一种含有氨基酸钙和大豆异黄酮的组合物 技术领域：
本发明涉及一种尤其可用于预防或治疗骨质疏松或佝偻病，或用于增加骨密度的含有氨基酸钙，大豆异黄酮和任选的维生素和微量元素的组合物。
背景技术：
骨质疏松症是骨矿物质和骨基质随年龄的增加(或妇女的绝经)等比例的减少、骨组织显微结构发生变化，使骨的正常荷载功能发生变化，骨密度降低，骨折危险明显增大、伴有周身骨骼疼痛和体态变化的一种疾病。骨质疏松的发生机制比较复杂，骨细胞包括成骨细胞及破骨细胞的功能起着关健性的作用，增加成骨细胞的数量和功能、抑制破骨细胞的功能是预防和治疗骨质疏松的重要手段，因为成骨细胞及破骨细胞两者共同作用，决定了骨骼中骨小梁的生长，骨盐矿架结构的形成，骨胶原的合成及包括钙元素在内地矿物质的沉积。缺钙是骨质疏松的一种表现，但单纯补钙不能解决，骨质疏松的主要原因是人类骨骼衰老所致，具体说是因为骨细胞包括成骨细胞及破骨细胞功能的退化所致。因此，治疗或预防骨质疏松的关健是通过影响骨细胞使骨细胞减缓退化或衰老，促进成骨细胞、抑制破骨细胞。
从目前来看，社会上预防和治疗骨质疏松的物质主要有以下三类，一是二磷酸盐类，以抑制破骨细胞为主，如阿伦磷酸钠等；二是激素类，如雌激素或降钙素等，有刺激成骨细胞或抑制破骨细胞的作用。三是补钙剂，比如碳酸钙等，钙是骨骼的主要成分之一，骨质疏松的症状之一就是缺钙，但骨骼对钙的吸收及利用是要通过骨细胞的作用，因此单纯补钙效果不好。本发明中的组合物通过刺激成骨细胞的生长同时抑制破骨细胞的作用，来达到预防和治疗骨质疏松的目的，相关的基础研究及整体动物模型研究很好地说明了这一点。
另外，婴幼儿缺钙会出现佝偻病或骨质软化，儿童或青少年缺钙会出现骨质软化或骨密度降低。对于这些疾病，目前虽然有许多补钙治疗药物，但对于新的高效治疗制剂仍存在着需求。
发明内容：
大豆异黄酮是一种从豆科植物大豆中提取的组分，它具有雌激素样作用，据报道可用于治疗更年期综合症和改善骨质代谢。
氨基酸钙又称为氨基酸螯合钙，是氨基酸与钙的螯合物，是一类有机钙，水溶性好，在体内吸收率高，可用于补钙。
发明人发现，将氨基酸钙与大豆异黄酮结合使用，可以提高骨质疏松模型大鼠的血钙水平，降低AKP水平，提高骨密度，骨钙含量，增加骨钙化程度和韧性，增加骨折断的受力强度和做功的能量，该组合物在以上方面与二者的任何一种比较，效果明显，证实了二者具有协同作用。可有效用于预防或治疗骨质疏松症或佝偻病或增加骨密度，其作用超出了二者作用的简单叠加。基于这些发现，完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种可用于预防或治疗骨质疏松或佝偻病，或用于增加骨密度的含有氨基酸螯合钙和大豆异黄酮的组合物。
本发明的大豆异黄酮可以由大豆提取得到，或者可以从市场上购买。例如，中国专利申请02114991.7公开了一种通过大豆种子萌动期分离大豆胚轴供萃取大豆异黄酮的方法。将成熟饱满的大豆种子，经冷水浸泡萌动至初始萌芽状态，经脱皮、大豆子叶分瓣、子叶与大豆胚轴分离、溶剂浸出法萃取等工艺工序，得到大豆异黄酮。据称所制备的大豆异黄酮的雌激素样作用影响到体内激素水平，有助于改善绝经后妇女热潮红和阴道炎等症状，对心血管的防护作用及骨质代谢的影响和对于预防癌症发生效果明显。
本发明的氨基酸钙可以合成或从市场购买。例如中国专利申请98120034.6公开了一种氨基酸钙及其制备方法包括在特定的超声波应力场下，处于离子状态的氢氧化钙与氨基酸的游离基组合而成钙氨羧螯合结构体，是一种内能小，结构稳定的溶于水的非盐分子有机钙。其可用于医药保健行业。中国专利申请96100091.0公开了氨基酸钙的制备方法及其应用。中国专利申请98106747.6公开了复合氨基酸钙盐补钙剂及其生产方法。包括将无机钙化合物与L-赖氨酸、L-天冬氨酸、水混合反应，经脱色、过滤、真空浓缩、结晶、分离、干燥，或真空浓缩后进行喷雾干燥，得到一种复合L-赖氨酸-L-天冬氨酸钙盐，该复合氨基酸钙盐具有水溶性好，吸收率高，不刺激胃肠等特点，能同时满足人体对补钙补氨基酸的需要。
本发明的氨基酸钙可以为单一氨基酸螯合钙，也可以为两种或多种氨基酸螯合钙的混合物。适宜的氨基酸钙包括天门冬氨酸钙，谷氨酸钙，甘氨酸钙，苏氨酸钙，丝氨酸钙，赖氨酸钙，苯丙氨酸钙，组氨酸钙，脯氨酸钙，精氨酸钙，缬氨酸钙，蛋氨酸钙，亮氨酸钙，酪氨酸钙，胱氨酸钙，丙氨酸钙，异亮氨酸钙等，以及它们的两种或多种的混合物。
在本发明的组合物中，氨基酸钙与大豆异黄酮的重量比为1-1000∶1-120，优选为2-500∶1-70，更优选15∶1-5。本发明的组合物可以任选包括药学可接受的载体或稀释剂或常用添加剂，如香味剂，甜味剂等。氨基酸钙与大豆异黄酮二者在组合物中的含量优选为10-100wt％，更优选30-95wt％，还更优选50-90wt％。
根据本发明的一个更优选的实施方案，本发明的组合物还含有适量的维生素，例如维生素D3、C和K中的一种或多种，更优选维生素D3，和/或适量的微量元素，例如锌、镁、锰、铜、铁、硒、硅、硼、钼中的一种或多种。
本发明的组合物可以制成常用剂型，例如片剂，胶囊，颗粒剂，口服液等。制备本发明的组合物的方法为常规方法，这些方法对于本领域的技术人员来说是公知的。
在本发明的单位剂型中例如可以包括大豆异黄酮10-300mg，氨基酸钙20-600mg(按钙元素计)，10-400IU维生素D3和任选适量的微量元素。日用量可以是1-6个单位剂型，优选1-3个单位剂型。
以下通过实施例来说明本发明。应该理解的是，这些实施例仅用于说明的目的，不限制本发明的范围。
具体实施方式：
实施例1 片剂的制备(1000片)
L-天门冬氨酸钙 500g
大豆异黄酮 60g
预胶化淀粉 145g
糊精 15g
甜味剂 10g
香精 6g
微晶纤维素 80g
聚乙烯吡咯烷酮 18g
羧甲基纤维素 80g
硬脂酸镁 1.6g
上述物质混合，按常规制片工艺制成片剂。
实施例2 口服液的制备
大豆异黄酮 6.5g
甘氨酸钙 28.3g
蔗糖 88.5g
柠檬酸 9.46g
阿斯巴甜 4.3g
山梨酸钾 0.18g
上述物质加水至1000毫升，加热溶解，加入香精，搅拌均匀，分装到灭菌的瓶中，包装即可。
实施例3 胶囊的制备
复合氨基酸钙 294g
大豆异黄酮 153g
将二者混合均匀，再加入滑石粉4.22克，混合均匀，分装到胶囊中，包装，制成1000粒胶囊。该复合氨基酸钙的组成如下：天门冬氨酸2.99％，苏氨酸，2.60％，丝氨酸3.86％，谷氨酸，6.13％，甘氨酸1.76％，丙氨酸2.16％，胱氨酸5.06％，缬氨酸2.12％，蛋氨酸0.79％，异亮氨酸1.02，亮氨酸2.97％，酪氨酸1.42％，苯丙氨酸1.27％，赖氨酸1.77％，组氨酸0.64％，精氨酸3.31％，脯氨酸2.83％，氨0.56％，钙10.32％。
实施例4 片剂的制备(1000片g)
甘氨酸钙 275g
L-天门冬氨酸钙 500g
大豆异黄酮 55g
维生素D3 200IU
预胶化淀粉 130g
糊精 15g
甜味剂 10g
香精 6g
微晶纤维素 80g
聚乙烯吡咯烷酮 18g
羧甲基纤维素 80g
硬脂酸镁 1.6g
上述物质混合，按常规制片工艺制成片剂。
实施例5 胶囊的制备
L-天门冬氨酸钙 294g
大豆异黄酮 153g
维生素D3 100000IU
将二者混合均匀，再加入滑石粉4.22克，混合均匀，分装到胶囊中，包装，制成1000粒胶囊。
一、本发明组合物对骨质疏松症的疗效的动物试验
动物及饲养：Wistar种雌性大鼠，体重150±10g，由军事医科院实验动物中心提供，试验室温度22±1℃，相对湿度40-60℃，喂饲低钙饲料，饮用去离子水，正常对照组喂饲普通饲料及饮用自来水。
方法：
去势雌性大鼠骨质疏松模型的制备：雌性大鼠体重150±10g，无菌摘除双侧卵巢，喂饲低钙饲料及饮用去离子水60天，造成骨质疏松模型。
试验处理：取去卵巢大鼠120只，随机分为八组，每组15只。第一组为L-天门冬氨酸钙(含钙10.8％)组，每天经口灌服3g/kg(相当于300mg/kg元素钙)，第二组为甘氨酸钙(含钙21％)组1.5g/kg(相当于300mg/kg元素钙)，第三组为复合氨基酸钙(含钙10.32％)组3g/kg(相当于300mg/kg元素钙)，第四组为大豆异黄酮组0.54g/kg，第五组大豆异黄酮0.35g/kg+1.5g/kgL-天门冬氨酸钙(含钙约10.8％，相当于150mg/kg元素钙)组，第六组为大豆异黄酮0.35g/kg+0.75g/kg甘氨酸钙(含钙约21％，相当于150mg/kg元素钙)组，第七组为大豆异黄酮0.35g/kg+1.5g/kg复合氨基酸钙(含钙约10.32％，相当于150mg/kg元素钙)组，第八组为模型组，每天经口给等体积去离子水，上述一到四组喂饲低钙饲料，饮用去离子水。第九组取同批未摘除卵巢的大鼠15只作为正常对照组，喂饲普通饲料和饮用自来水。以上所用动物在实验的第60天，放血处死，取血分离血清用于血Ca、P、AKP的测定；剥离大鼠双侧股骨，低温冰箱冻存，供下述分析用。
血清Ca、P和AKP的测定：血清钙用甲基麝香草酚兰比色法测定；血清磷用单一试剂法测定；血清碱性磷酸酶(AKP)用对硝基苯磷酸二钠法测定。
骨密度测定：取低温冰箱冻存的右侧股骨，应用骨密度仪测定股骨中央50％(F50)和近端20％(F20)处的骨矿盐含量，扫描速度为0.25mm/s，精确度为99％。单位为每平方厘米所含骨矿盐量(BMC/cm2)。
取右侧新鲜剥离的股骨，测长度、称湿重，在120℃烘箱中烘烤5小时，恒重后称重即为干重，然后再放入800℃马弗炉中烧6小时，恒重后称重即为灰分，用EDTA络合滴定法测定灰分中的钙盐含量。
股骨生物力学测定：取低温冰箱冻存的左侧股骨，应用电子万能试验机进行股骨的三点弯曲试验，跨度为2.5cm，使用25kg传感器，标定1/50，速度10mm/min，应用函数记录仪记录载荷与挠度的函数关系，P为破坏性测试折断最大屈服点受力；Y为挠度，与材料韧性呈正比关系；K为斜率，与材料的刚度成正比；S为折断骨所做的功。在骨上显示钙化程度。
表1 本发明组合物对去卵巢骨质疏松大鼠血清钙、磷的影响 组别 血清钙(mg/dL) 血清磷(mg/dL) L-天门冬氨酸钙组 7.65±1.47 5.07±1.97 甘氨酸钙组 7.84±1.58 5.43±1.74 复合氨基酸钙组 7.55±1.64 5.64±1.87 大豆异黄酮组 7.45±1.92 5.45±1.91 L-天门冬氨酸钙+大豆异黄酮组 9.12±1.81 5.07±1.54 甘氨酸钙+大豆异黄酮组 9.23±1.76 5.14±1.65 复合氨基酸钙+大豆异黄酮组 9.15±1.71 4.85±1.57 模型组 7.10±1.79 6.89±1.42 正常对照组 9.39±1.75 4.56±1.58
统计表明，氨基酸钙+大豆异黄酮组与各氨基酸钙组和大豆异黄酮组比较差异显著，p＜0.05。
表2 本发明组合物对去卵巢骨质疏松大鼠血清AKP的影响：
组别 血清AKP Bessey-Loury单位 L-天门冬氨酸钙组 8.0±1.1 甘氨酸钙组 8.4±1.3 复合氨基酸钙组 8.2±1.6 大豆异黄酮组 7.4±1.1 L-天门冬氨酸钙+大豆异黄酮组 6.0±1.3 甘氨酸钙+大豆异黄酮组 6.3±1.7 复合氨基酸钙+大豆异黄酮组 6.2±1.6 模型组 9.4±1.5 正常对照组 5.7±1.1
统计表明，氨基酸钙+大豆异黄酮组与各氨基酸钙组和大豆异黄酮组比较差异显著，p＜0.05。
表3本发明组合物对骨密度的影响 组别 F50 (BMC/BW) F20(BMC/BW) L-天门冬氨酸钙组 0.234±0.020 0.251±0.012 甘氨酸钙组 0.236±0.016 0.245±0.028 复合氨基酸钙组 0.231±0.022 0.267±0.021 大豆异黄酮组 0.240±0.020 0.271±0.012 L-天门冬氨酸钙+大豆异黄酮组 0.260±0.024 0.301±0.017 甘氨酸钙+大豆异黄酮组 0.254±0.026 0.291±0.014 复合氨基酸钙+大豆异黄酮组 0.259±0.017 0.288±0.020 模型组 0.227±0.020 0.239±0.034 正常对照组 0.268±0.023 0.295±0.015
统计表明，氨基酸钙+大豆异黄酮组与各氨基酸钙组和大豆异黄酮组比较差异显著，p＜0.05。
表4本发明组合物对去卵巢大鼠股骨生物力学的影响 组别 P K Y S L-天门冬氨酸钙组7.1±1.1 1.85±0.35 7.9±1.1 23.7±9.5 甘氨酸钙组6.5±1.5 1.79±0.22 7.4±1.6 24.5±6.3 复合氨基酸钙组5.9±1.6 2.01±0.18 7.3±1.4 28.6±7.1 大豆异黄酮组7.1±1.9 1.97±0.28 7.8±1.1 26.5±6.8 L-天门冬氨酸钙 +大豆异黄酮组8.1±1.3 2.15±0.19 7.0±1.2 29.7±8.8甘氨酸钙+大豆异黄酮组8.8±1.3 2.11±0.21 6.9±1.4 31.1±6.2 复合氨基酸钙 +大豆异黄酮组8.2±1.3 2.09±0.25 6.6±1.0 31.4±7.1 模型组5.4±1.1 1.52±0.17 8.2±1.0 23.9±8.2 正常对照组8.9±1.0 2.19±0.36 6.9±1.4 33.9±9.5
以上结果表明，本发明的氨基酸钙+大豆异黄酮组在功效成份分别低于各氨基酸钙组和大豆异黄酮组的情况下，效果显著优于它们。说明本发明氨基酸钙与大豆异黄酮的组合具有协同作用，本发明的组合物有预防和治疗骨质疏松的作用。
二、本发明组合物对破骨细胞骨吸收功能影响的体外研究
1材料和方法：
1.1材料：
1.1.1动物：新生雄性日本大耳白兔3只，体重80-110g，由成都生物制品研究所提供。
1.12药品及试剂：α-MEM(Gibco产品)，新生胎牛血清(Gibco生产)，1，25(OH)2D3(Sigma产品)，HEPES(Roch产品)，青霉素-链霉素(Gibco产品)，萘酚AS-BI磷酸盐(Sigma产品)、甲苯胺蓝(Sigma产品)。CTX的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Osteometer BioTech产品)。
药物：
L-天冬氨酸钙(上海元吉化工有限公司)
复合氨基酸钙[包括天门冬氨酸2.99％，苏氨酸，2.60％，丝氨酸3.86％，谷氨酸，6.13％，甘氨酸1.76％，丙氨酸2.16％，胱氨酸5.06％，缬氨酸2.12％，蛋氨酸0.79％，异亮氨酸1.02，亮氨酸2.97％，酪氨酸1.42％，苯丙氨酸1.27％，赖氨酸1.77％，组氨酸0.64％，精氨酸3.31％，脯氨酸2.83％，氨0.56％，钙10.32％](成都GT BIOCHEMICAL CO.LTD)
大豆异黄酮组：
L-天冬氨酸钙+大豆异黄酮
复合氨基酸钙+大豆异黄酮
葡萄糖酸钙(Sigma产品)
17-β雌二醇(Sigma产品)。
1.1.3主要仪器：锯式切片机、CO2培养箱、倒置相差显微镜、普通光学显微镜、尼康Eclipse600 SPOT计算机图像分析系统、Philips525M型扫描电子显微镜、台式高速离心机、深低温冰箱、除菌过滤器、显微外科手术器械、96孔培养板等。
1.2方法：
1.2.1骨磨片的制备：用低速锯式切片机将新鲜牛股骨皮质骨切成100μm厚片，用磨砂玻璃片磨成20μm厚、4mm×4mm的薄骨片，将骨磨片至蒸馏水中，超声清洗3×5min，自然晾干，紫外线照射消毒20min后置4℃冰箱内备用。分离破骨细胞前，取出骨片，浸泡于含抗生素(青霉素1000U/ml，链霉素1000μm/ml)的α-MEM培养液中，换液三次，每次20分钟。
1.2.2破骨细胞的分离：用改良Chambers法，将新生兔断颈处死，无菌条件下取四肢长骨，在D-Hanks平衡盐溶液中去净附着在骨表面的软组织及骨骺，用α-MEM清洗骨干2次，然后在α-MEM全培养液内，将骨干纵行刨开，轻刮骨髓腔至颜色变白，用尖吸管吸取培养液反复冲洗髓腔面，收集冲洗液，细胞筛网过滤，去掉骨片，1000rpm离心5min，沉淀物加20ml培养液悬浮混匀。台盼蓝拒染法计算分离细胞活力，血细胞计数器计数，调节悬液体积，使悬液含细胞1×106/ml。
1.2.3破骨细胞的培养和药物的添加：取2个96孔培养板，每孔内置100μlα-MEM全培养液和-骨片，将细胞悬液按100μl/孔加入(每孔1×105细胞)，静置80min，冲洗除去培养液和未粘附细胞，加入新培养液200μl，在37℃、5％CO2潮湿条件下培养24h，再次除去培养液和未粘附细胞，并在每10孔内加入浓度分别为10-9、10-7、10-5mol/L的L-天冬氨酸钙、复合氨基酸钙，17β-雌二醇、大豆异黄酮、L-天冬氨酸钙+大豆异黄酮、复合氨基酸钙+大豆异黄酮的新培养液200μl(含10nM1，25-(OH)2D3)，即使各个药物浓度均有10-9、10-7、10-5mol/L三种工作浓度，另10孔内加入含等体积的三蒸水的全培养液作为对照，继续培养144h。每2d换液一次，每次换液4/5体积的培养液，并换以同体积的培养液。去除的旧培养液置入微量离心管中-70℃保存。
1.3破骨细胞形态观察及鉴定：
1.3.1倒置相差显微镜：观察培养细胞的形态、运动情况和骨吸收陷窝的形成。
1.3.2 TRAP染色及破骨细胞鉴定：培养第7天，取各用药组和对照组骨片各2张，TRAP染色进行破骨细胞鉴定：将骨片自然晾干，再于体积分数为2.5％的戊二醛固定液中4℃固定10min，同时温育孵育液(六偶氮副品红1ml，0.2mol/L醋酸缓冲液18ml，萘酚AS-BI磷酸盐20mg，50mmol酒石酸钾钠，pH5.0)至37℃。取出骨片，双蒸水洗3次，苏木素(Sigma产品)复染2min，蒸馏水冲洗，晾干，二甲苯透明，DPX封固，光镜观察。对照组中不含萘酚AS-BI磷酸盐。
1.4破骨细胞骨吸收功能测定：
1.4.1形态学评估：
1.4.1.1骨吸收陷窝测量及IOD测量：培养的第7d取出培养板中各实验组(各浓度药物组)的骨片及对照组的骨片各8张，2.5％戊二醛固定7min，于0.25mmol/L氢氧化铵中超声清洗5min×3次，系列酒精脱水，自然晾干，1％甲苯胺蓝(含1％硼酸钠)染色3min，蒸馏水清洗，于尼康E600研究显微镜(×100倍)下，SPOT Cool CCD摄像头采集图像，用imagepro plus 4.01计算机图像分析系统检测整张骨吸收陷窝的面积和IOD。
1.4.1.2 SEM陷窝计数：随机选取8张骨片光镜200倍下作骨吸收陷窝计数分析，再经蒸馏水超声清洗10min×3次，经体积分数为1％的锇酸固定、系列酒精脱水、CO2临界点干燥、镀金，作SEM的观察，300倍下骨吸收陷窝计数分析。
1.4.2生化学评估：将新旧上清液混匀，各组保持相同体积，吸取上清液，按产品说明用ELISA法测定其I型胶原C-末端肽(CTx)的浓度，以ng/ml表示。
1.5数据处理：数据均以x±s表示，多组计量资料样本均数的比较采用成组设计的方差分析，均数比较采用q检验或Dunnett-t检验，并作两变量的直线相关分析。采用SPSS 10.0软件进行统计分析。
2结果：
2.1破骨细胞形态学观察及鉴定 相差倒置显微镜下观察见多核巨细胞，细胞呈油煎蛋形，长条形、漏斗形或不规则形，内含约数个或数十个细胞核，体积较大，胞浆丰富、可见大小不一的空泡，边缘可见亮区，即为破骨细胞或破骨细胞样细胞；TRAP染色见TRAP阳性细胞：培养7d后作TRAP染色，各骨片上均可见数量不等的TRAP阳性的破骨细胞，为多核巨细胞，胞浆丰富，TRAP染色胞浆呈颗粒状红色；甲苯胺蓝染色-光镜观察各骨片上有骨吸收陷窝形成，骨吸收陷窝呈紫红色，边界清楚，呈圆形、椭圆形、蜡肠形或不规则；扫描电镜(SEM)下见各骨片上有骨吸收陷窝形成，骨吸收陷窝边界清楚。SEM下进行陷窝计数(×300)与甲苯胺蓝染色-光镜观察下计数(×200)，结果分别为122.51±57.61和119.18±57.10陷窝数/骨片(n＝8)，基本一致(r＝0.892 p＜0.001)。
2.2破骨细胞骨吸收功能的测定：
尼康Eclipse600 SPOT计算机图像分析系统分析各浓度药物组和对照组骨吸收陷窝面积、积分光密度(IOD)及ELISA法测定上清液CTx浓度(见表5)。
2.2.1各实验组骨吸收陷窝面积及上清液CTx浓度与对照组比较除葡萄糖酸钙各组骨吸收陷窝面积、IOD及上清液CTx浓度较对照组无显著性差异(p＞0.05)外，L-天冬氨酸钙、大豆异黄酮、L-天冬氨酸钙+大豆异黄酮、复合氨基酸钙+大豆异黄酮、17β-雌二醇的各浓度组陷窝面积、IOD及CTx浓度均较对照组低(p＜0.05或p＜0.001)。说明除葡萄糖酸钙组外，其余各组在不同浓度下对破骨细胞活性都有一定的抑制作用，其中氨基酸钙+大豆异黄酮的各浓度组优于氨基酸钙、大豆异黄酮的相应各浓度组。
表5各浓度药物组和对照组骨吸收陷窝面积、IOD及CTx浓度值(n＝8)
药物 药物浓度 陷窝面积 CTx浓度 IOD
(×102um2/骨片) (ng/ml) (×103)
葡萄糖酸钙 10-5M 5667.74±987.32 489.57±22.65 79278±1625
10-7M 5902.35±542.68 512.36±19.14 78543±4587
10-9M 6134.88±865.41 488.84±23.65 80125±3564
L-天冬氨酸钙 10-5M 4324.56±428.72 297.17±30.98 42354±5126
10-7M 4782.42±356.78 365.65±25.42 48672±4927
10-9M 5214.38±417.45 412.27±22.12 57685±4284
复合氨基酸钙 10-5M 4216.23±441.71 328.35±31.56 43572±5363
10-7M 4650.35±398.64 385.14±31.58 51230±4985
10-9M 5320.89±420.78 401.75±26.64 58532±5362
大豆异黄酮 10-5M 3712.25±341.15 374.36±34.25 49827±5321
10-7M 4213.24±485.36 394.13±20.62 54897±4950
10-9M 4989.52±324.25 450.96±16.79 62374±6217
L-天冬氨酸钙
+大豆异黄酮 10-5M+10-5M 3012.78±515.21 196.87±11.67 29642±5948
10-7M+10-7M 3528.18±468.14 245.25±26.21 36411±5413
10-9M+10-9M 4105.17±587.79 298.47±25.58 49122±4215
复合氨基酸钙
+大豆异黄酮 10-5M+10-5M 2967.58±451.01 177.89±14.23 30278±6824
10-7M+10-7M 3485.32±481.74 227.46±24.38 39544±5776
10-9M+10-9M 4315.54±410.53 314.45±27.81 52371±7124
17β-雌二醇 10-5M 2792.67±612.34 164.72±30.15 29648±5874
10-7M 3217.28±497.28 230.41±26.78 36452±4983
10-9M 4498.16±329.94 287.65±18.24 48157±6012
对照组 6214.52±608.41 505.12±21.48 84522±1754
本研究证实本发明组合物具有显著的抑制破骨细胞骨吸收活性的作用，使骨吸收陷窝面积及上清液CTx浓度减少，且呈剂量依赖性，大豆异黄酮组具有类似的作用，但较同浓度的氨基酸钙+大豆异黄酮组作用弱(p＜0.05)，氨基酸钙+大豆异黄酮组与17β-雌二醇作用相差不大，二者比较无显著性差异，而氨基酸钙组的作用不显著，说明本发明的含有氨基酸钙和大豆异黄酮的组合物可用于预防或治疗骨质疏松症或佝偻病，以及用于增加骨密度。上清液I型胶原C-末端肽浓度与骨片骨吸收陷窝面积高度相关，且敏感性更高，可作为定量检测体外破骨细胞骨吸收功能的有效指标。