml～3ml；
（注：特定人群1：高血糖并发结直肠患者：该类患者在未使用降糖药的情况下年平均空腹血糖水平>7.77mmol/L、肿瘤组织在手术切除后经病理科确诊为结直肠癌；特定人群2：糖尿病（未并发肿瘤病）患者：该患者在未使用降糖药的情况下月平均空腹血糖水平>7.77mmol/L、经超声影像学/肠镜活检病理检查无结直肠肿瘤者）
(2)  将上述血清加入含有1mL Trizol的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于冰上；
(3)  置于超净台中，温育5min，12000r/min，离心10min；
(4)  吸上清于新的1.5mL离心管中，加入200μL的氯仿，摇匀，室温静置2min，4℃，12000r/min，离心10min；
(5)  吸取上清于新的1.5mL离心管中，加入600μL的异丙醇，混合均匀，室温静置15min，4℃，12000r/min，离心15min，弃上清；
(6)  加入1mL75%的无水乙醇（750μL无水乙醇+250μL DEPC水）漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清；
(7)  加入1mL无水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清，室温干燥10min；
(8)  加入40μL的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存备用。
2.3 RNA质量检测
(1) 琼脂糖凝胶电泳：1%琼脂糖凝胶电泳，150V电压15分钟。紫外透射光下观察并拍照。
琼脂糖凝胶电泳结果见图1：
（注：样本1、样本2提取的RNA电泳分别为11号、12号条带）
结果说明：28S和18S核糖体RNA条带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型）。在加样孔位于图片上方的看图模式下，上面一条带（真核28S，原核23S）的密度大约是下面一条带（真核18S，原核16S）的2倍。下方还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA等）组成。在28S和18S 核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
(2) NanoDrop 2000检测RNA浓度及OD值：
取1μ1RNA样品置于nanodrop微量分析仪基座，定量检测波长在260、280的OD值，验证RNA纯度。OD（260/280）读数在1.80-2.00之间为较纯的样品。对RNA浓度及总量要求：RNA浓度≥200 ng/μl；RNA需求量≥10μg。
结果如下： 
样本1：OD（260/280）读数1.95，RNA浓度 407ng/μl；
样本2：OD（260/280）读数1.90，RNA浓度 389ng/μl；
 (3) Agilent 2100芯片检测：
   按照RNA 6000 Nano 芯片试剂盒操作。分别取样本1、样本2的9μl总RNA样本与染料混合后加入电泳芯片的注胶孔。往Ladder 孔中加入1μl Ladder，数字标记的样品孔中各加入1μl 样本。样本1、样本2的RNA样品完整性检测结果见图2、图3：
结果说明：图中每个峰的集中度，代表样品中RNA完整度，峰越集中代表样品RNA降解率越低。rRNA Ratio[28s/18s]的读数，代表28S与18S的浓度比例。RIN值表示RNA样品的完整度，数值在1-10，数值越高代表RNA完整性越好。一般情况下，RIN值>6.5为合格，RIN值≤6.5为不合格。物种类型、样品粘稠度及28S与18S、5S的比例关系等都会影响检测数据结果，甚至会导致仪器报错。
2.4逆转录合成cDNA
用RT-PCR 试剂盒，以20μl 总反应体积进行逆转录。按以下体系加入：

反应程序：42℃，50min；85℃，5min；反应结束后短暂离心，置于-20℃保存。
2.5 Real-time PCR扩增验证目的基因表达
将制备好的cDNA进行PCR扩增，扩增体系如下：

反应程序：95℃ ，10min（95℃，15Sec；60℃，1min）×40；95℃,15 Sec； 60℃,1min；95℃,15 Sec；60℃, 15 Sec。
数据采用仪器自带软件分析:ABI Prism 7300 SDS Software。
HDAC1 mRNA扩增动力学曲线见图4，GAPDH mRNA 扩增动力学曲线见图5。
2.6 结果统计分析 
分析统计HDAC1 mRNA的相对表达量，采用SDS 2.3软件分析结果。Ct为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数（循环阈值）。采用比较Ct值法计算样本中HDAC1 mRNA 相对表达量。计算2^(-△Ct)值表示样品中目的基因初始mRNA相对表达量。△Ct是同一个样本中目的基因Ct值减去内参Ct值；按2^(-△Ct)换算成基因表达量；以样本2的2^(-△Ct)值校正为1作为参照，计算出目的基因的相对表达量。使用SPSS19.0统计软件，计数数据以均数±标准差表示。以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有显著统计学意义。
统计结果见图6 (样本1与样本2比较，P＜0.01)
注：样本1为糖尿病并发结直肠癌患者血清样本；
样本2为糖尿病（未并发肿瘤病）患者血清样本。
样本1为糖尿病并发结直肠癌患者血清样本的HDAC1 mRNA相对表达量，样本2为糖尿病（未并发结直肠癌）患者血清样本的HDAC1 mRNA相对表达量。结果显示：糖尿病并发结直肠癌患者血清样本的HDAC1 mRNA相对表达量显著高于糖尿病（未并发肿瘤病）患者血清样本的HDAC1 mRNA相对表达量。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  湖州市第一人民医院      
 
<120>  检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物、用于评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的RT-PCR试剂盒及评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法
 
<130> 
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gctccacatc agtccttcc                                                    19
 
 
<210>  2
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
ggtcgtcttc gtcctcatc                                                    19
 
 
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
cacccactcc tccacctttg                                                   20
 
 
<210>  4
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
ccaccaccct gttgctgtag                                                   20