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三尖杉属植物杀线虫生物碱的提取方法及其应用
                               技术领域

    本发明涉及生物农药的制备，尤其从三尖杉属植物提取杀线虫生物碱的方法。

                               背景技术

    植物线虫是一类重要的植物病原物，全世界广泛分布，寄主范围广，给农林业生产带来严重经济损失。据估计，植物线虫造成世界主要农作物的年损失率为12.3％(Sasser，1992)。由于农业逐渐向产业化发展，在蔬菜基地、花卉基地长期种植单一作物，使土壤中线虫数量累积，植物线虫病害问题日益突出。化学杀线剂长期以来是防治植物线虫病害的有效措施，但目前应用的杀线剂均具有高毒、残留时间长、污染环境及地下水源的缺点。因此，研究开发高效低毒的杀线剂非常必要和紧迫。从农业产业化发展和环境保护的角度来说，开发和研究高效、低毒的蔬菜、花卉、中草药杀线剂更是迫在眉睫。

    二十世纪70年代以来，从植物中寻找天然杀线虫活性物质的研究逐渐受到重视。印度在这方面的研究较多，近几年来，日本、意大利、美国、英国等西方国家也开始有这方面的研究报道，但至今大多是在初步资源筛选阶段，对杀线虫活性成分及杀线虫机理研究很少。我国在植物性杀线剂方面的研究工作才刚开始。公开号为CN1105512的中国发明专利申请公开了一种从苦豆草中抽提出的主要成份为苦豆碱的溶液进行杀灭松材线虫的方法，但该方法只提供杀灭一种线虫的方法。本发明人在研究中发现三尖杉枝叶提取物对松材线虫、根结线虫及水稻潜根线虫均有强杀线虫活性。经进一步研究，本发明人发现三尖杉杀灭线虫的有效成份是桥氧粗榧碱(drupacine，C₁₈H₂₁NO₅)(尚未公开)。因此，利用三尖杉的有效成份将可能获得一种杀灭多种植物线虫的有效方法。

                               技术内容

    本发明提供一种杀线虫有效物质桥氧粗榧碱(drupacine，C₁₈H₂₁NO₅)。这种生物碱对植物寄生线虫有强毒杀活性，0.1％浓度处理松材线虫5天的杀线率为98.16％，处理南方根结线虫54小时的杀线率为100％，处理水稻潜根线虫72小时的杀线率为89.5％。本发明还提供了从三尖杉属植物中提取、分离这种生物碱的方法。

    利用三尖杉属植物的根、茎、叶、种籽为原料，原料经晾干后粉碎，过40目筛，收集粉末，用95％工业乙醇浸提48小时以上，原料与95％工业乙醇的重量体积比为1∶2-2.5。浸提液浓缩至浆状后加2％稀盐酸溶解，过滤除渣，除去叶绿素、黄酮类及少量油脂等杂质。滤液用碳酸钠粉末碱化至pH9，碱水液用与水不互溶的有机溶剂萃取，溶剂为氯仿、或苯、或甲苯、或二甲苯、或乙酸乙酯。萃取液水洗，回收有机溶剂，得到总生物碱。将总生物碱分成pH6-7及pH8-9两部分，两部分分别过硅胶柱，硅胶细度为200目，按浓缩抽干后地样品与硅胶之比为1∶30称取硅胶，湿法上柱。氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，90∶10。以150ml为一个馏分收集，并测定各馏分的杀线虫活性，将具有杀线虫活性的馏分再进行硅胶柱层析，即可得到纯化的生物碱单体，测定已纯化生物碱单体的杀线虫活性，从而得到具杀线虫活性的生物碱单体。

    本发明的桥氧粗榧碱(drupacine，C₁₈H₂₁NO₅)作为杀线虫的有效成分，添加到农药用载体或组合物中，应用于防治植物线虫。或用三尖杉属植物的提取物、分离部位或总生物碱添加到农药用载体或组合物中，应用于防治植物线虫。

    本发明具有如下的优点或效果：

    与现有的化学杀线剂相比，三尖杉属植物生物碱具有高效低毒，低残留及对作物的药害更轻的特点。特别适合应用于蔬菜、中草药、花卉及园林植物的线虫病害防治。

                               具体实例

    实例1：三尖杉小枝条4.5kg，晾干粉碎(过40目筛)得到粉末，用6600ml95％工业乙醇浸没粉末，浸提一星期，滤出浸提液，滤渣再用4400ml95％工业乙醇浸提2天，滤出浸提液，滤渣再用4000ml95％工业乙醇浸提3天，滤出浸提液，滤渣再用2000ml95％工业乙醇洗，合并滤液。将滤液浓缩至浆状，加2％稀盐酸750ml并充分搅拌，过滤除渣，除去叶绿素、黄酮类及少量油脂等杂质。滤液加石油醚萃取，1000ml滤液加450ml石油醚，过滤，滤液用碳酸钠碱化至pH9，再用氯仿萃取4次，氯仿液经水洗后加无水硫酸钠除去氯仿液中的水，800ml氯仿液加水200ml，回收氯仿，得到总生物碱20.7g。

    在总生物碱中加2％稀盐酸700ml，滤纸过滤，滤液用饱和碳酸钠碱化，先调至pH6，然后在滤液中加等体积的氯仿萃取。在萃取后剩余的滤液中再加饱和碳酸钠调至pH7，然后在滤液中加等体积的氯仿萃取。将pH6及pH7萃取的氯仿液合并，浓缩去除氯仿，在低压旋转蒸发仪上进一步抽干，得到pH6-7部位棕色粉末10.4g。同样，在萃取后剩余的滤液中再加饱和碳酸钠调至pH8，加等体积的氯仿萃取；在萃取后剩余的滤液中再加饱和碳酸钠调至pH9，加等体积的氯仿萃取，将pH8及pH9萃取的氯仿液合并，浓缩去除氯仿，在低压旋转蒸发仪上进一步抽干，得到pH8-9部位棕色粉末8.8g。

    将分成的pH6-7及pH8-9两部分，分别过硅胶柱，硅胶细度为200目，按样品与硅胶之比为1∶30称取硅胶，开始以氯仿洗柱，以后逐渐加大极性，氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，90∶10。以150ml作为一个样收集，蒸干溶剂，得到一个馏分。将各馏分做薄板层析，合并成分相同的馏分，将得到的各个馏分做杀线虫活性生测，从而得到具有杀线虫活性的生物碱馏分。将生测有活性的馏分进一步过小柱，收集馏分，同时将各馏分做薄层层析，层析显色为单斑的馏分蒸干溶剂，即可得到纯化的生物碱单体，测定已纯化生物碱单体的杀线虫活性，从而得到具杀线虫活性的生物碱单体。测定该生物碱单体的氢谱、碳谱及核磁共振谱，将测得的数据与已知三尖杉生物碱作比较，从而确定该生物碱单体为桥氧粗榧碱drupacine，化学结构式为C₁₈H₂₁NO₅。

    实例2：将上述具杀线虫活性的生物碱，用少量丙酮助溶，加蒸馏水配成供试浓度(如0.1克总碱加蒸馏水至100毫升，浓度即为0.1％)，对松材线虫，采用直径为6cm的培养皿，用PDA培养基接种培养盘多毛孢菌，在25℃恒温培养箱培养5天，菌丝长满平皿。在长满菌丝的培养皿中间放置一小块长1cm，厚约0.5cm的小正方形脱脂棉块。用微量注射器吸取0.5毫升配成供试浓度的生物碱溶液，注入棉块中，再吸取0.1毫升线虫液加入棉块中央，每处理设4次重复，以2％丙酮溶液作对照。在25℃恒温培养箱培养线虫6天。将平皿内的培养基全部倒出，用改良贝曼漏斗法分离收集线虫并计数，对线虫的校正死亡率计算方法如下：

    校正死亡率(％)＝(处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率/1-对照组线虫死亡率)×100

    对松材线虫的毒杀活性见表1。将配成的药液浸泡线虫后，对南方根结线虫及水稻潜根线虫的毒杀活性见表1，表2。

    表1.桥氧粗榧碱(drupacine)及杀线剂益舒宝对线虫的毒力回归方程

    处理     毒力回归方程            LC₅₀(％)     LC₅₀95％置信限      LC₉₅(％)     相关系数

    1        Y＝9.3445+1.6927x       0.00271       0.00266～0.00276     0.02541       0.9986

    2        Y＝11.3746+2.4201x      0.002323      0.00229～0.00235     0.01111       0.9334

    3        Y＝10.8411+2.7583x      0.00763       0.00627～0.00928     0.03011       0.9527

    注：1  桥氧粗榧碱(drupacine)对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的毒力回归方程(5天)

    2  杀线剂10％益舒宝颗粒剂对松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)的毒力回归方程(5天)

    3  桥氧粗榧碱(drupacine)对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)J2的毒力回归方程(54h)

    表2.桥氧粗榧碱(drupacine)对水稻潜根线虫(Hirschmanniella oryzae)的毒力测定(72h)处理             总虫数  死虫数  死亡率(％) 校正死亡率(％)对照             83      12      14.460.1％桥氧粗榧碱  89      81      91.01       89.49

    实例3：将含有杀线虫活性成分的三尖杉小枝条干燥后粉碎成粉末，过40目筛，收集粉末，以2公斤土拌粉末10-15克，然后装盆，再种植非洲菊或其它花卉，可以有效防治土壤中根结线虫的危害，促进植物健康生长。在大田应用时，每亩沟施粉末10公斤，对花生根结线虫病的防治效果可达80％-90％，明显优于目前常用化学杀线剂10％益舒宝颗粒剂的防效(77％)，且对花生的药害更轻。