大规模液体深层发酵生产松口蘑及其多糖工艺 【技术领域】
本发明涉及一种大规模液体深层发酵生产松口蘑及其多糖工艺。
技术背景
松口蘑(Tricholoma matsutaka)叫作松茸、松蕈、合蕈、台菌，属于担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、伞菌目、口蘑科、口蘑属，是名贵野生食用菌。松茸一名，始于我国，在宋代的《经史证类备急本草》中就有记载。日本多部古籍中也有关于其风味的记载。《全国中草药汇编》记载本品可用于痰多、气短、腰腿疼痛等症。《云南中药资源名录》记载有清热利尿、益肠胃、止痛、抗癌等功效。
松口蘑鲜品烹饪，美味异常，余香满口，深受产地各国人民喜爱。在日本，食用松茸的习惯一直流传至今，成为日本秋季食品中的上等佳肴，由于价格昂贵，被誉为“山中钻石”，素有“海里的鲱鱼子，陆地上的松茸”之说。在日本，上等野生松口蘑按朵销售。松口蘑不仅味道鲜美，而且具有很高的食疗价值。松口蘑除含有人体所需的多种氨基酸、维生素B1、B2、C、PP及钙、磷、铁等物质外，尚含有辛醇烯、肉桂酸甲酯、辛酮等芳香物质和松茸多糖、甘露醇、松茸醇、异松茸醇等活性成分。
现代科学研究表明，松口蘑具有治疗糖尿病、抗癌等特殊功能。日本科学家的研究指出，松口蘑的热水提取物对小鼠肉瘤S-180的抑瘤率高达91.8％，在担子菌中名列前茅。松口蘑的主要药理成分为多糖。近有报告其多糖能增强机体免疫活性，促进荷瘤小鼠血液、脾脏和瘤组织中cAMP(环化腺苷酸)提高。
近十几年来，松口蘑的价格越来越高，其国际市场售价从1975年的200美元/kg升至1995年的1275美元/kg。由于近年的掠夺性采挖使野生松口蘑资源迅速减少。而松口蘑的人工栽培尚未成功。为了满足人们的需要，对松口蘑的研究一直成为人们注目的问题。目前，松口蘑子实体的人工栽培尚未成功。目前尚未见大规模液体深层发酵生产松口蘑菌丝体及其多糖的报道。
【发明内容】
本发明的目的是以生产松口蘑菌丝体和多糖为目标，发明一种廉价高效的松口蘑菌丝体及其多糖的大规模液体深层发酵工艺，为今后的产业化应用打下基础。
实现本发明的技术方案：以松口蘑真菌为出发菌株，采用斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养。本菌株购自山东金乡真菌研究所。
实现本发明的具体步骤如下：
(1)取出斜面菌种接入配制的新鲜斜面培养基中，培养温度25-33℃，培养150-250小时。
(2)将步骤1中的斜面菌种转接入装有摇瓶培养基地摇瓶中，25-33℃培养，转速120-180rpm/min，培养60-100小时后进行摇瓶的扩大培养。
(3)将步骤2中的摇瓶菌种转接入装有摇瓶扩大培养基的摇瓶再进行扩大培养，25-33℃培养，转速120-180rpm/min，培养20-50小时后接入一级种子罐进行培养。
(4)将步骤3中的摇瓶菌种转接入一个装有种子培养基的一级种子罐中，接种量为4-10％，保持罐温25-33℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵30-55小时，然后转接入发酵罐发酵。
(5)将一级种子罐中的菌种转接入一个装有发酵培养基的发酵罐中，接种量为4-10％，保持罐温25-33℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵120-180小时。在还原糖含量降低到1.0-2.0％左右时放罐。
(6)如需获取其多糖，则将发酵终了液温度加热到60-100℃，搅拌速度为150-250rpm/min，维持1-3小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤得到松口蘑多糖。
本发明中斜面培养基的配方是(g/100ml)：马铃薯10-20，葡萄糖1-3，琼脂1.5-2.5，加水定容至所需体积，pH值自然。
本发明中摇瓶培养基和摇瓶扩大培养基的配方是(g/100ml)：葡萄糖2-4，酵母膏0.05-0.5，黄豆粉0.5-2，麸皮汁1.0-2.5，KH2PO4 0.1-0.5，MgSO4 0.01-0.2，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本发明中一级种子培养和发酵培养的培养基配方是(g/100ml)：葡萄糖2-4，酵母膏0.05-0.5，玉米粉0.5-2，黄豆粉0.5-2，麸皮汁1-3，KH2PO4 0.1-0.5，MgSO4 0.0-10.2，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本发明步骤2和3中摇瓶培养基与摇瓶容积比为1∶5。
本发明步骤4中一级种子罐的容积为100-300L，在该一级种子罐中装有的一级种子培养基相应为50-180L；步骤5中发酵罐的容积为1000-5000L，在该发酵罐中装有的发酵培养基相应为500-3500L。
本发明的放罐标准是发酵液开始变得粘稠，还原糖含量降低到1.0-2.0％左右，镜检发现菌丝体开始衰老。
如需获取其多糖，则在本发明所述的发酵终止后，将发酵终了液温度加热到60-100℃，搅拌速度为150-250rpm/min，维持2-4小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤，滤液经浓缩，使最后体积在原液的1/4-1/10，加入适量乙醇使乙醇浓度达75％，醇析20-30小时，取沉淀用去离子水溶解，喷雾干燥得到松口蘑多糖。
本发明的有益效果：本发明适用于大规模液体深层发酵生产松口蘑菌丝体及其多糖，解决了大规模生产培养放大的难题，对于今后的工业化生产和相关的应用产业的发展具有重要意义。本发明在发酵结束后得到的发酵产物颜色呈褐色，气味清香宜人，有松针的清香味，干燥菌丝体呈褐色。发酵液中菌丝体以干重计为2.5％。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1：
在斜面培养基中接种松口蘑菌丝体，培养温度28℃，培养时间180小时。将新鲜的斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，28℃摇床培养80小时，摇床转速150rpm/min。然后将所得摇瓶菌种转接入装有100ml培养基的500ml三角摇瓶中进行扩大培养，28℃摇床培养28小时，摇床转速150rpm/min。然后将三角瓶扩大的菌种2200ml转接入装有50L种子培养基的100L一级种子罐中，保持罐温28℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间45小时。将一级种子罐菌种转接入装有800L发酵培养基的1500L发酵罐中，保持罐温28℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间160小时，发酵液中菌丝体以干重计为2.5％，多糖含量为2.5％。
本实施例1中斜面培养基组成是(g/100ml)：马铃薯15，葡萄糖2，琼脂2，加水定容至所需体积，pH值为自然。
本实施例1中摇瓶培养基和摇瓶扩大培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖3，酵母膏0.2，黄豆粉1，麸皮汁2，KH2PO4 0.2，MgSO40.1，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本实施例1中100L一级种子罐的培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖3，酵母膏0.2，玉米粉1.5，黄豆粉1，麸皮汁2，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.1，加水定容至50L，pH值为4.5-5.0。
本实施例1中1500L发酵罐的培养基配方是(g/100ml)：葡萄糖3，酵母膏0.2，玉米粉1.5，黄豆粉1.0，麸皮汁2，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.1，加水定容至800L，pH值为4.5。
本实施例中发酵结束标准是：发酵液开始变得粘稠，还原糖含量降低到1.5％，镜检发现菌丝体开始衰老。
获取多糖的方法是：在本发明所述的发酵终止后，将温度加热到90℃，搅拌速度为220rpm/min，维持3小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤，滤液经浓缩，使最后体积在原液的1/5，加入适量乙醇使乙醇浓度达75％，醇析24小时，取沉淀用去离子水溶解，喷雾干燥得到松口蘑多糖。